手足口病病毒分离方法研究

目的 探讨影响手足口病病毒分离培养的可能因素以及方法的改进.方法 取手足口病患儿的粪便、肛拭子或脑脊液、疱疹液、咽拭子,其中以粪便为主,经Hank's平衡缓冲液(HBSS)重悬震荡后,离心取上清液接种于横纹肌肉瘤传代细胞(RD-A细胞),二次传代后通过肠道病毒致细胞病变效应(CPE)分析及EV71、CA16及肠道病毒通用试剂盒进行荧光定量PCR的方法来鉴定病毒分离效果.结果 RD-A细胞能够有效的分离EV71、CA16和其他肠道病毒,采样时间在发病3日内,病毒分离效果达到66.7%,3日以上,病毒分离效果仅有29.1%.未添加万古霉素、阿米卡星和制菌霉素的病毒分离,污染率达到75%,分离效率为13.6%,添加三种抑制细菌和霉菌的抗生素后,污染率达到3.93%,分离效率达到54.9％.结论 采样时间在发病3日内,有效的抑制细菌及霉菌的生长,合理的细胞接种密度可以明显提高病毒的分离培养效率.     

1株肠道病毒71型毒株的分离与鉴定

目的 探讨手足口病病原体肠道病毒71型(EV71)的分离与鉴定方法。方法 采集手足口病疑似病例的咽拭子标本1份接种于人横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcoma cell, RD细胞),通过观察病毒的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)来分析EV71的分离效果。分别利用荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹分析(Western Blotting)方法来鉴定EV71病毒特异性核酸和蛋白。扩增EV71VP1区全长基因,对其序列进行同源性比较及遗传进化分析。结果 手足口病疑似病例咽拭子标本接种RD细胞传代至第2代后出现CPE。RT-PCR和Western Blotting检测结果均显示,感染组RD细胞中有EV71病毒特异性条带,暂命名为EV71分离株2016SHYP001。序列分析结果显示,2016SHYP001株病毒的VP1区核苷酸与C型代表株的同源性较高,为93.1%~98.3%;其中与C4a亚型代表株的同源性最高,为98.3%。进化树分析发现本地流行株与深圳地区流行株的亲缘较近。结论 成功分离出一株新的EV71病毒株2016SHYP001,其株型为C4a亚型。     

昆明市妇幼保健院2014～2018年门急诊手足口病的病原构成变化

  目的  通过对昆明市妇幼保健院手足口病病原构成观察，了解肠道病毒EV71疫苗接种后免疫保护情况；为肠道病毒EV71疫苗接种推广提供临床客观依据。  方法  采集2014年1月至2018年12月间到昆明市妇幼保健院门急诊就诊临床确诊手足口病患儿的粪便标本，进行肠道病毒EV71，柯萨奇病毒A组16型，肠道病毒通用型PCR检测。按照是否接种肠道病毒EV71型灭活疫苗分为观察组和对照组。比较2组EV71及非EV71型病原构成比；同时把是否EV71感染作为因变量，是否接种疫苗，性别和年龄作为自变量进行多因素分析。  结果  观察组和对照组感染肠道病毒EV71构成比分别为0.6%、15%，2组之间存在差异（χ2 = 27.088，P < 0.05）。多因素分析结果显示只有是否接种疫苗为影响因素，接种疫苗为保护因素，接种疫苗者对EV71保护率达96.8%。  结论  昆明市妇幼保健院门急诊手足口病患儿中接种肠道病毒EV71灭活疫苗者感染肠道病毒EV71的构成比低于未接种者，推广疫苗接种对人群预防EV71感染引起的手足口病有很好的效果。     

上海市普陀区2013年手足口病病原学监测结果分析

目的：了解2013年上海市普陀区手足口病的病原学特点,为手足口病的防控提供实验室依据。方法采用实时荧光定量PCR对366例疑似手足口病患者的咽拭子、疱疹液和肛拭子进行肠道病毒通用核酸(EV)、肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)、柯萨奇病毒A组10型(CA10)和柯萨奇病毒A组6型(CA6)基因检测。结果引起手足口病的肠道病毒主要为柯萨奇病毒A组6型(CA6)和肠道病毒71型(EV71),366例手足口病者中肠道病毒通用核酸阳性者273例(74.59%),柯萨奇病毒A组6型(CA6)阳性者169例(46.17%),肠道病毒71型(EV71)阳性者58例(15.85%),柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)阳性者18例(4.92%),柯萨奇病毒A组10型(CA10)阳性者8例(2.19%)。结论2013年上海市普陀区手足口病者的病原学特点以CA6为主,占46.17%;EV71次之,占15.85%。提示上海市普陀区手足口病病原体组成复杂,应深入分析CA6的流行趋势,加强手足口病病原谱监测,为手足口病防治提供实验室依据。     

2009年海南省手足口病样本病原学检测结果分析

目的明确引起海南省2009年手足口病（Hand-foot-mouth disease,HFMD）暴发流行的主要病毒型别,为手足口病病例诊断和制定防控措施提供病原学依据。方法依据卫生部发布的《手足口病预防控制指南》（2009年版）附件1,提取手足口病临床诊断病例各种样本中的病毒核酸,用肠道病毒通用引物、肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CoxA16）特异性引物进行逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和实时荧光-聚合酶链式反应（real-time PCR）。核酸检测阳性的原始样本接种人横纹肌肉瘤细胞（RD细胞）进行肠道病毒分离培养。结果海南省2009年各市县采集的1 085份手足口病样本中EV71、CoxA16和其它肠道病毒核酸阳性率分别为23.13%、1.57%和9.59%,不同类型病例的肠道病毒核酸阳性率分别为死亡病例55.56%（10/18）,重症病例36.07%（145/402）,普通病例32.63%（217/665）。不同类型样本肠道病毒核酸检测阳性率不同,肛拭子和粪便阳性率达到49.62%,疱疹液检测阳性率为43.84%,鼻咽拭子的检测阳性率为22.89%。结论引起海南省2009年手足口病暴发流行的主要病原是EV71,其次为CoxA16。应继续加强手足口病的病原学监测,掌握病毒型别变化趋势,更好地为手足口病防控工作提供技术支持。     

江苏省手足口病病原阳性检出率相关因素及病原学特征

目的:了解江苏省手足口病(Hand-foot-mouth disease,HFMD)肠道病毒阳性检出率相关因素,并对其EV71病毒的VP1基因特征进行分析?方法:在2008年4~12月份,通过监测哨点医院收集全省手足口病病例的咽拭子?粪便或肛拭子?疱疹液?脑脊液?血清标本,并填写病例相关基本信息?结果:共采集手足口病病例的各种类型标本2 082份,咽拭子?肛拭子?疱疹液?粪便?脑脊液?血清的总肠道病毒阳性检出率分别为53.52%?41.12%?40.74%?27.27%?25.00%?9.80%,EV71阳性检出率分别为47.03%?30.84%?33.33%?22.73%?25.00%?2.94%,CoxA16阳性检出率分别为5.34%?8.41%?3.70%?0.00%?0.00%?6.68%,不同类型标本的肠道病毒阳性检出率和阳性检出构成均有差异(P值均< 0.0001)?总肠道病毒阳性检出率在发病后第2天最高(56.59%),不同发病与采样时间间隔的总肠道病毒阳性检出率和EV71病毒阳性检出率均有统计学意义(P值分别为0.0019?0.0139),而与CoxA16阳性检出率没有统计学意义(P = 0.2558)?总肠道病毒阳性检出率在就诊后第2天最高(59.90%),不同就诊与采样时间间隔的总肠道病毒与EV71病毒阳性检出率有统计学差异(P值分别为0.0228?0.0333),与CoxA16阳性检出率没有统计学差异(P = 0.3958)?分离的4株EV71病毒均为C4.3基因亚群?结论:标本类型?采样与发病时间间隔?采样与诊断时间间隔均与手足口病病例的肠道病毒阳性检出率密切相关,分离的EV71毒株为C4亚型?     

2012年武汉地区手足口病肠道病毒分型与临床特征分析

目的:了解武汉地区手足口病肠道病毒分型和临床特征,为手足口病预防及治疗提供依据。方法:采集手足口病患者咽拭子标本,采用实时荧光定量法检测CA16、EV71和通用型肠道病毒,同时搜集手足口病患儿的临床资料,分析不同病毒型手足口病患儿临床特征。结果:2012年1-12月共收集手足口病咽拭子标本3 083例,其中EV71阳性765例,阳性率为24.81%;CA16病毒阳性559份,阳性率为18.13%;EV71和CA16双阳性61例,阳性率为1.99%;通用型肠道病毒阳性1 698例,阳性率55.07%。1-3岁是手足口病高发年龄段,各病毒型均表现为男性多于女性。3 083例手足口病患者,临床上均有手、足、口或臀部皮疹,大部分患者有发热,部分患者伴有神经系统症状。EV71感染者出现发热、神经系统症状及白细胞增多的比例高于CA16和通用型肠道病毒阳性者。通用型肠道病毒阳性患者出现肺部并发症比例多于EV71感染者。结论:武汉市2012年手足口病主要由EV71、CA16及通用型肠道病毒引起,且以通用型肠道病毒为主。了解不同病毒型手足口病临床特征,对于手足口病预防和治疗具有重要意义。     

RT-PCR检测运城市手足口病患儿肠道病毒结果分析

目的：了解本地区手足口病病毒感染情况,为临床医师治疗手足口病提供基础数据。方法选取我院感染性疾病科收治的手足口病患儿86例,用实时荧光定量 PCR （RT-PCR）检测患儿咽拭子肠道病毒通用型（EV）、肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CA16）。结果 EV、EV71、CA16阳性率为分别为44.2%,20.9%,3.5%;男女患儿EV、EV71、CA16阳性率分别为44.4%和43.9%,17.8%和24.4%,2.2%和4.9%;<1岁手足口病患儿,EV、EV71、CA16阳性率分别为46.2%,7.7%,0%;1岁~2岁患儿,EV、EV71、CA16阳性率分别为37.2%,20.9%,2.3%;≥2岁患儿,EV、EV71、CA16阳性率分别为53.3%,26.7%,6.7%。结论运城市手足口病病原以EV71型为主,女患儿EV71感染阳性率高于男患儿,≥2岁患儿病毒检出阳性率最高。     

乌鲁木齐市手足口病病毒分离技术的研究

目的探索乌鲁木齐市手足口病病毒分离培养的最适细胞系和最优培养条件,为手足口病的防治提供技术支持。方法采集适当的临床标本,对标本进行核酸提取和鉴定,根据不同的手足口病病毒分离方法,随机选取相应的阳性标本接种于横纹肌肉瘤传代细胞(RD),观察结细胞病变效应(CPE),有4+病变的培养液进行RT-PCR鉴定其效果。结果 2013-2015年共检测手足口病病例标本2 267份,肠道病毒总阳性率为79.31%,在病原体进行病毒分离时最佳细胞系是RD细胞,最优培养温度条件是35℃,血清浓度为2%,接种量为300μl,接种方式为直接接种,样本采集以粪便标本最佳。结论合理的细胞系和培养条件可以明显提高病毒的分离培养效率。     

湘潭市手足口病病原学实验室检测分析

目的:根据手足口病病原学检测结果分析该病流行特征,同时评估从不同部位采集样品的阳性检出率,为手足口病的防控提供科学依据。方法:临床诊断为手足口病例的咽拭子标本,疱疹液标本,粪便标本,采用实时荧光(定量)PCR进行检测,对总肠道病毒阳性的标本,进行EV71和CA16分型,检测结果分组统计分析。结果:在652份监测病例样品中,总肠道病毒阳性样品446份,其中EV71阳性199份,占44.52%;CA16阳性176份,占39.37%;其它型肠道病毒阳性71份,占15.97%。在103份重症病例样品中,总肠道病毒阳性91份,其中EV71阳性77份,占84.62%,CA16阳性3份,占3.29%,其它型肠道病毒阳性10份,占10.10%。结论:湘潭市手足口病流行病原以EV71型和CA16型交替流行;重症病例主要由EV71引起;疱疹液,粪便标本的阳性检出率高于咽拭子。     

惠州地区2010年手足口病实验室检测分析

目的了解惠州市手足口病例肠道病毒的感染情况,为制定预防和控制肠道病毒感染策略提供依据。方法采集2010年5月至12月惠州市中心人民医院、惠州市第一人民医院等全市各大医院的998例疑似手足口病患者的疱疹液、脑脊液、咽拭子、粪便等标本,采用实时荧光RT-PCR技术检测样本中的肠道病毒（EV）、肠道病毒71型（EV71）、柯萨奇病毒A组16型（CA16）。结果在检测的682份EV阳性标本中,EV71阳性率偏高,为总数的48.9%,而CA16阳性率较低,为总数的5.71%;在998例疑似手足口病患者中,男性患者居多,占62.12%,女性患者相对较少,占37.88%;0～4岁的儿童是手足口病的高发人群,占所有患者的92.99%;5～7月的夏季为手足口病感染的高峰期,其阳性率占98.9%。结论惠州市2010年5月～12月手足口病的病原体以肠道病毒71型为主,0～4岁的男性儿童是感染肠道病毒的高危人群,5～7月的夏季较为高发。     

一步法RT-PCR检测手足口病EV71、CA16病毒核酸

目的检测手足口病病原核酸,了解濮阳市手足口病病因和不同标本检测状况。方法对濮阳市辖区内手足口病43例住院患者的咽拭子、疱疹液和血清样本进行一步法RT-PCR检测。结果 43例患者的72份标本中,病原核酸EV71阳性23份,阳性率为31.94%。其中,咽拭子阳性率为39.53%(17/43),疱疹液阳性率为66.67%(6/9),血清阳性率为0%(0/20),CoxA16未检出。结论濮阳市手足口病流行由肠道病毒EV71引起,不同标本中疱疹液和咽拭子病毒含量多。     

2012年保定市手足口病病原学特征分析

目的通过对手足口病病例进行病原检测,研究保定市手足口病病原分布情况,为手足口病预防控制提供依据。方法采用荧光RT-PCR法对收集的手足口病病例咽拭子标本进行特异性核酸检测。结果保定市手足口病病原体有肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV 71）、柯萨奇病毒A组16型（Coxakivirus A16,Co A16）及其他肠道病毒（other enteroviruses,EV）。发病以4岁以下儿童为主。全年均有病例分布,以5-8月为高峰。样品采集时间以3 d内为好,病毒检出率高。结论引起手足口病的病原以EV7 1病毒、Co A16病毒为主,手足口病防控应以4岁以下儿童为主,在5-8月加强监测和预防控制工作。     

儿童手足口病36例临床分析

目的 探讨儿童手足口病(HFMD)的病因及治疗方法。方法 对36例确诊为HFMD患儿的粪便进行肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16(CA16)检测,并对患儿临床表现、实验室检查和治疗进行分析。结果1。粪便检测:EV71RNA(+)19例(52。77％),CA16RNA(+)13例(36。11％),2种病毒均阴...     

梅州市2010-2011年手足口病病原学流行特征分析

目的 了解梅州市手足口病病原学流行情况,为手足口病控制和治疗提供科学依据.方法 对2010-2011年梅州市手足口病哨点病原学监测医院的手足口病病例采集粪便标本,提取标本中的核酸,采用实时荧光定量PCR方法扩增病毒的特异性片段,检测总肠道病毒、EV71和CoxA16核酸.结果 255份手足口病临床诊断病例的粪便标本中,总肠道病毒、EV71和CoxA 16病毒核酸检出率分别为72.55％、40.39％和11.37％,其中EV71和CoxA16核酸检出率差异有统计学意义(x2=55.97,P＜0.01).发病以5-7月高发,占48.65％,有较明显的季节性分布.男性总肠道病毒核酸检出率高于女性(x2=10.24,P＜0.01),但不同性别间的EV71和CoxA16病毒核酸检出率差异均无统计学意义(x2=0.01、0.69,均P＞0.05).结论 EV71是梅州市2010-2011年手足口病的主要病原体.今后应加强手足口病流行特征和病原谱的动态研究,以进一步掌握手足口病流行规律.     

1073例儿童手足口病病原学检测结果及临床特征分析

目的 了解手足口病(HFMD)儿童病例中肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CA16)的感染状况及重症HFMD病例的临床特征和实验室检查结果.方法 采集HFMD患儿咽拭子标本,检测EV71和CA16感染情况,分析患儿性别、年龄分布情况并对重症患儿的临床特征和实验室检查结果进行回顾性分析.结果 1073例H...     

北京市顺义区2010-2012年手足口病病原学监测分析

目的通过对临床诊断为手足口病患者进行病原学检测,为手足口病的诊断提供病原学依据。方法采集监测医院临床诊断为手足口病的咽拭子标本,应用RT-PCR方法检测原始样本和分离阳性病毒株中EV、EV71和CoxAl6病毒的核酸。结果咽拭子标本共173份,共分离出病毒120例,阳性率为69．4％;其中EV71阳性39例,CoxAl6阳性72例,EV阳性、EV71和CoxAl6阴性9例。结论顺义区手足口病以CoxAl6病毒感染为主,CoxAl6感染病例占阳性病例数的60．0％。阳性病例中散居儿童与托幼儿童占90．8％。医疗机构应开展手足口病的病原学检测,为临床诊断手足口病提供实验室依据,减少误诊和漏诊的发生。     

2010年云浮市手足口病病原学监测结果分析

目的对2010年云浮市哨点医院手足口病（HFMD）监测结果进行分析,了解云浮市手足口病的病原学特征,为云浮市手足口病的防治提供科学的依据。方法收集73例监测哨点医院手足口病病例送检的粪便标本,应用Real time—PCR技术检测肠道病毒7l型（EV71）、柯萨奇病毒A组16型（CAl6）、非EV7l和CAl6的其它肠道病毒核酸。结果 73例手足口病患者中42例为肠道病毒核酸阳性,阳性率为57.5%,其中EV71病毒、CAl6病毒以及非EV7l和CAl6的其它肠道病毒分别占总阳性数的71.4%、7.1%、21.4%。三种不同型别肠道病毒在全年中交替变更;病毒检出高峰出现在5～6月,病例人群男性高于女性（1.92：1）,4岁以下儿童病例阳性率最高。结论云浮市2010年手足口病疫情发病高峰为5-6月,4岁以下儿童病例发病数最多,肠道病毒EV71型是2010年云浮市手足口病流行的主要毒株类型。开展手足口病流行病学和病原学研究,将有助于提出更好的预防和控制措施。     

肠道病毒71型特异性单克隆抗体的制备及其在病毒鉴定中的应用

目的：建立肠道病毒71型（ EV71）特异性检测的免疫荧光方法用于病毒分离培养后的EV71鉴定,为EV71生物学特征研究和疫苗株的筛选奠定基础。方法：以EV71 VP1为免疫原制备单克隆抗体,用经测序鉴定的肠道病毒毒株建立EV71特异性免疫荧光方法;将不同地区收集的手足口病患儿的临床标本进行病毒分离,利用EV71特异性单抗进行分离培养后的病毒鉴定。结果：制备获得2株单抗,经鉴定其中1株3 E12为EV71特异性单抗;以此单抗建立的免疫荧光方法对EV71感染细胞呈阳性反应,而与柯萨基病毒A16和埃可病毒6等非EV71肠道病毒不反应。从104份手足口病临床标本中共分离到35株病毒,产生肠道病毒典型的细胞病变;用3E12特异性单抗免疫荧光鉴定分离病毒,其中29株为EV71,与RT-PCR验证结果完全一致。结论：成功制备获得EV71特异性单克隆抗体,以此单抗建立的EV71特异性免疫荧光方法敏感性高、特异性强,可用于分离培养EV71的鉴定。