结核分枝杆菌DNA三价苗的细胞与体液应答研究

本文构建了含分枝杆菌抗原Ag85B(30kDa) ,MPT - 83(2 6kDa)和ESAT - 6 (6kDa)分泌蛋白的真核表达载体pJW 4 30 3,酶切鉴定和序列分析 ,确定含有正确的读码框。重组表达质粒导入COS7细胞内并瞬时表达 ,证明上述三种重组质粒能在COS7细胞中表达出特异蛋白。三种重组表达质粒同时肌注免疫小鼠 ,首免 ,二免和三免小鼠后 2 1dAg85B抗体平均滴度分别为 1∶32 0 0 ,1∶5 12 0 0和 1∶10 2 4 0 0 ,MPT - 83抗体平均滴度二次免疫和三次免疫后 2 1d测得为 1∶2 5和 1∶5 0 ,三次免疫后均未检测到ESAT - 6特异性抗体。在三免后 2 1dAg85B和MPT - 83的特异性细胞因子γ -干扰素的浓度分别 2 75 pg/ml±16 5 ,2 2 0 pg/ml± 19 8;而ESAT - 6的γ -干扰素浓度为 2 2 0 pg/ml± 9 9。本研究表明 ,多价核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞免疫应答和体液免疫应答 ,可能有利于增强疫苗对抗结核病的抗性。     

结核杆菌Ag85B基因疫苗与结核杆菌Ag85B和细胞因子GM-CSF共表达基因疫苗在小鼠体内的免疫效应比较

目的比较结核杆菌Ag85B基因疫苗与结核杆菌Ag85B和细胞因子GM-CSF共表达基因疫苗在小鼠体内的免疫效应,为研制高效结核杆菌基因疫苗奠定基础。方法将雌性C57BL/6健康小鼠54只,随机分为3组,即结核杆菌Ag85B和细胞因子GM-CSF共表达基因疫苗(pIRES-Ag85B/GM-CSF)组、结核杆菌Ag85B基因疫苗(pIRES-Ag85B)组和空载体(pIRES)组,分别小鼠肌内注射疫苗,检测小鼠体内特异性体液免疫和细胞免疫应答相关指标,同时另取C57BL/6小鼠,随机分成4组,第1、2、3组免疫方法与上述各组免疫方法相对应,第4组每只小鼠背部皮下注射1×106CFU卡介苗(BCG),作为阳性对照,进行动物免疫保护性实验,比较分析两种基因疫苗在小鼠体内的免疫效应。结果结核杆菌Ag85B和细胞因子GM-CSF共表达基因疫苗在小鼠体内的免疫原性和免疫保护性明显强于结核杆菌Ag85B基因疫苗。结论结核杆菌Ag85B和细胞因子GM-CSF共表达基因疫苗能增强结核病基因疫苗的免疫原性和免疫保护性。     

结核杆菌Ag85A DNA疫苗在小鼠体内的免疫效应比较

目的探索增强结核杆菌DNA疫苗有效性的新方法，为研制并开发新一代高效结核杆菌DNA疫苗奠定基础。方法分别构建结核杆菌Ag85A抗原基因真核表达质粒及其与小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的真核嵌合表达质粒，体外转染COS7细胞检测两种重组质粒的表达活性后，将其分别用作DNA疫苗给BALB／c小鼠肌内注射，检测小鼠体内特异性体液免疫和细胞免疫应答相关指标，同时进行动物免疫保护性实验，比较分析两种DNA疫苗在小鼠体内的免疫效应。结果结核杆菌Ag85A抗原蛋白基因与小鼠粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子的嵌合DNA疫苗在小鼠体内的免疫原性明显强于Ag85A抗原基因非嵌合DNA疫苗，但两种DNA疫苗的免疫保护性无明显差异。结论粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与结核杆菌免疫保护性抗原基因嵌合DNA疫苗能显著增强结核病DNA疫苗的免疫原性。     

结核分支杆菌Ag85B DNA疫苗的构建及其免疫作用的研究

目的 研究pcDNA3-Ag85B质粒DNA疫苗的免疫原性及其诱生细胞免疫应答的作用。方法 将结核分支杆菌Ag85B基因插入载体pcDNA3中,制备pcDNA3-Ag85B DNA疫苗。分别以生理盐水、pcDNA3及pcDNA3-Ag85B免疫BALB／c小鼠,检测小鼠抗Ag85B抗体水平（ELISA）和体外循异抗原刺激诱导的免疫小鼠脾细胞IL－2、IL－4、IL－10、IFN－γ表达水平。结果 pcDNA3-Ag85B诱生的抗Ag85B效介明显高于生理盐水组和pcDNA3组;pcDNA3-Ag85B免疫小鼠脾细胞在Ag85B抗原刺激下,IL－2和IFN－γ mRNA转录水平明显高于对照组,而IL－4和IL－10 mRNA转录水平在3组中无明显变化。结论 pcDNA3-Ag85B质粒DNA疫苗不仅能增强体液免疫,亦可诱导Th1型细胞免疫。     

ag85a-卡介苗重组疫苗的构建、免疫原性及抗结核作用的初步研究

目的构建结核分枝杆菌ag85a-卡介苗重组疫苗,研究其免疫原性及抗结核作用,以期获得结核病预防性或治疗性疫苗。方法通过基因工程重组技术将结核分枝杆菌保护性抗原Ag85A的编码基因与穿梭质粒载体pYUB295重组,采用电穿孔技术导入卡介苗中,应用PCR扩增、PAGE电泳鉴定重组卡介苗。通过ELISA法检测其免疫小鼠血清中特异性抗体,用MTS法分析其脾淋巴细胞增殖指数。通过观察ag85a-卡介苗重组疫苗对结核分枝杆菌感染实验动物半数死亡时间、一定时间内的死亡率、大体病变、T细胞及B细胞免疫功能等指标评价ag85a-卡介苗重组疫苗对结核分枝杆菌感染的预防效果。结果PCR扩增、限制性内切酶酶切、DNA测序鉴定、PAGE电泳表明成功地构建了ag85a基因pYUB295重组质粒,Ag85A蛋白在卡介苗中分泌表达。重组卡介苗免疫原性试验表明：ag85a-卡介苗重组疫苗免疫组小鼠有Ag85A特异性抗体产生,45天时达到最高水平。脾淋巴细胞增殖试验表明刺激指数均达2．0以上,ag85a-卡介苗重组疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞的刺激指数与对照组无明显区别。预防试验表明：ag85a-卡介苗重组疫苗组、卡介苗组与生理盐水对照组比都能延长结核分枝杆菌感染小鼠的半数死亡时间,降低2个月内的死亡率。结核分支杆菌攻击后2个月,处死小鼠时,小鼠脏器大体病变、脏器培养、抗体检测结果及淋巴细胞增殖实验表明：各组间无显著差别。结论正确构建了ag85a-卡介苗重组疫苗,ag85a-卡介苗重组疫苗与卡介苗对结核分枝杆菌感染的预防作用基本相同。     

幽门螺杆菌靶向核酸疫苗的构建及免疫学评价

目的:为了提高幽门螺杆菌DNA疫苗的免疫原性,构建具有靶向作用于APC细胞的核酸疫苗.方法:利用基因工程技术,将靶向基因片段和过氧化氢酶基因融合构建了核酸疫苗.体外转染293T细胞,间接免疫荧光和ELISA检测其基因表达情况.用该核酸疫苗肌肉免疫注射BALB/c小鼠后,测定其血清IgG、IgG1和IgG2a水平.结果:间接免疫荧光检测转染DNA疫苗的293T细胞,表明该疫苗能在真核细胞中表达目的抗原,通过ELISA方法测定表明其仍具有IgG抗体结合能力.BALB/c小鼠免疫后血清测定结果表明,该靶向核酸疫苗诱导的抗体水平高于对照质粒pDNAkat,抗体分型实验显示靶向核酸疫苗pcDNAkathIgz和pcDNAkat,促进了免疫反应类型由Th2向Th1的部分偏转.结论:成功构建了靶向APC细胞的幽门螺杆菌核酸疫苗,并在小鼠体内诱导了较高的抗体水平.     

ag85b-卡介苗重组疫苗免疫原性研究

目的研究ag85b-卡介苗重组疫苗的免疫原性。方法以生理盐水、卡介苗、ag85b-卡介苗重组疫苗免疫小鼠,采用ELISA法检测小鼠血清中特异性抗体,MTS法分析小鼠脾淋巴细胞增殖指数。结果ag85b-卡介苗重组疫苗组小鼠体重变化与对照组相比,无显著性差异。应用不同抗原检测各组小鼠不同时间采集的血清,ag85b-卡介苗重组疫苗组、卡介苗组均有抗Ag85B特异性抗体产生,ag85b-卡介苗重组疫苗组抗Ag85B特异性抗体水平高于卡介苗组;卡介苗、ag85b-卡介苗重组疫苗免疫后15d,抗体水平已有升高,45d达到最高水平。用不同抗原刺激实验组及对照组小鼠脾淋巴细胞,平均刺激指数均达2.0以上。结论结核分枝杆菌ag85b基因在卡介苗中能够表达特异的蛋白,刺激小鼠产生特异性抗体。     

核酸疫苗在感染性疾病预防和治疗中的应用

核酸疫苗又称ＤＮＡ疫苗或基因疫苗 ,是最近几年从基因治疗研究领域发展起来的一种全新疫苗 ,其出现被誉为第三次疫苗革命。核酸疫苗的本质是指能在哺乳动物细胞内表达重组蛋白抗原的质粒ＤＮＡ ,通过肌肉注射等途径接种动物或人体后 ,其携带的外源基因能在宿主细胞表达目的蛋白并诱导免疫应答。1992年以来 ,应用这一技术已成功地在小鼠、鸡、牛、黑猩猩等多种动物和人体诱生抗病毒、细菌、原虫和肿瘤免疫应答。核酸疫苗在实验动物的免疫效力及其性质稳定、成本低廉等特点使其成为今后疫苗发展的显而易见的选择。有些核酸疫苗不仅能高效诱导…     

携带结核杆菌Ag85B靶细胞的构建、鉴定及应用

目的构建表达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的靶细胞以便评定结核疫苗的特异性细胞毒(CTL)作用。方法将携带有Ag85B基因的重组质粒pTB30s转入小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0),用RT-PCR及免疫组化染色法鉴定阳性克隆细胞胞内的Ag85B基因转录和蛋白表达水平;同时,用接种过BCG,pTB30s或生理盐水(NS)小鼠脾脏单个核细胞作为效应细胞,G418高压筛选的阳性克隆细胞为靶细胞,用MTT法检测各组CTL杀伤活性。结果RT-PCR以及免疫组化结果显示,阳性细胞能稳定表达Ag85B。CTL杀伤实验:BCG、pTB30s及NS对照组杀伤率分别为28.14%、45.18%和5.13%。结论含有Ag85B靶细胞构建成功及应用,为研究结核疫苗的免疫效果提供了较好的研究手段。     

乙型及丙型肝炎DNA疫苗联合重复接种小鼠的免疫应答

目的 :观察由编码 HBs Ag与 HCV- CE2 抗原的两种重组真核细胞表达质粒制备的 DNA疫苗重复联合接种 BAL B/c小鼠后 ,其诱生的特异性免疫应答反应。方法 :应用上述两种 NDA疫苗重复联合免疫小鼠 ,动态观察血中特异性抗体水平、特异性细胞毒性 T淋巴细胞 (CTL )体外杀伤活性 ,并进行 CTL杀伤活性活体诱生实验。结果 :两种 DNA疫苗联合重复免疫小鼠 ,能够诱生机体特异性体液免疫及细胞免疫完全应答。其小鼠荷瘤表达目的抗原的靶细胞后 ,生存率明显高于未免疫鼠 (P <0 .0 5 )。结论 :乙型及丙型肝炎联合 DNA疫苗的重复接种 ,可有效地诱生小鼠机体特异性免疫应答反应。 DNA疫苗诱生的 CTL应答可与体液免疫应答分离存在 ,可能是 DNA疫苗免疫保护的更重要方面。     

结核分支杆菌Ag85 B分泌蛋白基因疫苗的构建和免疫原性的研究

目的：构建编码结核分支杆菌（MTB）Ag85B分泌蛋白的重组真核表达质粒,并研究其免疫原性。方法：采用聚合酶链反应（PCR）方法从结构分支杆菌H37Ra基因组DNA中扩增出Ag85B分泌蛋白基因,用HindⅢ和EcoRⅠ消化后,与同样酶消化的pcDNA3连接,转化大肠杆菌JM109,阳性克隆用酶切鉴定;重组表达质粒肌注免疫小鼠4周后,分别用dot blotting和ELISA方法检测抗体的产生和滴度,结果：酶切监定重组表达质粒pTB30s构建成功,dot blotting检测免疫小鼠血清抗Ag85B特异性抗体阳性,ELISA检测抗体几何平均滴度为1：120。结论：应进一步研究pTB30s刺激机体的细胞免疫应答,以用于结核病（TB）的防治研究。     

结核分枝杆菌Ag85B与ESAT6融合蛋白的表达、纯化及抗原活性的初步研究

目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与ESAT6在大肠杆菌中融合表达,并对其进行纯化、鉴定和免疫学特性的初步研究。方法采用PCR方法从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增Ag85B和ESAT6基因,并在两基因中引入48bp的柔性linker结构,以确保两蛋白的正确折叠。将各目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序。将测序正确的目的基因片段双酶切后亚克隆至原核表达载体pPro-EXHTa,得到重组质粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6,并转化入大肠杆菌DH5α。经IPTG诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B和抗ESAT6的mAb进行Western blot分析鉴定。通过镍柱对融合蛋白进行纯化。在PBS中通过透析恢复重组蛋白的天然结构,将复性融合蛋白与8例临床可疑结核病人血清进行ELISA测定。结果PCR法扩增获得的各目的基因片段与GenBank报道的一致。构建的融合蛋白原核表达载体在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE分析显示重组质粒在原核系统中得到了表达。融合蛋白能够分别与抗Ag85B和抗ESAT6的mAb反应。该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析纯化后得到了高纯度的Ag85B-ESAT6融合蛋白,并能够与结核病人血清发生反应。结论结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-ESAT6在大肠杆菌中得到了高效表达,为进一步研究其免疫原性和保护性提供了基础。     

Ag85B与MPT64 DNA疫苗联合免疫对鼠结核分枝杆菌感染的保护作用

目的　研究Ag85B与MPT6 4DNA疫苗联合免疫对鼠结核分枝杆菌感染的免疫保护效果。方法　C5 7BL/ 6小鼠 5 4只 ,采用随机数字表法随机分为 6组 ,分别用磷酸盐缓冲液 (PBS)、pcDNA3 1( )、卡介苗 (BCG)、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT6 4、pcDNA/Ag85B pcDNA/MPT6 4经肌肉注射法免疫小鼠 ,0、3、6周各 1次 ,即PBS组、pcDNA3 1组、BCG组、pcDNA/Ag85B组、pcDNA/MPT6 4组及pcDNA/Ag85B pcDNA/MPT6 4组。BCG组只在 0周予皮内注射卡介苗 1次。末次免疫后第 5周用 1×10 6CFU的H3 7Rv经尾静脉实施攻击 ,攻击后 6周处死部分小鼠 ,用酶联免疫吸附测定 (ELISA)法检测血清总IgG、纯化蛋白衍生物 (PPD)特异性脾淋巴细胞干扰素γ(IFN γ)和白细胞介素 4 (IL 4 )分泌水平 ,四甲基偶氮唑盐 (MTT)法测定特异性脾淋巴细胞增殖 ;作脾、肺组织荷菌量和病理学检查 ,并观察小鼠存活时间。结果　PBS组肺和脾器官荷菌量分别为lg-1(7 85 4± 0 0 0 3)CFU/g和lg-1(7 190±0 0 16 )CFU/g、pcDNA3.1组分别为lg-1(7 70 0± 0 0 16 )CFU/g和lg-1(7 0 72± 0 0 6 8)CFU/g、BCG组分别为lg-1(6 4 4 9± 0 0 0 2 )CFU/g和lg-1(5 4 36± 0 0 4 2 )CFU/g、pcDNA/Ag85B组分别为lg-1(7 370± 0 0 0 2 )CFU/g和lg-1(6 4 2 96± 0 0 0 9)C     

结核分枝杆菌Ag85B基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增结核杆菌Ag85B基因,构建大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-Ag85B,并重组耻垢分枝杆菌(Mycobacteriums megmatis mc2155)。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增结核杆菌Ag85B基因,克隆入pGEMT载体;构建亚克隆ps3000-Ag85B大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒,电转化方法将有Ag85B基因的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌中。热诱导此重组耻垢分枝杆菌,用SDS-PAGE电泳观察Ag85B蛋白的表达,Western blot鉴定其生物学活性。结果PCR扩增结核杆菌Ag85B基因片段大小为990bp,构建的穿梭质粒ps3000-Ag85B酶切片段为990bp,与理论值相符。经Western blot检测,该重组耻垢杆菌表达蛋白能被结核病患者血清识别。结论Ag85B重组耻垢分枝杆菌构建成功,为下一步表达Ag85B蛋白的重组BCG(Bacilli Calmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。     

结核杆菌Ag85A及ESAT-6双价抗原融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的　为结核病新型疫苗研究提供靶基因和靶抗原。方法　采用PCR扩增的方法获得结核杆菌两种免疫保护性抗原Ag85A及ESAT - 6的基因 ,将其定向克隆入真核及原核穿梭表达型载体 pBK -CMV构建含嵌合目的基因的重组质粒 ,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达 ,并通过SDS -PAGE和Western -blotting对表达蛋白进行初步分析。结果　 1)从结核杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Ag85A及ESAT - 6基因。 2 )成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达质粒 pBK - 85A -E6。 3)重组质粒 pBK - 85A -E6经IPTG诱导后能在大肠杆菌中稳定表达 38kDa的融合蛋白。 结论　成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达载体 ,并在大肠杆菌中实现了稳定表达 ,为进一步研究其在结核病基因工程疫苗研制中的应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌抗原融合蛋白Ag85B-ESAT6和Rv2031c-Rv2626c重组腺病毒的构建及鉴定

目的 构建表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白Ag85B-ESAT6(AE)和Rv2031c-Rv2626c(R2)的重组腺病毒,为其用于结核病新型疫苗的研究奠定基础.方法 体外合成人延长因子1α(EF1α)启动子DNA序列,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建含有CMV、EF1α双启动子的腺病毒穿...     

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-ESAT6的融合表达及纯化

目的　融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B ESAT6 ,为结核病的预防提供有效亚单位疫苗。方法　设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物 ,采用聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)的方法从结核分枝杆菌毒株H3 7Rv DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段 ,将片段分别与PGEM T easy载体连接测序。将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入PPROEXHT表达载体 ,挑选出阳性克隆 ,将诱导的表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析 ,同时与含6个组氨酸 (histidine 6×his)的单克隆抗体 (monoclonalantibody ,mAb)进行固定化蛋白质免疫学测定(Western blot) ,将用含Ni 鳌合剂的Ni NTA亲合柱纯化的表达产物免疫小鼠 ,用结核分枝杆菌培养上清滤液蛋白 (culturefiltrateproteins ,CFP)作为抗原 ,酶联免疫吸附试验 (enzyme linkedimmunosorbentassay ,ELISA)测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。结果　PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与基因文库 (GenBank)报道的完全一致。两者在大肠杆菌DH5α株中融合表达的产物约为 370 0 0 ,与预计大小相吻合。Western blot结果显示 ,在相对分子量约 370 0 0处有表达产物与 6×hismAb特异性结合带。表达产物为包涵体 ,通过Ni NTA纯化系统 ,可得到纯化的目的蛋白。Ag8     

结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗抗结核作用的研究

结核病是由Mtb引起的一种呼吸道传染病,全球结核病疫情仍然十分严峻,而卡介苗预防结核病的效果并不理想,研究新型结核病疫苗已成为国内外结核病研究的热点之一。将本课题组自1998年至今研究Mtb Ag85A DNA疫苗的免疫原性、治疗效果进行综合与概述,结果表明Mtb Ag85A DNA疫苗可诱导小鼠体液免疫和Th1型细胞免疫应答,可减少小鼠组织中的Mtb尤其是耐多药Mtb的数目,该疫苗与常规化疗联合不仅可提高机体免疫力,并可有效地杀灭或抑制Mtb,从而提高化疗效果。