肾疏宁对HBV诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的探讨肾疏宁干预乙型肝炎病毒(HBV)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化,延缓肾间质纤维化作用的可能机制。方法通过75只C57BL/6小鼠的中药肾疏宁灌胃,制备含药血清;使用Lipofectamine转染HBV至HK-2的方法造模;将细胞分为:空白血清对照组、空质粒组、HBV组、贝那普利组、肾疏宁低浓度组、肾疏宁中浓度组、肾疏宁高浓度组。运用酶联免疫吸附实验(ELISA)、实时荧光定量PCR法、蛋白质印迹(Western blot)法检测HK-2细胞中HBsAg、HBeAg、TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad7、Col-Ⅲ、ColⅣ、FN的表达。结果 ELISA检测结果:HBV组与空质粒组比较,HBsAg、HBeAg、TGF-β1表达上调(P0.01);与HBV组比较,贝那普利组、肾疏宁低浓度组、肾疏宁中浓度组、肾疏宁高浓度组TGF-β1蛋白表达下降(P0.001);与贝那普利组比较,肾疏宁低浓度组TGF-β1的表达相对较高(P0.05)。实时荧光定量PCR检测结果:与HBV组比较,贝那普利组、肾疏宁各干预组ColⅢ、Col-Ⅳ、FN mRNA表达明显下降(P0.001)。Western blot检测结果:与HBV组比较,贝那普利组、肾疏宁各干预组p-Smad2、p-Smad3蛋白表达明显下降(P0.001)。结论肾疏宁可通过干预TGF-β1/Smad信号通路减轻HBV诱导的人肾小管上皮细胞转分化,并减轻细胞外基质的沉积,从而延缓纤维化的进程。     

HBV在HK-2细胞内的表达及对其转分化的影响

目的   研究乙型肝炎病毒（HBV）在人近端肾小管上皮细胞（HK-2）的表达及对其转分化的影响。方法   体外培养HK-2细胞,分为HK-2组、HK-2-PHY106组（空质粒PHY106转染组）、HK-2-PHY106-HBV组（PHY106-HBV质粒转染组）。用脂质体lipofectamineTM2000转染HK 2细胞。用ELISA法检测各组细胞培养上清液中HBsAg与HBeAg的含量。免疫细胞化学染色及Western blot印迹检测转染72h后E-钙黏素（E-cadherin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达。RT-PCR法检测转染72h后转化生长因子-1（TGF-β1）的mRNA。结果   HK-2-PHY106-HBV组细胞培养上清液中可检测到HBsAg和HBeAg的高表达;免疫细胞化学染色及Western blot印迹检测均显示HK-2-PHY106-HBV组E-cadherin表达显著下调（P＜0.05）,而α-SMA表达与其他两组相比明显上调（P＜0.05）;RT-PCR显示HK-2-PHY106-HBV组TGF-β1的mRNA表达上调（P＜0.05）。结论   HBV可在HK-2细胞内高效复制,并能够导致HK-2转分化,其机制可能是通过上调TGF-β1来实现的。     

松果菊苷对高糖诱导的人肾小管上皮细胞上皮间质转化及纤维化的影响

目的:研究松果菊苷(ECH)对高糖诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)转分化及纤维化的影响,探讨松果菊苷改善肾纤维化的机制。方法:取对数期生长的HK-2细胞分组:正常对照组(NC,5. 5 mmol/L的D-葡萄糖)、渗透浓度对照组(OSM,5. 5 mmol/L的D-葡萄糖+24. 5 mmol/L甘露醇)、高糖组(HG,30 mmol/L的D-葡萄糖)、低松果菊苷组(E-L,30 mmol/L的D-葡萄糖+125μmol/L松果菊苷)、高松果菊苷组(E-H,30 mmol/L的D-葡萄糖+250μmol/L松果菊苷)。RT-PCR和Western Blot检测各组HK-2细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ),纤维连接蛋白(Fn),转化生长因子β1(TGF-β1),Smad3及Smad2的mRNA和蛋白质表达水平;细胞免疫组化法检测Fn和α-SMA的阳性表达。结果:ECH对HK-2细胞增殖的影响:不同浓度的ECH(125,250μmol/L)分别处理HK-2细胞48 h后,相较于空白对照组,差异均无统计学意义(P>0. 05),提示ECH对HK-2细胞增殖活性无影响。高糖处理48 h时:①HG组HK-2细胞中α-SMA、CollagenⅢ、Fn、TGF-β1、Smad3及Smad2的mRNA和蛋白表达水平均显著高于NC组(P<0. 05);②相较于NC组,OSM组细胞相关上述指标的变化均无统计学意义(P>0. 05),即高浓度渗透压对HK-2细胞无显著作用;③相较HG组,ECH处理后的各浓度组HK-2细胞α-SMA、CollagenⅢ、Fn、TGF-β1、Smad3及Smad2的mRNA和蛋白表达量均显著降低(P<0. 05);各浓度组间比较,相较于E-L组,E-H组HK-2细胞α-SMA、CollagenⅢ、Fn、TGF-β1、Smad3及Smad2的mRNA和蛋白表达水平显著下降(P<0. 05)。结论:松果菊苷可减少α-SMA、CollagenⅢ及Fn的产生,抑制高糖诱导的HK-2细胞上皮间质转化及纤维化;松果菊苷可通过下调TGF-β1、Smad3及Smad2的表达,抑制TGF-β1/Smads信号通路,从而逆转肾纤维化,延缓糖尿病肾病的发展。     

红细胞生成素对人白蛋白诱导肾小管上皮细胞转分化的作用

目的探讨红细胞生成素(EPO)对人白蛋白诱导的正常人近端肾小管上皮细胞(HK-2细胞)转分化的作用。方法将体外培养的HK-2细胞随机分为空白对照组(未加任何刺激物)、EPO诱导组(EPO终浓度为20 U/mL)、白蛋白诱导组(白蛋白终浓度5 mg/mL)、EPO干预组(EPO终浓度分别为5、10、20 U/mL)及转化生长因子β1(TGF-β1)拮抗剂组(SB431542终浓度为10μmol/L,加入SB431542 30 min后加白蛋白,白蛋白终浓度为5 mg/mL),各组均刺激24 h。应用RT-PCR法检测细胞TGF-β1 mRNA的水平;细胞免疫荧光法检测细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达;ELISA法检测上清液纤维连结蛋白(FN)的蛋白表达。结果 RT-PCR结果表明白蛋白诱导组TGF-β1 mRNA较空白对照组显著升高(P<0.05),给予EPO干预后TGF-β1 mRNA显著下调(P<0.05);细胞免疫荧光及ELISA结果显示白蛋白诱导组E-cadherin的蛋白表达较空白对照组显著下降,α-SMA、FN的蛋白表达显著上升(P<0.05),而在EPO干预组及TGF-β1拮抗剂组E-cadherin的蛋白表达较白蛋白诱导组显著上调,α-SMA、FN的蛋白表达显著下调(P<0.05),且与EPO的浓度有关。结论 EPO可抑制白蛋白诱导的HK-2细胞的转分化,从而延缓肾间质纤维化,其机制可能与阻断TGF-β1的作用有关。     

骨形成蛋白-7对肾小管上皮细胞转分化及结缔组织生长因子表达的影响

目的 观察骨形成蛋白-7(BMP-7)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人近端肾小管上皮细胞(HK-2)向间充质细胞转分化(EMT)及表达结缔组织生长因子(CTGF)的影响,探讨其抑制、逆转肾间质纤维化的可能机制.方法 将体外培养的HK-2细胞分为对照组,3 ng/ml TGF-β1组,TGF-β1同时加不同浓度BMP-7(100～400 ng/ml)组.相差显微镜观察细胞形态改变;间接免疫荧光测定E-cadherin的表达;RT-PCR和Western印迹分别检测α-SMA、E-cadherin、CTGF mRNA和蛋白的表达.结果 3 ng/ml TGF-β1刺激48 h后,HK-2细胞由立方形铺路石样转变为梭形长条样;去除TGF-β1,再加入200 ng/ml BMP-7干预48 h,可见到大部分细胞逆转回原来的形态.免疫荧光显示,E-cadherin蛋白在正常HK-2细胞质膜高表达;3 ng/ml TGF-β1刺激后,E-cadherin表达明显减弱;去除TGF-β1,再加入200 ng/ml BMP-7干预后,E-cadherin表达重新恢复.RT-PCR及Western印迹显示,3 ng/mlTGF-β1刺激48 h后,α-SMA mRNA及蛋白表达明显上调、E-cadherin mRNA及蛋白表达明显减少,同时CTGF mRNA及蛋白表达明显增加(P<0.01);BMP-7与TGF-β1共同刺激48 h后,BMP-7呈剂量依赖性抑制TGF-β1诱导下α-SMA mRNA及蛋白的表达,并逐渐恢复E-cadherin mRNA及蛋白的表达,同时下调CTGF mRNA及蛋白的表达,400 ng/ml BMP-7组与TGF-β1组相比差异有统计学意义(P<0.01).结论 BMP-7能阻断并逆转TGF-β1诱导的EMT,下调CTGF的表达,这可能是其逆转肾间质纤维化的重要作用机制.     

VEGF对上皮间充质转化的抑制与Smad信号途径及SnoN表达的变化

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导HK-2细胞发生肾小管上皮-间充质细胞转化(EMT)的过程中对Smad2/3,Smad7信号途径以及SnoN表达的影响。方法体外培养的HK-2细胞分为:①正常对照组;②TGF-β1(5μg/L)阳性对照组;③VEGF165(100μg/L)作用组;④TGF-β1(5μg/L)+VEGF165(100μg/L)共同作用组。采用WesternBlot法和RT-PCR分别检测各组细胞p-Smad2/3和Smad2/3(共同作用30和60min),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Smad7、SnoN的表达水平(共同作用48h)。结果 TGF-β1组α-SMA蛋白和mRNA表达与正常对照组比较明显增强,TGF-β1与VEGF165共同作用组α-SMA蛋白和mRNA表达与TGF-β1单独作用组比较明显减弱(P0.05)。体外HK-2细胞,TGF-β1组刺激30、60min,与正常对照组比较,(p-Smad2/3)/(Smad2/3)比值明显升高,TGF-β1+VEGF165组与TGF-β1单独作用组相比明显下降,且以30min时下降明显。TGF-β1组作用48h与正常对照组比较,Smad7蛋白和mRNA表达明显下降,VEGF165+TGF-β1组较TGF-β1单独作用组Smad7表达明显升高(P0.05)。VEGF165组与正常对照组相比,α-SMA、(p-Smad2/3)/(Smad2/3)、Smad7蛋白和mRNA表达的差异无统计学意义(P﹥0.05)。TGF-β1组SnoN蛋白表达与正常对照组比较明显增强(P0.05),TGF-β1与VEGF165共同作用组SnoN蛋白表达与TGF-β1单独作用组相比差异无统计学意义(P﹥0.05),各组SnoNmRNA表达差异均无统计学意义(P﹥0.05)。结论 VEGF165抑制TGF-β1诱导HK-2细胞EMT的机制可能与直接抑制Smad2/3磷酸化、上调Smad7信号表达有关,而与调节SnoN表达无关。     

Smad signal transduction pathway involved in supression of VEGF on TGF-β1 induced EMT of HK-2 cells

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导HK-2细胞发生肾小管上皮-间充质细胞转化(EMT)的过程中对Smad 2/3,Smad 7信号途径以及SnoN表达的影响.方法 体外培养的HK-2细胞分为:①正常对照组;②TGF-β1(5μgL)阳性对照组;③VEGF165(100μg/L)作用组;④TGF-β1(5 μg/L)+ VEGF165(100 μg/L)共同作用组.采用Western Blot法和RT-PCR分别检测各组细胞p-Smad 2/3和Smad 2/3(共同作用30和60 min),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Smad 7 、SnoN的表达水平(共同作用48 h).结果 TGF-β1组α-SMA蛋白和mRNA表达与正常对照组比较明显增强,TGF-β1与VEGF165共同作用组α-SMA蛋白和mRNA表达与TGF -β1单独作用组比较明显减弱(P＜0.05).体外HK-2细胞,TGF-β1组刺激30、60 min,与正常对照组比较,(p-Smad 2/3)/(Smad 2/3)比值明显升高,TGF-β1 +VEGF165组与TGF-β1单独作用组相比明显下降,且以30 min时下降明显.TGF-β1组作用48h与正常对照组比较,Smad7蛋白和mRNA表达明显下降,VEGF165+TGF-β1组较TGF-β1单独作用组Smad 7表达明显升高(P＜0.05).VEGF165组与正常对照组相比,α-SMA、(p-Smad 2/3 )/(Smad 2/3)、Smad 7蛋白和mRNA表达的差异无统计学意义(P＞0.05).TGF-β1组SnoN蛋白表达与正常对照组比较明显增强(P＜0.05),TGF-β1与VEGF165共同作用组SnoN蛋白表达与TGF-β1单独作用组相比差异无统计学意义(P＞0.05),各组SnoN mRNA表达差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 VEGF165抑制TGF-β1诱导HK-2细胞EMT的机制可能与直接抑制Smad 2/3磷酸化、上调Smad 7信号表达有关,而与调节SnoN表达无关.     

水飞蓟宾对转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞中结缔组织生长因子及Ⅲ型胶原表达的影响

目的:了解水飞蓟宾(silibinin)对转化生长因子(TGF)-β_1诱导的人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)结缔组织生长因子(CTGF)表达及Ⅲ型胶原分泌的影响。方法:将体外培养的HK-2细胞分为3组:①对照组;②TGF-β_1组(TGF-β_1的终浓度为5 ng/ml);③TGF-pβ_1 水飞蓟宾组(TGF-β_1的终浓度为5 ng/ml,水飞蓟宾终浓度分别为5、10、20μg/m1)。48 h后,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞内CTGFmRNA的水平,ELISA方法检测培养上清中胶原Ⅲ及CTGF的浓度。结果:与对照组比较,TGF-β_1刺激使HK-2细胞CTGF基因表达和蛋白分泌及Ⅲ型胶原分泌均显著增加(P<0.01)。与TGF-β_1组比较,加用5～20μg/ml水飞蓟宾可以抑制TGF-β_1刺激所诱导的CTGF基因表达和蛋白分泌及Ⅲ型胶原分泌(P<0.01),以20μg/ml水飞蓟宾效果最显著。结论:水飞蓟宾能部分抑制TGF-β_1诱导CTGF的基因和蛋白的表达及Ⅲ型胶原分泌,提示水飞蓟宾可能通过阻抑CTGF表达及减少细胞外基质的积聚,具有潜在的抗肾纤维化作用。     

MAPK抑制因子对HSC中Smad2/3磷酸化及Smad4核转位的影响

目的 探究3种丝裂原活化蛋白激酶( MAPK)抑制因子对转化生长因子-β( TGF-β)活化的大鼠肝星状细胞( HSC)中Smad2/3磷酸化及Smad4 核转位的影响. 方法采用Ⅳ型胶原酶和链酶蛋白酶原位肝灌流法分离正常大鼠HSC并传代培养,分别用细胞外信号调节激酶( ERK)、c-Jun氨基末端激酶( JNK )、p38 抑制因子( PD98059、SP600125、SB203580 )与HSC共同培养,再加入TGF-β1活化细胞,采用免疫沉淀和 Western blot 法检测 pSmad2C、pSmad2L、pS-mad3L蛋白表达;采用细胞免疫荧光法检测Smad4 蛋白表达及细胞内定位情况. 结果 Western blot显示静息状态下HSC几乎不表达 pSmad2C 而低表达 pSmad2L、pSmad3L, TGF-β1刺激后显著上调上述磷酸化蛋白表达, p38 抑制因子(1、3 μmol/L)、ERK 抑制因子(1 μmol/L)对 Smad2C、Smad2L、Smad3L 磷酸化无显著影响;p38 抑制因子( 10μmol/L)降低了 pSmad3L 蛋白表达;ERK 抑制因子( 3、10μmol/L)降低了pSmad2C蛋白表达;JNK抑制因子(1、3、10μmol/L)减少了 pSmad2C、pSmad2L、pSmad3L 蛋白表达.TGF-β1刺激可明显诱导Smad4核转位,而3种MAPK抑制因子不同程度地抑制TGF-β1 诱导的Smad4 转位入核. 结论 在 HSC 细胞中 TGF-β1 可能通过活化 JNK 通路促进Smad2/3磷酸化,活化ERK、JNK、p38 通路促进Smad4 核转位.     

水通道蛋白11参与马兜铃酸损伤人肾小管上皮细胞的体外实验

目的:探讨马兜铃酸(AA)对人肾小管上皮细胞(HK-2)损伤机制及水通道蛋白11(AQP11)在损伤过程中的作用。方法:将不同浓度的AA(10、20、40μg/ml)作用于体外培养的HK-2细胞,用四甲基偶氮唑盐法(MTT)选择最适浓度AA;用AQP11过表达质粒转染至HK-2细胞并验证,用以观察AQP11是否对AA诱导HK-2细胞转分化具有保护作用。予未转染及转染HK-2细胞分别加入最适浓度AA培养48 h,用ELISA法检测细胞上清液中转化生长因子-β1(TGF-β1)含量,Real-time PCR检测AQP11 mRNA表达,Western印迹法检测AQP11、结缔组织生长因子(CTGF)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达。结果:MTT法筛选出的AA最适浓度为20μg/ml;转入质粒过表达AQP11培养48 h后AQP11的表达量显著高于空白组(P0.01),提示转染成功。加入20μg/ml AA后,ELISA检测显示,未转染组的TGF-β1表达量较空白组明显上升(P0.05),至48 h达高峰(P0.01),而转染APQ11质粒组则明显低于未转染组(P0.05);PCR检测显示,未转染组AQP11 mRNA的表达量逐渐降低,至72 h显著低于空白组(P0.05),而转染组虽低于空白组(P0.05),但略高于未转染组(P=0.137);Western印迹法检测显示,未转染组α-SMA、CTGF蛋白表达较空白组明显上升(P0.01)、AQP11蛋白逐渐降低(P0.05),转染组48 h的α-SMA、CTGF蛋白表达量均较空白组有所提高(P=0.874,P=0.696),但显著低于未转染组(P0.01)。结论:AA可抑制HK-2细胞增殖,诱导细胞纤维化、坏死;过表达AQP11蛋白可以抑制AA作用下的细胞纤维化发生发展,AQP11表达调控异常可能是AAN的一个重要发病机制。     

PI3K抑制剂对转化生长因子β1诱导人肾小管上皮细胞Smad泛素化调节因子2表达的影响

目的探讨体外条件下转化生长因子β1(TGF-β1)对人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)表达Smad泛素化调节因子2(Smurf2)的诱导情况,以及PI3K抑制剂LY294002对其的影响。方法应用RT-PCR法检测Smurf2 mRNA的表达,应用Western印迹法检测Smurf2蛋白的表达。结果HK-2细胞有基础量的Smurf2 mRNA和蛋白的表达,TGF-β1呈时间和剂量依赖性增加HK-2细胞Smurf2 mRNA和蛋白的表达(P<0.01)。PI3K抑制剂LY294002呈剂量依赖性抑制TGF-β1(100pM)所诱导的HK-2细胞Smurf2 mRNA和蛋白的表达(P<0.01)。结论在体外,TGF-β1可能通过PI3K/AKT通路诱导HK-2细胞Smurf2 mRNA和蛋白的表达。PI3K抑制剂LY294002可抑制Smurf2 mRNA和蛋白的表达。     

硫化氢对TGF-β1诱导的HK-2细胞上皮间充质转化的抑制作用

目的:观察硫化氢(H2S)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人近端肾小管上皮细胞转分化的影响,并初步探讨其作用的可能机制。方法:以体外培养的HK-2细胞为研究对象,分别用10μg/LTGF-β1、100μmol/LNaHS(H2S的供体)及2者联合作用进行干预,以正常培养的细胞作正常对照。孵育0、15、30及60min后,Westernblot检测4组细胞磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)和Smad2蛋白的表达;孵育48h后,观察细胞形态变化,Westernblot检测4组细胞E-cadherin、α-SMA蛋白的表达。结果:与正常对照组比较,TGF-β1组细胞发生梭形变,E-cadherin蛋白表达下降(F=1262.535,P<0.001),α-SMA蛋白表达上调(F=1456.030,P<0.001);NaHS+TGF-β1组细胞发生梭形变的程度较TGF-β1组明显减轻,E-cadherin蛋白表达增加(F=65.330,P<0.001),α-SMA蛋白表达下降(F=288.300,P<0.001)。TGF-β1组细胞在15、30及60min时p-Smad2/3表达均较正常对照组增加,而NaHS+TGF-β1组细胞p-Smad2/3的表达较TGF-β1组降低(P<0.05)。结论:H2S可抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞转分化,该作用可能部分通过影响Smad2/3磷酸化程度来完成。     

GSK3β促进TGF-β1诱导的肾小管上皮HK-2细胞纤维化

目的阐明GSK3β对于肾脏小管间质纤维化的作用。方法以TGF-β1诱导的体外肾小管间质纤维化模型为研究对象,以GSK3β特异抑制剂LiCl处理细胞和不同GSK3β表达质粒(野生型GSK3β表达质粒GSK3β-WT;第9位点上丝氨酸突变为丙氨酸,由此不能再被磷酸化失活而具有固有活性的GSK3β突变质粒GSK3β-S9A;第85、86位点上赖氨酸突变为丙氨酸、失去激酶活性的GSK3β突变质粒GSK3β-KD)转染细胞,观察肾脏纤维化的标志性分子纤维连接素蛋白(fibronectin,FN)表达水平的改变,以及对TGF-β/Smad信号通路的作用。结果 LiCl增加HK-2细胞GSK3β的磷酸化,抑制GSK3β的活性,同时降低了细胞基础水平和TGF-β1诱导的FN表达。过表达的GSK3β-WT增强TGF-β1诱导的FN表达,而这种效应在GSK3β-S9A转染细胞更为显著。过表达GSK3β-KD抑制TGF-β1诱导的FN表达。分析对TGF-β/Smad信号通路的作用,LiCl可以抑制TGF-β1诱导的Smad3磷酸化,而对Smad2磷酸化水平无影响。同时,LiCl也不改变Smad3的总蛋白表达。结论 GSK3β通过TGF-β1/Smad3信号通路促HK-2细胞纤维化,抑制GSK3β可以抗纤维化。     

尿酸对人肾小管上皮细胞HK-2纤维化相关调控因子的影响

目的观察不同浓度尿酸对人肾小管上皮细胞（HK-2）相关纤维化调控因子的影响,探讨建立尿酸诱导的人肾小管上皮细胞纤维化模型,为尿酸性肾纤维化疾病的研究提供细胞模型。方法以不同浓度的尿酸刺激HK-2细胞6,12,24,36h,MTT检测细胞活性抑制率;Real-TimePCR检测TGF-β1、CTGF、α—SMAmRNA的表达,观察尿酸对HK-2细胞的促纤维化作用;26mg／dL浓度尿酸刺激HK-2细胞24h,免疫组织化学检测TGF-β1、CTGF、α—sMA蛋白的改变。结果尿酸刺激后细胞活性抑制率与对照组比较明显升高（P＜0．05）,呈时间依赖性;尿酸刺激后TGF-β1、CTGF、α-SMA的表达量与对照组比较明显增加（P〈0．05）,并呈剂量依赖性;尿酸刺激后TGF-β1、CTGF、α—SMA蛋白的表达量与对照组比较明显增加（P〈0．05）。结论尿酸可抑制HK-2细胞增殖;采用尿酸诱导HK-2细胞,可建立肾纤维化的细胞模型。     

Basigin/CD147参与马兜铃酸损伤人肾小管上皮细胞的体外实验

目的:探讨马兜铃酸(AA)对人肾小管上皮细胞损伤机制及细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(Basigin/CD147)在损伤过程中发挥的作用。方法:不同浓度AA(10、20、40μg/ml)作用于人近端肾小管上皮细胞(HK-2)不同时间(24、48 h)后,MTT比色法检测细胞增殖变化;Basigin/CD147干扰质粒转染HK-2,选取AA最适浓度(20μg/ml),ELISA法检测不同时间段(24、48 h)细胞上清液中转化生长因子-β1(TGF-β1)含量;实时定量(Real-time)PCR法检测Basigin/CD147 mRNA表达;Western印迹检测Basigin/CD147、TGF-β1和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达。结果:AA 48 h组TGF-β1含量显著高于空白组(P0.05),siRNA+AA 48 h组TGF-β1低于48 h AA组(P0.05);AA48 h组Basigin/CD147 mRNA含量显著高于空白组(P0.05),siRNA+AA 48 h组Basigin/CD147 mRNA显著低于48 h AA组(P0.05);AA 48 h组Basigin/CD147、α-SMA、TGF-β1蛋白表达明显高于空白组(P0.05),siRNA+AA 48 h组Basigin/CD147、α-SMA、TGF-β1蛋白表达均显著低于48 h AA组(P0.01)。结论:Basigin/CD147参与介导AA所致HK-2细胞损伤过程,干扰Basigin/CD147表达可能抑制AA引起的细胞纤维化;Basigin/CD147蛋白表达调控异常可能是引起马兜铃酸肾病的重要发病机制之一。     

AM12质粒对体外肾小管上皮细胞凋亡和分泌转化生长因子-β_1的影响

目的观察AM12质粒(含乙型肝炎病毒3.2 kb全基因组)对体外培养的人近端肾小管上皮细胞HK-2凋亡和分泌转化生长因子-β1(TGF-β1)的影响。方法以体外培养的HK-2细胞为对象,以AM12质粒转染HK-2细胞为转染组,以正常HK-2细胞作为对照组,用流式细胞仪检测细胞的凋亡及Fas表达率;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测上清液中TGF-β1的浓度。结果转染组HK-2凋亡率为(1.49±0.02)%,高于对照组的(1.03±0.09)%(P<0.05);Fas表达率为(10.09±2.34)%,高于对照组的(6.58±0.65)%(P<0.05);上清液TGF-β1水平为(283.85±61.12)ng.L-1,高于对照组的(210.28±47.21)ng.L-1(P<0.05)。结论 HBV-DNA质粒转染体外培养的人肾小管上皮细胞可诱导其凋亡并上调其对TGF-β1的分泌。     

枸杞多糖改善肾小管上皮细胞间质纤维化的研究

目的 探讨枸杞多糖(LBP)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导肾小管上皮细胞间质纤维化的影响及其作用机制。方法 体外培养人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2),分为对照组、TGF-β1组和LBP+TGF-β1组。TGF-β1组细胞给予10 ng/mL TGF-β1,处理24h; LBP+TGF-β1组细胞给予10 ng/mL TGF-β1处理24 h后,再给予20 mmol/L LBP干预24 h;对照组细胞不做任何处理。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测Vimentin,纤连蛋白(FN),Snail和E-adherin的mRNA表达水平;通过RT-qPCR和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测胶原蛋白Ⅰ(ColⅠ)和胶原蛋白Ⅲ(ColⅢ)的表达;通过Western blot检测细胞中TGF-β1和smad3的表达水平。结果 RT-qPCR结果表明与对照组相比,TGF-β1组HK-2细胞Vimentin、FN、Snail的mRNA表达水平显著升高(P<0.05),E-adherin mRNA的表达水平显著降低(P<0.05);α-SMA、Col I和Col II...     

TGF-β1对肾小管上皮细胞炎症相关趋化因子表达的影响

目的观察转化生长因子β1(TGF-β1)对肾小管上皮细胞炎症相关趋化因子表达的影响,探讨其在肾间质炎症进展中的作用。方法体外培养人近端肾小管上皮细胞系(HK-2),用不同浓度(0~10 ng/mL)TGF-β1刺激24 h或用5 ng/mL TGF-β1刺激不同时间(0~48 h),荧光定量PCR技术和ELISA方法分别检测趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白介素-8(IL-8)、正常T细胞活化后表达和分泌调节蛋白(RANTES)的mRNA和蛋白表达的变化。结果TGF-β1能诱导HK-2细胞MCP-1、IL-8、RANTES的表达上调,且呈剂量和时间依赖效应。2 ng/mL TGF-β1作用24 h即可诱导MCP-1和IL-8 mRNA明显升高,5 ng/mLTGF-β1作用时达高峰。MCP-1和IL-8蛋白分泌分别于刺激后36 h和24 h达高峰。2 ng/mL和5 ng/mL TGF-β1均可诱导RANTES mRNA明显升高,2 h时RANTES mRNA表达开始升高,24 h达高峰;RANTES蛋白基础分泌水平极低,TGF-β1作用24 h时RANTES蛋白分泌开始升高,36 h达高峰。结论TGF-β1诱导能明显上调趋化因子MCP-1、IL-8和RANTES的mRNA表达和蛋白分泌。因此,有效干预TGF-β1诱导的趋化因子的表达可能成为减轻肾间质炎症的途径之一。     

TGF-β1对肾小管上皮细胞炎症相关趋化因子表达的影响

目的 观察转化生长因子β1(TGF-β1)对肾小管上皮细胞炎症相关趋化因子表达的影响,探讨其在肾间质炎症进展中的作用.方法 体外培养人近端肾小管上皮细胞系(HK-2),用不同浓度(0～10 ng/mL)TGF-β1刺激24 h或用5 ng/mL TGF-β1刺激不同时间(0～48 h),荧光定量PCR技术和ELISA方法分别检测趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白介素-8(IL-8)、正常T细胞活化后表达和分泌调节蛋白(RANTES)的mRNA和蛋白表达的变化.结果 TGF-β1能诱导HK-2细胞MCP-1、IL-8、RANTES的表达上调,且呈剂量和时间依赖效应.2 ng/mL TGF-β1作用24 h即可诱导MCP-1和IL-8 mRNA明显升高,5 ng/mLTGF-β1作用时达高峰.MCP-1和IL-8蛋白分泌分别于刺激后36 h和24 h达高峰.2 ng/mL和5 ng/mL TGF-β1均可诱导RANTES mRNA明显升高,2 h时RANTES mRNA表达开始升高,24 h达高峰;RANTES蛋白基础分泌水平极低,TGF-β1作用24 h时RANTES蛋白分泌开始升高,36 h达高峰.结论 TGF-β1诱导能明显上调趋化因子MCP-1、IL-8和RANTES的mRNA表达和蛋白分泌.因此,有效干预TGF-β1诱导的趋化因子的表达可能成为减轻肾间质炎症的途径之一.     

叉头框蛋白O3a表达下调对人肾小管上皮细胞EMT的影响

目的:研究叉头框蛋白O3a(forkhead box protein O3a,Fox O3a)下调对人肾小管上皮细胞(HK-2)上皮-间质转化(EMT)的影响和机制。方法:体外培养HK-2细胞,10 ng/m L TGF-β1诱导HK-2细胞建立EMT细胞模型,Western blot检测E-cadherin、α-SMA表达,证明细胞EMT模型建立成功。Western blot检测在EMT细胞和正常细胞中转录因子Fox O3a的表达变化。敲低正常HK-2细胞中的Fox O3a后,Western blot检测细胞的EMT程度。Western blot检测EMT细胞与低表达Fox O3a细胞中β-Catenin的表达变化。结果:TGF-β1处理HK-2细胞作用后E-cadherin表达量显著减少(P0.01),α-SMA蛋白表达量明显增加(P0.05),证明EMT细胞模型建立成功。与正常HK-2细胞相比,EMT细胞中转录因子Fox O3a显著减少(P0.01)。敲低HK-2细胞中的Fox O3a后,E-cadherin表达量显著减少(P0.01),α-SMA蛋白表达量明显增加(P0.05),出现EMT现象。相比于正常细胞,EMT细胞的β-Catenin表达增加(P0.05);Fox O3a敲低的细胞中β-Catenin表达也显著增加(P0.01)。结论:HK-2细胞通过降低转录因子Fox O3a的表达,从而上调β-Catenin,促进细胞上皮-间质转分化。