膀胱移行细胞癌中P16基因的甲基化失活

目的：研究膀胱移行细胞癌中P16基因甲基化失少及其在肿瘤发生中的作用,方法：应用DNA甲基化分析技术检测52例膀胱移行细胞癌中P16基因5’CPG岛的甲基化状态,应用RT－PCR检测P16基因mRNA的表达,结果：52例膀胱移行细胞癌中19例出现P16基因5’CPG的甲基化,甲基化率为36．54％,而发生甲基化的肿瘤均未检测到P16mRNA表达,P16基因5’CPG岛甲基化多见于高期,高级肿瘤（P＜0．05）,结论：P16基因5’CPG岛的甲基化引起的基因失活是膀胱肿瘤发展过程中的晚期所见。     

乳腺癌及良性病变中P16蛋白与基因5'CpG岛甲基化的病理意义的探讨

目的：探讨P16蛋白在乳腺良生病变,乳腺导管内癌,浸润性导管癌中的表达,p16基因5＇CpG岛甲基化在原发性乳腺癌组织中与P16蛋白失表达的关系及意义.方法：用限制性酶PCR检测45例乳腺浸润性导管癌及15例乳腺良性病变p16基因中5＇CpG岛甲基化状态,甲基化检测结果与免疫组织化学方法检测的P16蛋白表达结果进行比较.结果：p16蛋白在乳腺癌中强表达,但随组织学分级升高,淋巴结的转移,肿瘤直径的增加,p16蛋白表达率降低.p16基因甲基化与p16蛋白表达负相关,且与组织学分级相关.结论：p16基因甲基化是其失表达的可能机制之一.     

膀胱移行细胞癌P16、P15、P14基因5''''CpG岛甲基化检测

目的探讨P16、P15、P14基因5'CpG岛在膀胱移行细胞癌中甲基化状态及其临床意义。方法应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)方法检测40例膀胱移行细胞癌P16、P15、P14基因甲基化程度,χ2检验分析其甲基化程度与膀胱癌病理分级分期间关系。结果膀胱移行细胞癌P16、P15、P14 5'CpG岛甲基化扩增阳性化率分别为27.5%、17.5%、35%,而正常膀胱组织中均未检测到三种基因5'CpG岛甲基化。P16、P14基因甲基化与膀胱癌病理分级分期有显著性差异(P<0.05),P15基因则没有显著性差异(P>0.05)。结论P16、P15、P14基因在膀胱癌组织中的甲基化率较高,三种抑癌基因5'CpG岛异常高甲基化,在膀胱癌的发生、发展中具有重要作用。     

膀胱移行细胞癌P16、P15、P14基因5＇CpG岛甲基化检测

目的 探讨P16、P15、P14基因5＇CpG岛在膀胱移行细胞癌中甲基化状态及其临床意义。方法 应用甲基化特异性PCR（methylation—specific PCR，MSP）方法检测40例膀胱移行细胞癌P16、P15、P14基因甲基化程度，χ^2检验分析其甲基化程度与膀胱癌病理分级分期间关系。结果 膀胱移行细胞癌P16、P15、P14 5＇CpG岛甲基化扩增阳性化率分别为27．5％、17．5％、35％，而正常膀胱组织中均未检测到三种基因5＇CpG岛甲基化。P16、P14基因甲基化与膀胱癌病理分级分期有显著性差异（P〈0．05），P15基因则没有显著性差异（P〉0．05）。结论 P16、P15、P14基因在膀胱癌组织中的甲基化率较高，三种抑癌基因5＇CpG岛异常高甲基化，在膀胱癌的发生、发展中具有重要作用。     

p16基因失活对膀胱移行细胞癌增殖活性的影响

目的 :探讨膀胱移行细胞癌中p1 6基因失活与肿瘤增殖活性的关系。方法 :应用RT PCR检测肿瘤组织中p1 6mRNA的表达 ;应用Ki67标记指数 (Ki67LI)及核仁组成区嗜银蛋白 (AgNOR)染色对肿瘤的增殖活性进行研究 ;应用免疫组化对Rb基因的表达进行检测。结果 :p1 6mRNA表达缺失率为 55 .8% ,肿瘤增殖活性(Ki6TLI与AgNOR)在p1 6基因阳性表达组与阴性表达组之间差异无统计学意义 (P >0 .0 5) ;但在Rb基因阳性表达的肿瘤中 ,p1 6基因阳性表达肿瘤的Ki67LI及AgNOR分别为 34 .95± 1 5 .56、4 .1 2± 1 .0 8,p1 6阴性表达者分别为 52 .1 2± 2 1 .2 4、7.1 2± 3 .2 5 ,2组相比差异有统计学意义 (P <0 .0 5)。结论 :p1 6基因对膀胱移行细胞癌增殖活性的影响依赖于Rb基因的表达     

乳腺癌及良性病变中P16蛋白与基因5′CpG岛甲基化的病理意义的探讨

目的:探讨P16蛋白在乳腺良性病变,乳腺导管内癌,浸润性导管癌中的表达,p16基因5′CpG岛甲基化在原发性乳腺癌组织中与P16蛋白失表达的关系及意义。方法:用限制性酶PCR检测45例乳腺浸润性导管癌及15例乳腺良性病变p16基因中5′CpG岛甲基化状态,甲基化检测结果与免疫组织化学方法检测的P16蛋白表达结果进行比较。结果:p16蛋白在乳腺癌中强表达,但随组织学分级升高,淋巴结的转移,肿瘤直径的增加,p16蛋白表达率降低。p16基因甲基化与p16蛋白表达负相关,且与组织学分级相关。结论:p16基因甲基化是其失表达的可能机制之一。     

膀胱移性细胞癌p16基因缺失、突变、甲基化及其蛋白表达的研究

目的对25例膀胱移性细胞癌(bladder transitional cell carcinoma,简称膀胱癌)患者的p16基因第一、第二外显子纯合性缺失,第二外显子的点突变,第一外显子区5＇CpG岛的甲基化情况及p16蛋白表达进行检测,探讨p16基因在膀胱癌中失活的方式及p16蛋白表达与膀胱癌之间的关系. 方法取患者膀胱癌组织,用酚/氯仿法提取癌组织基因组DNA,设计p16基因第一、二外显子引物,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、PCR-单链构象多态性 (PCR-single strand conformational polymorphism, PCR-SSCP)、甲基化敏感限制性内切酶-PCR分析方法,对25例膀胱癌患者的癌组织基因组DNA的p16基因第一、二外显子的纯合性缺失、第二外显子点突变及第一外显子区5＇CpG岛的甲基化情况进行分析.应用S-P免疫组织化学方法检测25例膀胱癌和6例正常膀胱黏膜组织中p16基因的表达情况,并分析其意义. 结果在这25例膀胱癌患者中,发现p16基因第二外显子缺失者有4例,第一外显子和第二外显子共同缺失者有1例,第一外显子缺失者1例,p16基因的缺失率为24%(6/25);未发现p16基因第二外显子的点突变; p16基因第一外显子区5＇CpG岛的甲基化率为69.6%(16/23).p16基因表达在膀胱癌组织中阳性率为52%(13/25),6例正常膀胱黏膜组织中均阳性,两者比较差异有显著性(P<0.01).随病理分级、临床分期的上升和预后的不良,p16基因的阳性表达率有下降趋势,但差异无显著性(P＞0.05).结论 p16基因的失活方式主要有三种:纯合性缺失、点突变和5＇CpG岛的甲基化,但外显子2的纯合性缺失在安徽区域发生的膀胱癌中可能不是一个较频繁发生的"事件";通过p16基因第一外显子区5＇CpG岛异常甲基化失活可能是膀胱癌p16基因失活的主要机制.在这25例膀胱癌患者中,未发现p16基因的点突变,但仍不能排除这种失活机制,我们将通过扩大样本,进一步研究p16基因的点突变情况.p16基因表达产物与膀胱癌的发生发展及预后可能有关系,也有待于扩大例数进一步研究.p16基因表达产物可作为诊断膀胱癌的指标之一.     

膀胱移行细胞癌DBCCR1基因启动子甲基化分析

目的探讨膀胱移行细胞癌DBCCR1基因启动子甲基化状态及其临床意义。方法应用甲基化特异性PCR方法检测40例膀胱移行细胞癌和8例正常膀胱粘膜组织中DBCCRI基因甲基化程度,x^2检验分析其甲基化程度与膀胱癌病理分级分期之间的关系。结果正常膀胱组织未检测到DBCCR1基因启动子甲基化,在膀胱移行细胞癌启动子甲基化扩增阳性化率达42．5％,与膀胱癌病理分级分期没有相关性（P〉0．05）。结论DBCCR1基因启动子异常高甲基化是其失活的主要机制之一,也是膀胱移行细胞癌中一早期事件。     

E2F3在膀胱移行细胞癌中的表达及意义

目的:通过检测E2F3 mRNA在膀胱移行细胞癌组织及正常膀胱移行上皮组织中的表达,探讨其与膀胱移行细胞癌发生发展的关系.方法:通过RT-PCR方法检测34例膀胱移行细胞癌组织及19例正常膀胱移行上皮组织中E2F3 mRNA的表达情况.结果:E2F3 mRNA在膀胱移行细胞癌及正常膀胱移行上皮组织中的阳性表达率分别为47.1%(16/34)和0%(0/19).膀胱移行细胞癌组织中E2F3 mRNA的表达率明显高于正常膀胱移行上皮组织(P＜0.005).其中膀胱移行细胞癌组织中E2F3 mRNA的表达率随肿瘤分级、分期增高而相应增高(P＜0.05).结论:E2F3基因可能通过参与细胞周期调控,在膀胱移行细胞癌的发生发展中起到促进作用.     

膀胱移行细胞癌P16基因5’CpG岛甲基化与肿瘤恶性程度关系分析

目的 :了解P16基因在膀胱移行细胞癌 (TCC)中甲基化改变及这一改变与肿瘤恶性程度的关系。方法 :采用PCR法检测 31例膀胱TCCs标本及 9例正常膀胱粘膜P16基因甲基化。结果 :正常膀胱粘膜无甲基化P16基因外元 1甲基化率为 2 9.0 3% ,外元 2为 35 .48% ;外元 1甲基化与肿瘤恶性程度有显著相关性 (P <0 .0 1) ,外元 2甲基化与肿瘤恶性程度无相关性 (P >0 .0 5 )。结论 :膀胱TCCP16基因存在甲基化 ,外元 1甲基化可使细胞增殖进一步失控而使肿瘤恶性程度增加 ,在P16基因失活中可能起更重要作用。     

脑星形细胞瘤p16基因缺失及5'CpG岛甲基化检测

目的探讨p16基因异常与脑星形细胞瘤发生、发展的关系。方法利用PCR及PCR-based甲基化技术检测了56例不同级别的脑星形细胞瘤组织p16基因缺失及5'CpG岛甲基化状况。结果18例高病理级别的脑星形细胞瘤发生了p16基因缺失,而低病理级别的脑星形细胞瘤无一例发生缺失（P<0.05）;6例脑星形细胞瘤发生了p16基因5'CpG岛甲基化。结论p16基因失活可能参与脑星形细胞瘤的病理发生、恶性进展。p16基因纯合缺失是p16基因失活的主要机制。     

人原发性肝癌中p16基因表达及CpG岛甲基化状态的研究

目的　进一步探讨人原发性肝癌中 p16基因 m RNA转录水平变化与其基因启动子区 Cp G岛甲基化的关系 ,及其在肝癌发生中的意义。方法　采用狭缝印迹杂交检测 2 0例人原发性肝癌及相应的癌旁、远癌组织及 2例正常人肝组织中 p16基因 m RNA表达水平 ,以甲基化特异性 PCR分析各组织中 p16基因启动子区 Cp G岛的甲基化状况 ,并进行统计分析。结果　 2 0例人原发性肝癌中 14例 (70 % ) p16 m RNA水平比远癌组织显著降低 ;13例 (6 5 % )显示 p16基因启动子区 Cp G岛甲基化 ,其中 84 .6 % (11例 )伴 p16 m RNA转录水平降低。结论　人原发性肝癌中存在高频率的 p16基因表达失活 ,其主要机制可能是启动子区 Cp G岛甲基化抑制了基因的转录 ,在人原发性肝癌的发生发展中有重要作用。其临床诊断和治疗意义有待进一步深入研究。     

5-氮-2′-脱氧胞苷对RKO结肠癌细胞株p16/CDKN2基因去甲基化的转录调节作用

目的 探讨DNA5′CpG岛去甲基化对RKO结肠癌细胞株p16／CDKN2抑癌基因的转录调控作用及对细胞株生长增殖的生物学影响,寻找抗癌治疗的新靶点。方法 用特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine)作用结肠癌细胞株72h后,甲基特异性PCR(Methylation-specific PCR．MSP)、T-A克隆及DNA测序分析甲基化状态,四唑盐(MTT)比色、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光定量PCR(Real-timePCR)、免疫组织化学染色(IHC)及蛋白印迹(Western blot)检测用药前后RKO细胞株生长倍增时间以及对p16／CDKN2 mRNA及蛋白表达的影响。结果 (1)未经5-Aza-deoxycytidine作用的对照组RKO细胞基因组DNA的胞嘧啶保持不变,而经5-Aza-CdR作用的RKO结肠癌细胞基因组DNA的胞嘧啶均已变为胸腺嘧啶;(2)与对照组相比,3组不同浓度5-Aza-2′-deoxycytidine均能明显抑制肿瘤细胞生长,倍增时间分别增加了1．49、1．64、1．87倍;(3)经5-Aza-2′-deoxycytidine作用后,p16／CDKN2基因mRNA表达分别增加了4．89、16．91、19．97倍,而DNA甲基转移酶mRNA表达显著降低;(4)免疫组化染色和蛋白印迹均显示,经处理后的肿瘤细胞p16／CDKN2蛋白表达呈明显增强。结论 DNA异常甲基化与RKO结肠癌细胞有关;特异性甲基转移酶抑制剂5-Aza-2′-deoxycytidine能较好地逆转RKO细胞DNA异常甲基化,并有效地激活因高甲基化所致p16／CDKN2基因沉默的再转录,诱导该基因的表达,从而抑制肿瘤细胞生长。     

甲基化特异PCR方法对p16肿瘤抑制基因的研究

目的：研究肺癌、结肠癌组织中p16肿瘤抑制基因甲基化状态及其临床意义。方法：采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）方法,特异扩增分析甲基化和非甲基化两种状态。结果：p16基因在人胚肺组织处于非甲基化状态;在人肺巨细胞癌细胞系（PLA801-D）呈甲基化状态;在检测的肿瘤标本中,60%肺癌组织及70%结肠癌组织出现甲基化状态。结论：p16基因的甲基化状态是肺癌、结肠癌组织中p16基因异常形式之一,有可能成为肿瘤分子诊断的重要标志,MSP方法有临床普及应用前景。     

5-氮-2'-脱氧胞苷及曲古抑菌素A对HT29人结肠癌细胞株ING1b基因启动子区域甲基化、组蛋白乙酰化及ING1bmRNA表达的影响

目的　探讨DNA5'CpG岛去甲基化和组蛋白去乙酰化对HT29人结肠癌细胞株ING1b基因启动子区域甲基化、组蛋白乙酰化及其mRNA表达的影响。方法　应用特异性DNA甲基转移酶（DNMTs）抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷（5-Aza-2'-dc,以下简称Aza）及组蛋白去乙酰化酶（HDACs）抑制剂曲古抑菌素A（TSA）作用人结肠癌细胞株HT29后,用甲基化特异性PCR(MSP)检测该ING1b基因核心启动子区域CpG岛甲基化情况,用染色质免疫沉淀(ChIP)检测其乙酰化组蛋白绑定的DNA情况,并用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测ING1bmRNA表达。结果　HT29人结肠癌细胞株ING1b基因核心启动子区域存在CpG岛半甲基化,且乙酰化水平低,mRNA表达水平低。经Aza及TSA干预后,ING1b基因核心启动子区域CpG岛转为非甲基化,其乙酰化水平增加,ING1bmRNA表达亦比对照组高。结论　HT29人结肠癌细胞株ING1b基因5端核心启动子甲基化及乙酰化可能是导致该基因表达沉默的主要原因,Aza逆转HT29人结肠癌细胞株ING1b基因异常甲基化,TSA能较好地提高其组蛋白乙酰化水平,并有效地激活因半甲基化所致ING1b基因沉默的再转录,诱导该基因表达,从而抑制肿瘤细胞生长。     

Downregulation and CpG island hypermethylation of NES1/hK10 gene in the pathogenesis of human

The normal epithelial cell-specific-1(NES1)/Kallikrein 10 gene is proposed to be a novel putative tumor suppressor gene in several malignant diseases.The role of NES1 gene in gastric cancer has not been fully understood.Our study revealed that CpG island hypermethylation plays an important role in the downregulation of NES1 mRNA expression in gastric cancer.In situ hybridization showed that loss or reduction of NES1 mRNA expression is associated with differentiation level during tumor progression suggesting that NES1 inactivation might contribute to the malignant progression of human gastric cancers.     

165例恶性淋巴瘤中p16基因异常的研究

目的 检测恶性淋巴瘤（ML）中p16基因的缺失、甲基化及p16蛋白的表达,探讨p16基因异常在淋巴瘤中的意义。方法 收集淋巴瘤鹇组织标本50例,存档石蜡包埋组织标本115例,均包括T、B非霍奇金淋巴瘤（NHL）及霍奇金淋巴瘤（HL）。用PCR、甲基化特异的PCR方法检测新鲜组织中的p16基因的等位缺失及5‘CgG岛异常甲基化;用免疫组织化学方法检测石蜡标本中p16蛋白的表达情况。另外,分别选取9例反应性增生（RH）组织的标本作对照。结果 12/50例（24.0%）新鲜标本中检出p16基因纯合性缺失,16/50例（32.0%）检出p16基因异常高甲基化;石蜡包埋标本中p16蛋白的失表达率为41.6%,其中B-NHL为46.0%,T-NHL为54.5%,HL为31.6%。恶性程度较高的淋巴瘤类型中p16蛋白的失表达率也相应较高,各类型之间比较：弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）和滤泡性淋巴瘤（FL）的p16失表达率存在组间差异的显著性。所有RH标本均未见p16基因或蛋白表达的异常。结论 恶性淋巴瘤中p16基因的异常是一个频发事件,p16基因表达异常参与了淋巴瘤的发生及进展。     

膀胱癌中eya4基因启动子区甲基化状态及其临床意义

目的 探讨膀胱癌细胞系和膀胱移行细胞癌组织中EYA转录共激活磷酸酶4(eya4)基因启动子区CpG岛甲基化状态及在临床病理特征中的意义.方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测eya4基因在5株膀胱癌细胞系、1株膀胱永生化上皮细胞系和75例膀胱移行细胞癌组织及癌旁组织,并结合临床病理特征行统计学分析.结果 eya4基因启动子区在5株膀胱癌细胞系中,有4株出现甲基化,其甲基化率为80%;在人正常膀胱细胞系中甲基化阴性.eya4在膀胱癌组织中的甲基化率为70.7%(53/75),显著高于癌旁组织(24%,18/75),差异有统计学意义(x2=32.760,P<0.01).eya4基因启动子区CpG岛甲基化在临床病理特征中如单发膀胱肿瘤与多发膀胱肿瘤相比,直径≤3 cm的膀胱肿瘤与＞3 cm的膀胱肿瘤相比,低级别膀胱肿瘤与高级别膀胱肿瘤相比,浅表性膀胱肿瘤与浸润性膀胱肿瘤相比,差异均有统计学意义(P<0.05),但与年龄和性别无关.结论 基因eya4启动子区甲基化与膀胱癌的发生发展有关,可能作为膀胱移行细胞癌诊断的一个新的标志物.     

PITX2启动子甲基化及其与膀胱癌临床病理的关系

目的:由于近些年表观遗传学的发展,基因启动子甲基化检测在预测癌症诊断预后方面拥有巨大的潜力。PITX2启动子的高CpG岛增加其甲基化程度,其能够成为新的膀胱癌预测因子。方法: QRT-PCR检测永生化膀胱上皮细胞系（SV-HUC）和3种膀胱癌细胞系（EJ、5637、T24）以及癌组织和癌旁组织的差异性表达。通过DNA甲基化测定实验对33例全膀胱切除术切除癌组织进行甲基化程度测定,分为大于50%甲基化,小于50%甲基化建立甲基化程度与肿瘤分期分级的联系。结果:使用实时定量RT-PCR（Q-PCR）证明PITX2在膀胱癌细胞中高表达。癌组织中甲基化程度明显高于癌旁组织。PITX2启动子甲基化与肿瘤大小（P =0.026 7）、高级别（P =0.027 7）和TNM分期（0.016 0）显着相关。在预测肿瘤侵袭（T2-T4肿瘤）中,PITX2启动子甲基化的ROC曲线下面积（AUC）为0.867。 Kaplan-Meier生存分析表明,与低PITX2甲基化表达的肿瘤相比,高PITX2启动子甲基化表达的肿瘤与较短的总体存活相关。结论:PITX2在膀胱癌组织中异常高表达,并且PITX2启动子区域在癌组织中存在高甲基化是患者不良预后的独立危险因素,因此,PITX2启动子甲基化可能成为膀胱癌肿瘤发生进展有效的预测因子。     

p16与非小细胞肺癌临床病理的关系及5-Aza-CdR对肺癌A549细胞中p16表达的影响

目的 探讨抑癌基因p16在非小细胞肺癌（non-small cell lungcancer,NSCLC）组织中的表达与临床病理参数间的联系,进一步研究DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-2′-deoxycytidine,5-Aza-CdR）在人肺癌A549细胞中对p16 表达的影响。方法 采用免疫组化SP法检测76例NSCLC组织及其癌旁正常组织中p16 蛋白的表达情况,并分析不同病理参数癌组织中p16蛋白表达的差异;采用MSP法检测不同浓度（0~16 μmol/L）5-Aza-CdR处理后的A549细胞中P16基因启动子区DNA的甲基化状态,并采用Western blot 法检测5-Aza-CdR对A549细胞中p16 表达的影响。结果 76例NSCLC组织中,32例（42.11%）p16 蛋白表达阳性,低于癌旁正常组织（59例,77.63%）中阳性表达（P<0.05）;不同病理组织分级、肿瘤分化程度、临床TNM分期及有无淋巴结转移的NSCLC组织中p16 的阳性表达率差异有统计学意义（P<0.05）;在A549细胞中p16蛋白表达和非甲基化产物均呈低表达状态,5-Aza-CdR作用后,p16蛋白和其非甲基化产物表达均上调,且随着5-Aza-CdR浓度的升高呈增多趋势。结论 p16 在鳞癌、低分化、有淋巴结转移及Ⅲ~Ⅳ期NSCLC组织中低表达,提示其失活可能与NSCLC的进一步进展有关,5-Aza-CdR可诱导A549细胞中p16蛋白和非甲基化产物表达增加。