氯甲基苯甲酰胺标记大鼠肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞的可行性

背景:氯甲基苯甲酰胺被认为是目前较为稳定的细胞荧光标记物质。目的:观察荧光染料氯甲基苯甲酰胺标记肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞的标记效果及其对细胞形态、生长及增殖能力等生物学特性的影响。方法:采用胶原酶消化法分离、培养SD大鼠肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞,以氯甲基苯甲酰胺细胞标记液标记第3代肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞。结果与结论:荧光显微镜下观察氯甲基苯甲酰胺标记的肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞呈红色荧光,细胞标记率达95%以上,标记前后细胞形态、生长及增殖等方面无明显变化。经多次传代培养后,红色荧光细胞数量及强度有所下降,但细胞传代至第8代,氯甲基苯甲酰胺标记后的第15天细胞标记率仍可达50%以上。表明氯甲基苯甲酰胺可有效标记肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞,且方法简单,标记率高,对细胞无毒性,不影响细胞生物学特性。     

荧光活性染料DiI标记人脂肪干细胞

目的:观察荧光活性染料DiI标记的人脂肪干细胞生长增殖情况,为脂肪干细胞研究寻找理想的细胞标记方法。方法:实验于2006-06/09在广州市创伤外科研究所完成。取人吸脂术中吸出的脂质部分,知情同意并签署知情同意书,用PBS缓冲液反复冲洗,剪刀剪碎。0.1%胶原酶37℃消化40min,使用等量体积含体积分数为0.1胎牛血清 DMEM 双抗完全培养基中和后,1300r/min离心5min,去上清液,沉淀混悬后150UM尼龙网过滤,按1×104～2×104接种于25cm2培养瓶中,置入37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中培养,2～3d换液。待细胞生长融合达80%即可传代,取第3～4代细胞供实验用。将收集细胞用PBS清洗离心2次,加入无血清DMEM制成细胞悬液,以1×109L-1密度加入5μLDiI应用液,37℃下孵育20min,1500r/min离心5min,PBS清洗离心2次,加入含体积分数为0.1胎牛血清DMEM培养基,应用荧光显微镜观察24,48,72h脂肪干细胞显色情况及形态变化。检测脂肪干细胞上清液乳酸脱氢酶含量及细胞XTT比色值,分析脂肪干细胞受损及增殖情况。结果:①DiI标记脂肪干细胞体外观察:台盼蓝染色见脂肪干细胞活力好,仅偶见蓝染细胞,荧光显微镜下观察,见全部细胞标记后均显红色荧光,标记的脂肪干细胞呈梭形,胞浆丰富,保持了良好的正常形态,DiI标记阳性率为100%。DiI标记后早期细胞形态呈荧光环状,48h后细胞中荧光颗粒增多,荧光增强,细胞核未染荧光。②培养脂肪干细胞上清液中乳酸脱氢酶含量及XTT法检测脂肪干细胞受损及增殖情况:未标记DiI的脂肪干细胞与标记DiI的脂肪干细胞形态、细胞上清液乳酸脱氢酶含量及XTT值差异不明显(P>0.05)。结论:①DiI能有效标记体外脂肪干细胞,并在细胞内稳定表达。②DiI标记的脂肪干细胞形态良好,对活体细胞无毒性。     

荧光活性染料Dil标记人脂肪干细胞

目的观察荧光活性染料Dil标记的人脂肪干细胞生长增殖情况,为脂肪干细胞研究寻找理想的细胞标记方法.方法实验于2006-06/09在广州市创伤外科研究所完成.取人吸脂术中吸出的脂质部分,知情同意并签署知情同意书,用PBS缓冲液反复冲洗,剪刀剪碎.0.1%胶原酶37℃消化40min,使用等量体积含体积分数为0.1胎牛血清+DMEM+双抗完全培养基中和后,1 300 r/min离心5 min,去上清液,沉淀混悬后150 UM尼龙网过滤,按1×104-2×104接种于25 cm2培养瓶中,置入37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中培养,2～3 d换液.待细胞生长融合达80%即可传代,取第3～4代细胞供实验用.将收集细胞用PBS清洗离心2次,加入无血清DMEM制成细胞悬液,以1×109 L-1密度加入5μL Dil应用液,37 ℃下孵育20 min,1 500 r/min离心5 min,PBS清洗离心2次,加入含体积分数为0.1胎牛血清DMEM培养基,应用荧光显微镜观察24,48,72 h脂肪干细胞显色情况及形态变化.检测脂肪干细胞上清液乳酸脱氢酶含量及细胞XTT比色值,分析脂肪干细胞受损及增殖情况.结果①Dil标记脂肪干细胞体外观察台盼蓝染色见脂肪干细胞活力好,仅偶见蓝染细胞,荧光显微镜下观察,见全部细胞标记后均显红色荧光,标记的脂肪干细胞呈梭形,胞浆丰富,保持了良好的正常形态,Dil标记阳性率为100%.Dil标记后早期细胞形态呈荧光环状,48 h后细胞中荧光颗粒增多,荧光增强,细胞核未染荧光.②培养脂肪干细胞上清液中乳酸脱氢酶含量及XTT法检测脂肪干细胞受损及增殖情况未标记Dil的脂肪干细胞与标记Dil的脂肪干细胞形态、细胞上清液乳酸脱氢酶含量及XTT值差异不明显(P＞0.05).结论①Dil能有效标记体外脂肪干细胞,并在细胞内稳定表达.②Dil标记的脂肪干细胞形态良好,对活体细胞无毒性.     

CM-DiI标记大鼠骨髓间充质干细胞的体外体内的示踪观察

目的建立骨髓间充质干细胞（BMSCs）的一个简单、有效的标记和示踪方法并对BMSCs移植治疗心肌梗死作初步观察,为进一步的研究提供依据。方法应用CM—DiI细胞标记液标记第三代大鼠BMSCs,应用荧光显微镜对标记的细胞进行体外示踪观察;8只SD大鼠,制作急性心肌梗死模型,将已标记CM—DiI的BMSCs经心肌注射途径移植给急性心肌梗死模型大鼠,在移植后1周、2周、3周、4周分别取心肌组织行冰冻切片,并在荧光显微镜下观察移植细胞;于移植后4周应用免疫组织化学法检测移植细胞心肌缝隙连接蛋白43（connexin 43）的表达。结果CM-DiI标记大鼠BMSCs效率达100％,标记后BMSCs生长和增殖特性未受影响,形态无改变,经过传代培养14d仍然保持较清晰的红色荧光。已标记细胞在大鼠心梗模型心肌内移植后1周、2周、3周、4周,心肌组织冰冻切片可找到移植细胞,CM—DiI与BMSCs结合稳定,荧光标记效果维持一个月无明显衰退,免疫组化切片显示移植细胞少量表达connexin43。结论CM—DiI细胞标记液标记BMSCs,对细胞生长特性无影响,操作简单,标记效果好,BMSCs移植到梗死心肌4周后仍存活,并少量表达心肌特异性蛋白connexin43。CM—DiI标记细胞法可用于进一步的BMSCs移植治疗心肌梗死的研究。     

荧光磁性纳米粒子标记三维培养系统中的脂肪间充质干细胞

背景：荧光磁性纳米粒子具有量子点和磁粒子的双重特质,生物相容性好,能够被胞吞入细胞质高效地标记细胞。目的：验证荧光磁性纳米粒子标记人脂肪间充质干细胞的可行性。方法：抽脂术抽取健康人脂肪组织,采用Ⅰ型胶原酶消化法分离,贴壁培养纯化人脂肪间充质干细胞。取第6代脂肪间充质干细胞与荧光磁性纳米粒子孵育过夜,采用普鲁士蓝染色、激光共聚焦显微镜检测体外标记细胞情况,荧光成像系统观察荧光磁性纳米粒子标记的干细胞体内示踪效果。结果与结论：普鲁士蓝染色显示荧光磁性纳米粒子以蓝色颗粒的形式分散于脂肪间充质细胞胞质中。激光共聚焦显微镜观察显示人脂肪间充质干细胞的细胞核被Hoechest33258染成蓝色,细胞质被标记成绿色;荧光成像结果表明标记的人脂肪间充质干细胞具有很好的成像效果。结果提示荧光磁性纳米粒子可以作为示踪剂在体外标记人脂肪间充质干细胞,为脂肪间充质干细胞的移植转化研究提供新方法。     

大鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及生物学特性的实验研究

【目的】建立一种体外分离和培养大鼠脂肪间充质干细胞的方法,并探讨其部分生物学特性.【方法】无菌技术下切取双侧腹股沟脂肪垫,加入适量Ⅰ型胶原酶消化获取细胞,接种入含10%新生牛血清的DMEM培养液,倒置显微镜下连续观察细胞形态变化,测定其生长曲线及贴壁率.【结果】原代培养显示培养的脂肪间充质干细胞2 d左右开始贴壁 ,7 d左右可达90％融合,基本上为梭形成纤维样细胞形态.14代以前具有活跃的增殖能力.【结论】成功地建立了一种分离培养大鼠脂肪间充质干细胞的方法,其生长稳定、增殖较快,可以作为组织工程的种子细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养与CM-DiI荧光标记

背景：目前,对骨髓间充质干细胞的分离、纯化和扩增还没有统一的、标准化的方法。CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。 目的：建立SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及标记的方法。 方法：取2只体质量50-100 g雄性SD大鼠,无菌条件下采集双侧股骨、胫骨骨髓,用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法培养出原代骨髓间充质干细胞,通过及时、反复传代对细胞进行扩增纯化,在体外用荧光活性染料CM-DiI标记第3代骨髓间充质干细胞后作为供体细胞来源。 结果与结论：用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法两种方法均能成功体外分离培养骨髓间充质干细胞,经流式细胞仪分析,培养出的细胞CD34阳性率为17.5%,CD44阳性率为97.9%、CD90阳性率为91%,与骨髓间充质干细胞表面抗原一致。但培养出的细胞数量全骨髓贴壁分离法明显多于密度梯度离心法,两种方法培养骨髓间充质干细胞的细胞活力和增殖能力无明显差异。CM-DiI能够成功荧光标记骨髓间充质干细胞, CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。     

第4代大鼠脂肪间充质干细胞的免疫表型鉴定

背景:有文献证实以酶消化法可获得在脂肪组织间充质干细胞,传至第10代时细胞生长仍良好,但表面标志物表达下降. 目的:分离培养大鼠脂肪组织间充质干细胞,传代至第4代,检测免疫表型. 方法:从6只SD大鼠腹股沟脂肪垫中分离培养脂肪组织间充质干细胞,以贴壁细胞扩增传代至第4代.相差显微镜下观察脂肪组织间充质干细胞的形态,并用流式细胞术鉴定脂肪组织间充质干细胞的表面标志物CD11b,CD29,CD45,CD49d,CD90 和 CD106的表达率.结果与结论:大鼠脂肪组织间充质干细胞呈现类似成纤维细胞样形态学特征,免疫表型分析显示CD29和CD90 呈阳性,而CD11b、CD45、CD49d和CD106呈阴性反应.结果提示通过这种酶消化法获得的SD大鼠的脂肪组织间充质干细胞,免疫表型分析显示符合间充质干细胞的特征.     

活体磁共振示踪磁标记大鼠神经干细胞

背景:要将神经干细胞替代治疗神经系统疾病应用于临床,必须解决一个重要问题,就是植入人脑内神经干细胞的存活、迁移、识别和动态监测.目的:拟建立菲立磁体外标记胎鼠神经干细胞的方法及检测于段,观察标记细胞移植后在活体上磁共振信号的改变.设计、时间及地点:MRI动态评估,体内实验,于2005-01/08在武警医学院附属医院完成.材料:孕13～18 d SD胚胎大鼠10只用于分离、培养大鼠胚胎源性神经干细胞,健康成年清洁级SD大鼠32只,用于制作局灶性脑缺血再灌注模型.方法:分离培养大鼠胚胎源性神经干细胞,使用菲立磁一多聚赖氨酸复合物标记神经干细胞.制作局灶性脑缺血再灌注模型,将菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记的神经干细胞分别移植入模型大鼠左侧脑内,右侧移植未标记的神经干细胞.主要观察指标:对标记细胞进行普鲁士蓝染色、电镜观察.细胞活体移植后1,5,14 d体内磁共振示踪.结果:菲立磁可以高效率地标记神经干细胞,普鲁上蓝染色显示菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记神经干细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒,电镜结果显示非立磁-多聚赖氮酸复合物标记的神经干细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡.磁共振成像检查发现脑内移植的标记细胞在磁共振上呈明显的低信号改变,移植第5天低信号物质沿胼胝体腹侧迁移.在移植第14天,对称平行的两个针道已经基本看不见,病灶侧侧脑室部位低信号物质向对侧迁移,左侧侧脑室部位低信号物质基本看不见.结论:菲立磁经多聚左旋赖氨酸转染后可体外标记神经干细胞,标记后体内移植的神经干细胞可以在磁共振上产生明显的低信号改变.     

脂肪基质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死

目的探讨大鼠脂肪基质干细胞(ASCs)移植于梗死心肌后的增殖分化情况及对心功能的影响。方法培养大鼠ASCs,流式细胞术鉴定其表型。将SD大鼠左前降支结扎制造急性心肌梗死模型后,在梗死心肌处植入DAPI标记ASCs(实验组)或DMEM培养液(对照组)。移植后1及4周,超声检查心功能。并取梗死区心肌组织进行移植细胞形态学检查及毛细血管密度测定。RTPCR、ELISA法测梗死区VEGF的mRNA及蛋白表达情况。结果培养获得ASCs,表型为CD44 、CD105 ,CD31-、CD45-。植入梗死区的ASCs可以分化为血管内皮细胞,实验组梗死心肌处血管密度较对照组明显增高(P<0.01),且VEGF基因及蛋白水平在移植后1周均较对照组明显增高(P<0.01)。移植后4周,实验组大鼠左室射血分数(LVEF)及左室短轴缩短率(FS)较对照组明显提高(P<0.01)。结论ASCs移植可以促进大鼠梗死后心肌血管新生,改善心功能。     

SPIO标记脂肪干细胞移植退变椎间盘内的MRI活体示踪

背景:国内外动物实验多是荧光标记骨髓间充质干细胞的移植,以SPIO标记脂肪干细胞移植后活体示踪对退变椎间盘修复作用的研究较少。目的:活体监测SPIO标记的脂肪干细胞在退变椎间盘内的存活、迁移和转归,以及脂肪干细胞对退变椎间盘的修复及延缓退变作用。方法:新西兰大白兔20只,兔椎间盘被分为4组,即正常对照组(L1/2),脂肪干细胞组(L2/3),PBS组(L3/4),SPIO-脂肪干细胞组(L4/5)。透视引导下用18G穿刺制作退变模型后2周行SPIO标记的脂肪干细胞移植。结果与结论:SPIO-脂肪干细胞移植后即刻T2WI/FFE序列上可见椎间盘内明显低信号,8周后仍可检测到低信号。脂肪干细胞移植组与同时间点PBS组比较,椎间盘退变程度轻。提示SPIO-脂肪干细胞移植至椎间盘后,可通过MRI进行监测;脂肪干细胞椎间盘内移植有助于修复退变椎间盘和延缓椎间盘退变。     

SPIO标记脂肪干细胞移植退变椎间盘内的MRI活体示踪

背景：国内外动物实验多是荧光标记骨髓间充质干细胞的移植,以SPIO标记脂肪干细胞移植后活体示踪对退变椎间盘修复作用的研究较少.目的：活体监测SPIO标记的脂肪干细胞在退变椎间盘内的存活、迁移和转归,以及脂肪干细胞对退变椎间盘的修复及延缓退变作用.方法：新西兰大白兔20只,兔椎间盘被分为4组,即正常对照组（L1/2）,脂肪干细胞组（L2/3）,PBS组（L3/4）,SPIO-脂肪干细胞组（L4/5）.透视引导下用18G穿刺制作退变模型后2周行SPIO标记的脂肪干细胞移植.结果与结论：SPIO-脂肪干细胞移植后即刻T2WI/FFE序列上可见椎间盘内明显低信号,8周后仍可检测到低信号.脂肪干细胞移植组与同时间点PBS组比较,椎间盘退变程度轻.提示SPIO-脂肪干细胞移植至椎间盘后,可通过MRI进行监测;脂肪干细胞椎间盘内移植有助于修复退变椎间盘和延缓椎间盘退变.     

脂肪干细胞与软骨细胞的共培养

背景：有研究发现关节软骨微环境可诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。目的：验证软骨细胞能否诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化,以便成为组织工程构建关节软骨可能的新方法。设计、时间及地点：随机对照细胞实验,于2007-09／2008—07在南京大学生物医药生物技术国家重点实验室完成。材料：清洁级成年新西兰大白兔,雌雄不限,体质量1．5—2．0kg。方法：分离培养原代新西兰大白兔脂肪干细胞和软骨细胞,分别种植于6孔板和插入式细胞培养皿共培养2周后,胰酶消化终止。脂肪干细胞分别行油红O染色、碱性磷酸酶检测和甲苯胺蓝染色法鉴定。主要观察指标：倒置显微镜观察共培养前后脂肪干细胞的形态变化。甲苯胺蓝染色法检测共培养后脂肪干细胞的蛋白多糖的表达水平。免疫细胞化学检测共培养后脂肪干细胞的Ⅱ型胶原的表达水平。反转录-聚合酶链反应检测蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录水平。结果：脂肪干细胞分别经油红。染色、碱性磷酸酶染色和甲苯胺蓝染色法鉴定证实,分离的细胞具有多向分化能力,是脂肪来源的间充质干细胞。共培养1周后部分脂肪干细胞变圆,2周时其蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录和蛋白表达均增高。结论：与软骨细胞共培养后,脂肪干细胞可以被诱导成软骨样细胞。     

增强型绿色荧光蛋白标记兔脂肪干细胞体外复合膀胱黏膜下层的生长特性

背景:绿色荧光蛋白作为细胞示踪标记已得到广泛应用,作者所查尚未见到以增强型绿色荧光蛋白作为标记方法用于研究脂肪干细胞与膀胱脱细胞基质复合后体外生长特性的报道.目的:利用绿色荧光蛋白标记兔来源的脂肪干细胞,观察其作为种子细胞复合膀胱脱细胞基质体外培养的生长特性,为复合物回植体内时间提供参考.设计、时间及地点:细胞标记示踪实验,于2009-01/05在上海组织工程研究与开发中心及上海第六人民医院实验动物房完成.材料:取2只新西兰大白兔,制备膀胱脱细胞基质.取2只新西兰大白兔脂肪分离脂肪干细胞.方法:体外培养增殖后脂肪干细胞转染增强型的绿色荧光蛋白,转染前后根据增殖速度,绘制生长曲线.然后将增强型绿色荧光蛋白转染的第3代脂肪干细胞以30×106的浓度接种于1 cm×1 cm大小的膀胱脱细胞基质支架材料上培养.主要观察指标:观察细胞转染后的生长特性,检测复合后的细胞总数,荧光显微镜观察复合后细胞形态.结果:脂肪干细胞经转染后生长增殖速度未受明显影响.细胞DNA检测示复合培养7 d细胞增殖状态最佳.荧光显微镜观察显示培养7 d细胞增殖良好,10 d后呈现老化形态.结论:增强型的绿色荧光蛋白转染不影响脂肪干细胞传代、增殖.脂肪干细胞-膀胱脱细胞基质复合物体外培养7 d左右回植较合适.     

改良诱导方案诱导SD大鼠脂肪源性干细胞定向分化为软骨细胞

背景:软骨组织工程是骨科研究的热点,在种子细胞的研究上由于软骨细胞存在老化现象更多的研究集中在干细胞向软骨细胞分化上.分化条件经历单细胞因子、联合细胞因子及贯续细胞因子的应用.目的:观察改良诱导方案诱导SD大鼠脂肪源性干细胞定向分化为软骨细胞的能力.设计、时间及地点;观察性实验,于2008-06/12在遵义医学院珠海校区中心实验室完成.I材料:SPF级健康SD大鼠5只,鼠龄18～22 d,体质量约25g,用于脂肪干细胞的培养基扩增.方法:在无菌条件下从SD大鼠腹股沟区取皮下脂肪组织约3 g,Ⅰ型胶原酶消化后,1 000 r/min离心10 min,待细胞长满瓶底80%时用2.5 g/L胰蛋白酶消化,按1:2或1:3比例传代培养.加入软骨诱导培养基14 d后阿新蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测脂肪干细胞向软骨细胞的诱导分化.主要观察指标:流式细胞仪检测大鼠脂肪干细胞表面CD44、CD45和CD49d的表达.结果:SD大鼠脂肪组织分离培养出的细胞经流式细胞仪检测CD44、CD49d表达阳性,CD45表达阴性.加入软骨诱导培养基定向诱导72 h后,细胞生长缓慢,逐渐变成圆形,并渐渐有软骨结节形成;诱导分化2周后,阿新蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性.结论:SD大鼠脂肪组织能够分离培养出脂肪干细胞,生物学特性与骨髓间充质干细胞相似,能向软骨细胞分化.     

脂肪干细胞体外诱导分化为平滑肌细胞的研究进展

脂肪干细胞是从脂肪组织中提取得到的一种干细胞,具有向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞等多种细胞分化的潜能。将脂肪干细胞在一定的条件下诱导分化成为有功能的平滑肌细胞,为组织工程技术提供了理想的种子细胞。现就脂肪干细胞在体外诱导分化成为平滑肌细胞的研究进展进行综述。     

猪脂肪干细胞与脱细胞真皮基质的生物相容性

背景：脱细胞真皮基质已广泛应用于器官或组织缺损的修补。目的：观察猪脂肪源性干细胞与脱细胞真皮基质的相容性。方法：酶消化法原代培养猪脂肪源性干细胞,利用流式细胞仪和多向诱导分化方法鉴定脂肪干细胞,将其与脱细胞真皮基质共培养。结果与结论：实验成功培养出猪脂肪源性干细胞,流式细胞仪检测结果显示阳性表达CD44和CD105,不表达CD34和CD45;在诱导培养基条件下,可向脂肪细胞、成骨细胞分化。苏木精-伊红染色及扫描电镜发现干细胞能在脱细胞真皮基质表面黏附生长。脂肪源性干细胞与脱细胞真皮基质具有良好的相容性,将两者体外复合培养后,有望将复合物植入体内进行缺损组织、器官的修复。