siRNA干扰STAT3基因对食管癌Eca-109细胞生物学特性的影响

目的:探讨RNA干扰技术沉默STAT3信号传导通路对人食管癌Eca-109细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响.方法:针对人STAT3基因mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,将其连入pRNAT-U6.1/neo质粒中,构建STAT3-siRNA表达载体,稳定转染人食管癌Eca-109细胞,利用RT-PCR、Western blot技术分别检测转染细胞中STAT3基因mRNA和蛋白的表达,MTT实验、流式细胞技术检测转染细胞的增殖、细胞周期和凋亡变化情况.结果:成功构建STAT3-siRNA表达载体,经测序鉴定正确.RT-PCR和Western blot结果显示,STAT3-siRNA3表达载体明显抑制了人食管癌Eca-109细胞中STAT3基因mRNA和蛋白的表达,与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.01).MTT实验显示,稳定转染siRNA后,siRNA3实验组细胞的增殖能力明显下降,细胞生长抑制卒为35.68%,较对照组明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01).流式细胞技术显示,siRNA3实验组出现了细胞周期阻滞和细胞凋亡,细胞周期阻滞于G_0/G_1期,细胞凋亡率为13.26%,明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01);结论:RNA干扰技术沉默STAT3基因可以有效地抑制STAT3基因的表达,进而抑制人食管癌Eca-109细胞的增殖,引起细胞周期G_0/G_1期阻滞,促进其凋亡.     

化学合成siRNA对卵巢癌SKOV3细胞中STAT3基因表达的抑制作用

目的:观察小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)对卵巢癌SKOV3细胞STAT3表达的抑制作用及其诱导凋亡作用的机制。方法:将STAT3 siRNA经LipofectamineTM2000脂质体介导的方法将其转染到卵巢癌细胞株SKOV3。实验分为以下3组:空白对照组(未经转染的人卵巢癌SKOV3细胞)、阴性对照转染组(阴性干扰STAT3)及特异性转染组(干扰STAT3)。用MTT法检测siRNA转染后SKOV3细胞增殖活性;流式细胞仪检测其对细胞凋亡的影响,免疫荧光法检测STAT3蛋白水平的变化,qRT-PCR和Western blot方法分别检测STAT3 mRNA和蛋白表达水平的变化。结果:成功转染STAT3干扰片段,转染率达90%。siRNA干扰STAT3组明显抑制卵巢癌细胞增殖活性,细胞凋亡率33.7%,并且下调STAT3蛋白在SKOV3细胞中的表达。RT-PCR和Western blot结果显示:siRNA STAT3组明显抑制人卵巢癌细胞SKOV3中STAT3 mRNA和蛋白的表达,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:特异性转染组48h后能有效地抑制SK-OV3细胞内STAT3的表达、抑制细胞增殖,其抑制卵巢癌细胞的机制可能与抑制了STAT3信号通路,促进细胞凋亡有关,为卵巢癌的生物治疗提供了一定的依据。     

小RNA干扰STAT3基因表达对胃癌细胞增殖和侵袭的影响

目的:构建针对STAT3基因的短发夹状小干扰RNA重组质粒,探讨应用RNAi技术沉默STAT3基因对胃癌细胞BGC-823增殖和侵袭的影响。方法:应用DNA重组技术,构建针对STAT3基因的干扰RNA重组质粒(pSilencer-STAT3),经脂质体转染BGC-823胃癌细胞,逆转录聚合酶链反应和Western blot免疫印迹法检测STAT3的表达水平;MTT法检测RNA干扰后细胞增殖情况;Transwell细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。结果:酶切鉴定和测序证实了重组质粒构建成功。与未转染和转染阴性对照质粒组相比,pSilencer-STAT 3转染组胃癌细胞BGC-823中STAT 3mRNA和STAT 3蛋白的表达水平均明显降低,F=39.424,P=0.000和F=31.911,P=0.001。pSilencer-STAT3转染组胃癌细胞BGC-823的生长受到明显抑制,抑制率达47.3%,与阴性对照质粒组的8.1%抑制率相比,差异具有统计学意义,F=40.835,P=0.000。侵袭实验显示,pSilencer-STAT3转染组胃癌细胞BGC-823穿膜细胞数,显著低于阴性对照质粒组和未转染...     

RNA干扰技术沉默STAT3 对人肺癌细胞生长抑制的作用

 目的 探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因表达对肺腺癌A549细胞的生长抑制作用。方法针对STAT3mRNA序列设计合成2对编码si RNA的DNA模板,构建pSUPER-si RNA-STAT3重组质粒,转染A549细胞;采用RT-PCR法检测重组质粒对STAT3基因表达的影响;在荧光显微镜下观察细胞的凋亡情况。结果 成功构建pSUPER-si RNA-STAT3重组质粒,并成功转染A549细胞。特异性si RNA片段能有效降低STAT3mRNA水平,最大干扰效率达85.32%,明显高于空质粒对照组;干扰作用于转染后24h即可出现,48h达高峰,72h降低。对应不同位点的两个si RNA片段对STAT3均可产生干扰作用,彼此间差别不大。在荧光显微镜下,与未转染细胞相比,转染si RNA的A549细胞中凋亡细胞所占比例明显增加。结论 pSUPER-si RNA-STAT3可抑制STAT3在人肺腺癌A549细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞的生长,促进其凋亡。以STAT3为靶点的RNA干扰技术可望成为肺癌基因治疗的新方法。     

阳离子聚酰胺-胺型树枝状聚合物介导STAT3-shRNA对前列腺癌生长的抑制作用

目的探讨第5代阳离子聚酰胺-胺型树枝状聚合物(G5-PAMAM-D)作为小发卡RNA (shRNA)真核表达质粒的载体,进行前列腺癌RNA干扰基因治疗的可行性。方法根据增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、信号转导子和转录激活子3(STAT3)cDNA序列结构,分别设计构建表达EGFP mRNA、STAT3 mRNA的特异shRNA真核表达质粒pSilencing 4.1-EGFP-shRNA和pSilencing 4.1- STAT3-shRNA。在体外以G5-PAMAM-D为载体,将质粒pEGFP-C1和pSilencing 4.1-EGFP-shRNA共转染前列腺癌细胞PC-3、22Rvl,通过观察EGFP表达检测干扰效果以及转染效率;然后,以同样的方式将pSilencing 4.1-STAT3-shRNA转入前列腺癌细胞系,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测其对细胞生长的抑制作用,丫啶橙染色观察细胞凋亡。制作前列腺癌小鼠模型,将G5-PAMAM-D与质粒pSilencing 4.1-STAT3-shRNA的混合物注射人荷瘤鼠肿瘤内,观察对肿瘤生长的抑制作用。结果体外实验表明,G5-PAMAM-D可将pSilencing 4.1.EGFP-shRNA转入前列腺癌细胞,明显沉默EGFP的表达,并且G5-PAMAM-D可将pSilencing 4.1-STAT3-shRNA有效转入前列腺癌细胞中,明显抑制肿瘤细胞的生长,增加细胞的凋亡。体内实验证明,G5-PAMAM-D/pSilencing 4.1-STAT3-shRNA可抑制荷瘤鼠前列腺癌的生长,而各对照组肿瘤生长无明显抑制。结论G5-PAMAM-D作为基因载体,可将shRNA的真核表达质粒在体内外转入前列腺癌组织细胞,并有效表达shRNA;G5-PAMAM-D可能成为应用前景广阔的小干扰RNA(siRNA)的载体。     

STAT3特异性小干扰RNA表达载体的构建及其对STAT3表达的抑制

目的　构建特异性抑制信号转导与转录激活因子3(STAT3)的小干扰RNA(siRNA)表达载体并检测其对STAT3表达及PC 3细胞增殖的抑制作用。方法　设计、合成STAT3特异性的短链寡核苷酸,经退火形成双链DNA片段,克隆到pSilencerTM2.1 U6载体中,构建STAT3特异siRNA的表达载体,HindIII和BamHI双酶切及测序鉴定重组体,并转染PC 3细胞,G418筛选出稳定表达细胞株,半定量反转录聚合酶链反应(RT PCR)方法和免疫印迹法检测STAT3mRNA和蛋白的表达水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖活性。结果　经双酶切与测序鉴定成功构建STAT3 siRNA表达载体,转染前列腺癌细胞株PC 3可显著抑制细胞中STAT3mRNA和蛋白的表达水平(抑制率分别为52.4% 及50.5% ),且细胞增殖活性亦较未转染PC 3细胞显著降低(p<0.05)。结论　运用pSilencerTM2.1 U6载体构建的STAT3 siRNA表达载体可有效抑制STAT3的表达及前列腺癌细胞的增殖。     

Knockdown of stat3 expression by RNAi inhibits in vitro growth of human ovarian cancer

Background

The aim of the study was to investigate the suppressive effects of pSilencer2.1-U6-siRNA-stat3 recombinant plasmids on the growth of ovarian cancer in vitro.

Material and methods.

Three pairs of DNA template (stat3-1, stat3-2, stat3-3) specific for different target sites on stat3 mRNA were synthesized to reconstruct pSilencer2.1-U6-siRNA-stat3s, which were transfected into SKOV3 cells. The expressions of STAT3, BcL-2, cyclin D1 and C-myc in these cells were detected by Western blot and Northern blot. The cell cycle and the growth were determined by flow cytometry (FCM) and MTT assay, respectively. Cell apoptosis was determined by TUNEL staining.

Results

Of the three siRNAs, only siRNA targeting stat3-3 markedly suppressed the protein expression of stat3 in SKOV3 cells; MTT assay and FCM showed that transfection of stat3-3 siRNA could significantly suppress the growth of SKOV3 cells and arrest the cell cycle in vitro. TUNEL staining also showed massive apoptosis in SKOV3 cells transfected with stat3-3 siRNA.

Conclusions

pSilencer2.1-U6-siRNA-stat3-3 can significantly inhibit the STAT3 expression in human ovarian cancer cells resulting in the inhibition of the cancer growth and the increase of apoptosis of cancer cells.     

小分子干扰RNA特异性抑制人胰腺癌细胞株PANC-1突变型K-ras基因表达的探讨

目的:研究小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对人胰腺癌细胞株PANC-1中突变型K-ras基因表达的抑制作用.方法:构建真核表达载体pSilencer3.1-K-rasv12,转染PANC-1细胞后应用RT-PCR及Western blot检测突变型K-ras基因mRNA及蛋白质表达变化;噻唑蓝(MTT)测定细胞生长曲线;流式细胞仪测定细胞凋亡率.结果:测序证实siRNA真核表达载体构建成功.RT-PCR光密度比值结果空载体组、阴性对照组、实验组分别为:95.3%±2.5%、97.6%±2.8%、40.1%±3.1%,差异有统计学意义(P＜0.05);Western blot灰度比值结果空载体组、阴性对照组、实验组分别为:96.1%±2.2%、98.5%±2.0%、36.5%±3.2%,差异有统计学意义(P＜0.05);实验组细胞生长受到明显抑制,凋亡率较对照组明显升高(P＜0.05).结论:pSilencer3.1-K-rasv12能有效抑制突变型K-ras基因在人胰腺癌细胞株PANC-1中的表达,抑制细胞生长,诱导细胞凋亡,为肿瘤的生物学治疗提供了新的方法.     

STAT3通过上调Twist基因表达从而诱导肺腺癌细胞上皮-间质转化

目的探讨信号转导子与转录激活子3（STAT3）基因在肺腺癌细胞上皮-间质转化（Epi．thelial-mesenchymal transition,EMT）过程中的作用。方法应用STAT3-siRNA转染人肺腺癌A549细胞,下调STAT3基因表达。转染后观察细胞形态学变化,通过Westernblot检测STAT3和Twist蛋白的表达变化。同时应用Transwell法和划痕实验检测细胞的侵袭和迁移能力。并应用免疫组化法验证STAT3和Twist蛋白在肺腺癌组织中表达的相关性。结果STAT3-siRNA转染人肺腺癌A549细胞后,STAT3基因表达下降,同时降低Twist的表达,并且降低肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,在肺腺癌组织中我们也观察到随着分化程度升高,两个蛋白在肺癌组织中的的表达均逐渐降低,并呈正相关。结论STAT3基因通过调节Twist的表达,参与EMT过程,从而在肺癌进展中发挥重要作用。     

RNA干扰survivin基因对卵巢癌细胞生长凋亡及药物敏感性的影响

目的 探讨下调survivin基因对卵巢癌顺铂(DDP)耐药细胞株SKOV3/DDP细胞生长、凋亡及药物敏感性的影响.方法 构建survivin基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体pSilencer-survivin,用脂质体方法转染SKOV3/DDP细胞株,另设未转染组和转染pSilencer-control组作为对照.显微镜下观察转染前后细胞的变化,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分别检测survivinmRNA及蛋白的表达,二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞凋亡及周期的变化.各组细胞加入DDP,检测其对DDP药物敏感性的影响.结果 survivin siRNA可明显下调SKOV3/DDP细胞中survivin mRNA及蛋白表达水平.SKOV3/DDP细胞生长受到明显抑制,生长曲线低平.转染48 h后,转染pSilencer-survivin组细胞凋亡率为19.1%,明显高于末转染组(2.6%)和转染pSilencer-control组(3.5%),G1/G0期细胞所占的比例增高,而G2/M期细胞所占的比例降低.转染pSilencer-survivin组细胞的IC50明显降低,为1.16 μg/mi.结论 survivin siRNA可下调SKOV3/DDP细胞中survivin的表达,使细胞生长减慢,凋亡增加,对DDP的药物敏感性增强.     

EGFR对胃癌细胞SGC7901化疗敏感性及细胞中STAT3磷酸化水平的影响

目的:探讨表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)对胃癌细胞SGC7901化疗敏感性及细胞中信号转导和转录因子3(STAT3)磷酸化水平的影响.方法:收集胃癌组织及对应的癌旁组织,体外培养胃癌细胞MKM28、SGC7901、BGC823和胃黏膜上皮细胞GES-1,Western blot检测胃癌组织、癌旁组织及胃癌细胞MKM28、SGC7901、BGC823和胃黏膜上皮细胞GES-1中EGFR的表达水平.细胞转染小干扰RNA对照序列(siRNA control组)和EGFR小干扰RNA(EGFR siRNA组),同时设置对照组(只加入转染试剂)、化疗组(细胞培养液中加入8 μmol/L 5-氟尿嘧啶)、联合组(转染EGFR siRNA后的细胞,细胞培养液中加入8 μmol/L 5-氟尿嘧啶),培养48 h后,Western blot检测细胞中活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、信号转导和转录因子3(STAT3)、磷酸化STAT3(p-STAT3)、EGFR表达水平,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况.结果:EGFR在胃癌组织中表达水平明显高于癌旁组织,在胃癌细胞中的表达水平明显高于胃黏膜上皮细胞.EGFR siRNA组细胞中EGFR水平明显降低.EGFR siRNA组、化疗组、联合组细胞存活率及p-STAT3表达水平明显低于对照组,而凋亡率及细胞中Cleaved Caspase-3水平明显高于对照组。联合组细胞存活率及p-STAT3表达水平明显低于化疗组,而凋亡率及细胞中Cleaved Caspase-3水平明显高于化疗组。结论:EGFR在胃癌中过表达.抑制EGFR表达后,胃癌细胞增殖受到抑制,凋亡增多,化疗敏感性增加,作用机制可能与STAT3磷酸化水平有关.     

人ＳＴＡＴ３基因ｓｉＲＮＡ真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建针对人ＳＴＡＴ３基因的ｓｉＲＮＡ真核表达质粒,检测其在细胞水平对ＳＴＡＴ３基因表达的抑制效果。方法：用ＤＮＡ重组技术将针对人ＳＴＡＴ３基因ｍＲＮＡ序列不同位点设计的３个ｓｉＲＮＡ序列克隆到真核表达质粒ｐＲＮＡＴ-Ｕ６.１／ｎｅｏ中构建重组体ｐＲＮＡＴ-Ｕ６.１-ｓｉＲＮＡ,重组质粒经ＰＣＲ检测及测序分析,用脂质体转染重组质粒至人食管癌Ｅｃａ-１０９细胞,Ｇ４１８筛选获得阳性克隆,ＲＴ-ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＳＴＡＴ３基因ｍＲＮＡ和蛋白的表达,筛选最佳沉默效率的ｓｉＲＮＡ。结果：ＰＣＲ检测及测序分析结果均提示重组质粒构建正确。ＲＴ-ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测证实ｐＲＮＡＴ-Ｕ６.１-ｓｉＲＮＡ３具有最佳的沉默效率。结论：成功构建人ＳＴＡＴ３基因ｓｉＲＮＡ真核表达质粒,并证实其能够从ｍＲＮＡ和蛋白水平抑制ＳＴＡＴ３基因的表达。     

Neu RNAi对卵巢癌细胞生长、凋亡及药物敏感性的作用

目的探讨nenRNAi对卵巢癌耐药细胞株SKOV3／DDP细胞生长、凋亡及药物敏感性的作用,寻找下调基因表达并逆转化疗耐药的方法,为卵巢癌的基因治疗探索新途径。方法应用含有u6启动子的pSilencer 1．0-U6表达载体构建neu基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体（pSilencer—neu）,用脂质体方法将pSilencer—neu转染卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3／DDP,另设未转染组及转染pSilencer—control组为对照。显微镜下观察转染前后细胞的变化;用RT—PCR及Western Blot检测neu基因mRNA及蛋白的表达;MTT法检测细胞生长情况;流式细胞仪检测细胞凋亡及周期的变化;加入顺铂后检测RNAi对SKOV3／DDP顺铂药物敏感性的影响。结果neuRNAi可明显下调卵巢癌耐药细胞株SKOV3／DDP中neu的基因表达;使其细胞生长受到抑制,生长速度减慢,生长曲线低平;细胞凋亡增加且细胞周期发生变化,G1／G0期细胞增多,S期细胞则减少;顺铂耐药实验显示,转染RNAi的SKOV3／DDP细胞IC50明显下调,细胞凋亡率显著增加。结论应用RNAi可以部分阻抑neu基因在卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3／DDP中的表达,使SKOV3／DDP细胞生长减慢、凋亡增加,而且对顺铂的敏感性增强。     

STAT3 mediates resistance to MEK inhibitor through microRNA miR-17

AZD6244 is a small molecule inhibitor of the MEK (MAP/ERK kinase) pathway currently in clinical trials. However, the mechanisms mediating intrinsic resistance to MEK inhibition are not fully characterized. To define molecular mechanisms of MEK inhibitor resistance, we analyzed responses of 38 lung cancer cell lines following AZD6244 treatment and their genome-wide gene expression profiles and identified a panel of genes correlated with sensitivity or resistance to AZD6244 treatment. In particular, ingenuity pathway analysis revealed that activation of the STAT3 pathway was associated with MEK inhibitor resistance. Inhibition of this pathway by JSI-124, a STAT3-specific small molecule inhibitor, or with STAT3-specific siRNA sensitized lung cancer cells to AZD6244 and induced apoptosis. Moreover, combining a STAT3 inhibitor with AZD6244 induced expression of BIM and PARP cleavage, whereas activation of the STAT3 pathway inhibited BIM expression and elicited resistance to MEK inhibitors. We found that the STAT3-regulated microRNA miR-17 played a critical role in MEK inhibitor resistance, such that miR-17 inhibition sensitized resistant cells to AZD6244 by inducing BIM and PARP cleavage. Together, these results indicated that STAT3-mediated overexpression of miR-17 blocked BIM expression and caused resistance to AZD6244. Our findings suggest novel approaches to overcome resistance to MEK inhibitors by combining AZD6244 with STAT3 or miR-17 inhibitors.     

用RNAi沉默survivin基因表达对前列腺癌细胞系PC3的影响

目的：运用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术阻断前列腺癌细胞系PC3中survivin基因的表达，并研究survivin基因沉默后对PC3细胞产生的影响。方法：用真核转录载体pSilencer^TM3．1-H1 neo构建针对survivin基因的重组真核转录载体pSilencer3．1-SVVl、pSilencer3．1-SVV2和pSilencer3．1-SVV3，并用脂质体法转染前列腺癌细胞系PC3，通过RT—PCR、蛋白印迹实验检测survivin的表达变化，并用流式细胞术、MTT法检测转染后PC3细胞的凋亡、细胞周期、细胞生长速度、对顺铂的敏感性等方面的变化。结果：重组载体pSilencer3．1-SVV2和pSilencer3．1-SVV3有效地阻断了PC3细胞中survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达（P〈0．01）。重组载体转染PC3细胞后，与对照组相比，细胞的凋亡增加了10％～15％；细胞生长速度明显变慢，其细胞数在84h时与对照组相比减少约30％；G1期细胞增加了10％。G2期和S期细胞减少了5％以上。加入顺铂后，pSilencer3．1-SVV2、pSilencer3．1-SVV3重组质粒转染的PC3细胞的存活数下降了35％～45％，细胞凋亡则增加了10％-14％。结论：初步证明了survivin基因在前列腺癌细胞分化增殖、抗凋亡等方面所扮演的重要角色，为进一步阐明survivin基因与前列腺癌的关系以及以survivin基因为靶点的前列腺癌基因治疗研究奠定了基础。     

RNAi沉默STAT3基因表达对膀胱癌细胞T24及5637生长影响的实验研究

目的 探讨应用RNA干扰(RNAi)技术沉默信号转导子与转录活化子(STAT3)基因对膀胱癌细胞株T24及5637细胞的影响.方法 针对STAT3 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建pGenesil-1-shRNA-STAT3重组质粒,转染人类膀胱癌细胞株T24及5637细胞.通过半定量RT-PCR、Western blotting法检测STAT3基因不同水平的表达情况,采用流式细胞仪检测转染后细胞周期的变化.结果 成功构建pGenesil-1-shRNA-STAT3重组质粒,并成功转染T24及5637膀胱癌细胞;半定量RT-PCR、Western blotting结果显示,重组质粒转染组细胞的STAT3基因表达在RNA及蛋白水平上显著低于对照组(P<0.05);流式细胞仪的结果显示,重组质粒转染组细胞明显受到抑制并出现凋亡现象.结论 pGeneSil-1-shRNK-STAT3转染膀胱癌细胞株T24及5637细胞后,可有效抑制STAT3的表达,并抑制膀胱癌细胞的生长.     

沉默STAT3基因对人食管癌EC1细胞裸鼠移植瘤的抑制作用

目的构建STAT3靶向短发夹RNA（shRNA）质粒,研究其对人食管癌EC1细胞裸鼠皮下移植瘤的作用,探讨其在食管癌基因治疗中的可行性和特异性。方法构建STAT3的siRNA真核表达载体pSUPER-EGFP-STAT3,稳定表达该质粒的细胞为实验组,转染空质粒细胞及未处理细胞为对照组,建立裸鼠荷瘤模型;监测肿瘤生长变化,HE染色观察肿瘤病理学变化,RT-PCR、免疫组化方法检测STAT3mRNA和蛋白变化。结果裸鼠体内实验显示,实验组肿瘤增长受到明显抑制;HE染色显示对照组肿瘤体积大、异形明显;RT-PCR、免疫组化结果表明实验组STAT3mRNA和蛋白表达下调。结论shRNA沉默STAT3基因能抑制人食管癌EC1细胞裸鼠皮下移植瘤的形成,且能在体内有效下调STAT3mRNA和蛋白的表达,为食管癌的基因治疗提供了新的靶点,开辟了新的思路。     

RhoA小干扰RNA对胃癌AGS细胞基因表达谱的影响

目的：应用RhoA小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）转染胃癌细胞系AGS细胞，采用高通量基因芯片技术，筛选基因表达谱的变化，为进一步研究RhoA信号转导通路奠定基础。方法：用pSilencer3．1载体构建RhoA／siRNA重组质粒。Effectene转染试剂转染AGS细胞，空载体pSilencer3．1转染对照组。应用G418筛选转染细胞系，获得稳定转染细胞；美国Agilent基因芯片检测细胞基因表达谱变化。结果：基因芯片检测全基因组，发现表达上调的有1151个基因，表达下调的有1079个基因，涉及信号转导、细胞周期、细胞凋亡等相关信号分子。生物信息学分析显示，与细胞凋亡有关的caspase家族，以及细胞周期调控基因存在明显的差异表达。结论：基因芯片结果提示干扰RhoA表达后，与凋亡和增殖有关的分子在RhoA介导的肿瘤细胞异常增殖信号转导中起着重要的调控作用，为下一步研究其信号调控网络机制提供重要的信息。     

反义STAT3对肿瘤细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用

背景与目的：研究表明STAT3蛋白在多种肿瘤组织或细胞中高表达。STAT3蛋白可能参与了肿瘤的形成和发生。本文拟研究STAT3蛋白在鼠黑色素瘤细胞B16、人肝癌细胞SMMC-7721、人肝癌细胞HepG-2、人肺癌细胞A549、人宫颈癌HeLa细胞株中表达和活化情况,研究反义STAT3寡核苷酸对B16细胞的增殖抑制和促凋亡作用,为进一步反义药物设计及应用于辐射领域作前期研究。方法：利用Western blot检测所选几种肿瘤细胞的STAT3蛋白表达和磷酸化情况、反义干涉前后B16细胞中STAT3蛋白表达和磷酸化活化的变化情况,MTT法检测细胞增殖变化,利用Hoechst33258染色对细胞凋亡作形态学上的观察．用Annexin V／PI复染结合流式细胞仪检测细胞早期凋亡。结果：所研究的几种肿瘤细胞中均可检测到STAT3蛋白的高表达和磷酸化;反义STAT3转染后,B16细胞中STAT3蛋白的表达量及磷酸化水平均有下降;转染后48h,在0到200nmol／L范围内,反义核酸浓度越高。对B16细胞的增殖抑制效应越强,但是并不能够完全抑制肿瘤细胞的增殖（P〈0．01）。寡核苷酸浓度超过250nmol／L时．正义对照也表现出一定的增殖抑制作用（P〈0．05）;转染后不同时间内检测,结果表明转染后24h反义核酸即开始表现出一定的增殖抑制效应,48h起表现出明显的抑制效应;反义转染后,检测各组细胞早期凋亡率：对照组早期凋亡率为5．52％．反义400、800、2000nmol／L组早期凋亡率分别为8．22％、9．99％．16．97％,正义对照400、800、2000nmol／L组早期凋亡率分别为5．87％、5．36％、13．31％。统计分析表明反义寡核苷酸与B16细胞作用后能够促进细胞的早期凋亡（P〈0．01）,正义低浓度转染组（400、800nmol／L组）与对照组无明显差别（P〉0．05）,而对照组与正义2000nmol／L组相比,细胞的早期凋亡率也有统计学差异（P〈0．01）。结论：B16、SMMC-7721、HepG-2、A549、HeLa等恶性肿瘤细胞株中STAT3蛋白高表达并且可检测到磷酸化水平的增高;反义转染后B16细胞中STAT3蛋白的表达和磷酸化水平降低．细胞增殖受到明显抑制。细胞的凋亡增加．表明STAT3可能成为肿瘤治疗新的分子靶位。