利用CRISPR/Cas9慢病毒载体构建敲除大鼠肝星状细胞COX-2基因的细胞模型

目的通过构建CRISPR/Cas9慢病毒载体,转染HSC-T6细胞,获得能稳定表达Cas9蛋白的HSC-T6细胞和COX-2基因缺陷的HSC-T6-COX-2-/-细胞,为后期的功能研究提供良好的工具和手段,为临床上治疗肝纤维化提供新策略。方法设计合成COX-2基因特异性的sgRNA(COX-2-sgRNA-1、COX-2-sgRNA-2、COX-2-sgRNA-3),并将其连接至GV371载体上,提取重组后的质粒,将其与包装质粒共同转染到293T细胞,形成慢病毒颗粒,荧光法检测病毒滴度。按照MOI值计算病毒最适用量,先将Lenti-Cas9-puro转染至HSC-T6细胞,嘌呤霉素筛选得到HSC-T6-Cas9细胞,再用Lenti-COX-2-sgRNA-EGFP转染至HSC-T6-Cas9细胞获得HSC-T6-COX-2-/-细胞,通过Cruiser酶切检测及Western Blot等方法在基因和蛋白水平上进行敲除验证。计量资料多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果通过测序验证COX-2-sgRNA表达载体构建成功。重组表达质粒和包装质粒共同转染到293T细胞,形成慢病毒颗粒,荧光法检测病毒滴度均在1×108以上。成功构建能稳定传代的Cas9蛋白的HSC-T6细胞和COX-2基因缺陷的HSC-T6-COX-2-/-细胞模型。HSC-T6-Cas9细胞中LV-Cas9-Puro mRNA相对表达量(541.93±105.76)高于CON组细胞(1.00±0.02),差异具有统计学意义(t=12.995,P<0.01)。通过Cruiser酶切检测及Western Blot试验,结果提示CRISPR/Cas9慢病毒表达载体能在靶点起作用,其中COX-2-sgRNA-2敲除作用最明显,并且COX-2蛋白表达水平较CON组和NC组相比显著下降(P值均<0.05),提示COX-2-sgRNA有活性。结论成功构建了针对COX-2靶基因的CRISPR/Cas9慢病毒载体,获得稳定的COX-2基因敲除的HSC-T6-COX-2-/-细胞。     

CRISPR/Cas系统在病原体检测方面的研究进展

规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR-associated, CRISPR/Cas)是一种广泛存在于细菌和古细菌内部的特有的适应性免疫系统,用于抵抗外来核酸入侵。目前,该系统被分为6个类型和22个亚型,常见被应用于核酸检测的Cas9、Cas12和Cas13分别属于II型、V型和VI型。根据世界卫生组织的标准,理想的病原体检测方法应该具备灵敏、特异、快速、低成本、易于使用和无需大型设备等特点,而CRISPR/Cas的特性使其在病原体检测方面显示出了巨大的潜力。本文主要总结了Cas9、Cas12、Cas13和Cas14在病原体检测中的应用,并对CRISPR/Cas未来的应用前景进行了展望。     

利用CRISPR-Cas9技术构建微小核糖核酸-551b基因敲除小鼠模型

目的：利用成簇规律性间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR）相关蛋白9(CRISP associated protein 9,Cas9)技术构建微小核糖核酸-551b(mi R-551b)基因敲除小鼠模型。方法：选择健康C57BL/6J小鼠,针对mi R-551b外显子1区域,设计导向RNA(guide RNA,g RNA),构建Cas9载体质粒,将体外转录的Cas9 RNA及g RNA显微注射入小鼠的受精卵并体外培养。将培养合格的胚胎移植到代孕小鼠的输卵管中,待小鼠生育后得到F0代小鼠,使用基因测序确定基因敲除情况,与野生型小鼠繁育后,得到F1代杂合小鼠,F1代小鼠经自交繁育获得F2代小鼠,F3代小鼠由F2代纯合小鼠自交获得,采用电泳鉴定小鼠基因型,RT-PCR检测F3代小鼠组织mi R-551b的表达。结果：利用CRISPR/Cas9技术构建模型小鼠得到F0代小鼠,通过测序筛选出缺失目标序列的F0代杂合子小鼠。与WT小鼠繁育后,琼脂糖凝胶电泳及测序筛选出F1代杂合小鼠,同样...     

青海省海西州鼠疫自然疫源地分离鼠疫菌株CRISPR基因分型研究

目的 利用DNA规律聚集簇间隔短回文重复序列(Clustered regularlyinter-spaced short palindromic repeats CRISPR)分型方法,全面探索海西地区分离鼠疫菌株是否存在新的基因型,为鼠疫菌溯源鉴定及流行病学分析提供理论依据。方法 分离培养海西地区1961-2009年间取自鼠疫患者、媒介昆虫及中间宿主的50株鼠疫菌后提取其DNA,利用PCR技术,对鼠疫菌CRISPR分型中的YPa、YPb、YPc 3个位点进行扩增,测定其扩增产物核酸序列并进行分析,将测得CRISPR序列与文献最新报道的CRISPR Dictionary和NCBI数据库进行比对,找出新的CRISPR spacer阵列,基因型别,分析其进化关系,最终确定青海省海西州喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地鼠疫菌株的CRISPR基因库。结果 50株鼠疫菌在3个CRISPR位点上共有24种spacer,其中YPa位点上有13种、YPb位点8种、YPc位点3种,b51是新发现的spacer。50株鼠疫菌可被分为16个基因型,共归为6大CRISPR类群。Ca35′是该地区主要流行类群;Ca7是...     

利用CRISPR/Cas9技术构建ALK7LoxP/LoxP小鼠品系

目的利用CRISPR/Cas9技术将LoxP序列靶向导入小鼠活化素受体样激酶7(ALK7)基因,构建ALK7LoxP/LoxP小鼠,与组织特异性Cre小鼠杂交,获得时空特异性ALK7基因敲除小鼠,为研究ALK7在特定时间特定组织中的功能奠定基础。方法利用CRISPR/Cas9技术编辑小鼠ALK7基因:设计合成识别ALK7基因外显子4-6上下游非编码序列的sg RNA。设计并合成LoxP-ALK7-LoxP打靶载体,测序正确后,显微注射法将体外合成的sg RNA、Cas9 m RNA和打靶载体注射到小鼠受精卵,移植受精卵至假孕小鼠输卵管代孕。获得仔鼠后通过PCR、Southern blot鉴定子代小鼠基因型,实时荧光定量PCR、Western blot检测ALK7转录表达水平。结果获得了含有目的基因的打靶阳性小鼠,并且插入的LoxP序列不影响ALK7的转录表达水平。结论利用CRISPR/Cas9技术成功将LoxP序列靶向引入小鼠ALK7基因,成功构建ALK7LoxP/LoxP小鼠品系,为进一步构建组织特异性ALK7基因敲除小鼠模型奠定了基础。     

大肠埃希菌CRISPRs间隔序列的来源研究北大核心CSCD

目的研究大肠埃希菌全基因组中规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPRs)的间隔序列分布及来源规律。方法通过BLAST、CRISPRs finder、ClustalX和CRISPRTarget分析CRISPR/Cas、间隔序列及其来源。结果 203株大肠埃希菌中74.4%含有I-E CRISPR/Cas,9.4%含有I-F CRISPR/Cas,17.2%存在CRISPR3-4;CRISPR1,CRISPR2,CRISPR3和CRISPR4的间隔序列数目范围分别为1-25、1-27、4-7和2-22;其独特间隔序列数目分别为339、346、57和66。CRISPRTarget分析I-E和I-F CRISPR/Cas的间隔序列分别匹配816条质粒和293条噬菌体,2 428条质粒和139条噬菌体,差异有统计学意义(χ~2=319.30,P<0.01)。结论大肠埃希菌中CRISPR/Cas分布广泛,I-E和I-F CRISPR/Cas可能发挥不同的免疫功能。     

应用CRISPR/Cas9技术制备阿尔茨海默病小鼠模型

目的敲除α7烟碱型胆碱能受体(α7nAChR)基因构建阿尔茨海默病(AD)小鼠模型,验证成年敲除(KO)鼠是否有AD表征。方法利用CRISPR/Cas9技术,针对α7nAChR基因靶序列设计单链向导RNA(sgRNA),将sgRNA和Cas9 mRNA显微注射到C57BL/6J小鼠受精卵。通过检测DNA序列,鉴定和筛选出KO小鼠进行行为学测试。结果 KO鼠α7nAChR基因有531 bp片段敲除;与野生型(WT)组相比,KO组有高架十字迷宫开壁区活动时间短、条件性恐惧表现出僵直时间百分比增高的趋势,但差异无统计学意义(P0.05)。结论成功制备AD模型鼠,成年KO鼠学习记忆功能正常,但有焦虑样行为趋势。     

规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白系统在传染病病原体核酸检测中的应用

作为新一代的基因编辑技术,规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated...     

呼吸道感染病原体检测技术与发展趋势

［摘要］　由于传统呼吸道病原体检测手段的限制,导致临床诊断难、治疗用药难。呼吸道感染多联检产品时效性高,可及早识别感染,并指导抗感染药物的合理使用。各种便携式（快速）诊断技术产品发展迅速,临床应用前景广阔。宏基因组二代测序技术（mNGS）对呼吸道感染病原体的检测覆盖面广、信息量大,对呼吸道病原体的早期发现,特别是新发传染病的病原体快速诊断,起到非常重要的作用。基于规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）的核酸检测技术、三代测序技术及基因芯片技术等快速检测新技术为呼吸道病原体的诊断开辟了新的方向。     

利用CRISPR/Cas9技术构建FSTL1基因敲除的SiHa细胞稳定株

目的利用CRISPR/Cas9技术敲除SiHa细胞中的卵泡抑素样蛋白1(FSTL1)基因,构建FSTL1基因敲除的SiHa细胞稳定株。方法构建sgRNA-FSTL1重组质粒并包装成慢病毒。收集病毒液并感染SiHa细胞,使用嘌呤霉素筛选FSTL1基因敲除的SiHa细胞稳定株;采用RT-qPCR和Western blot检测SiHa细胞稳定株FSTL1 mRNA和蛋白的表达情况。结果 FSTL1-sgRNA慢病毒构建成功并筛选出FSTL1基因敲除的SiHa细胞稳定株;FSTL1的mRNA和蛋白表达水平在SiHa细胞稳定株中的表达量均比对照组低,差异有统计学意义(P0.05)。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建FSTL1基因敲除的SiHa细胞稳定株。     

利用CRISPR/Cas9构建敲除小鼠模型研究PPP2R3A基因对心脏功能的影响

目的 应用CRISPR/Cas9技术构建蛋白磷酸2调节亚基B″家族α亚型(PPP2R3A)基因敲除小鼠,从分子水平及组织水平上研究PPP2R3A缺失对心脏的影响。方法 将Cas9 mRNA和两个靶向PPP2R3A第3外显子翻译起始密码子附近区域的单导向RNA微注射到C57BL/6小鼠受精卵中。小鼠出生后取其基因组DNA进行聚合酶链反应(PCR)和测序以鉴定基因型,鉴定后,基因PPP2R3A缺失型小鼠为KO组,野生型C57BL/6小鼠为WT组(雄性3只,雌性2只)。小鼠心脏组织经甲醛固定并制成切片后分别进行苏木素-伊红(HE)染色和免疫组织化学染色。提取小鼠心脏组织总RNA和蛋白,应用荧光定量PCR和Western印迹验证基因敲除小鼠的有效性和检测互作蛋白表达。结果 获得F1代PPP2R3A杂合小鼠,PCR和测序结果表明突变小鼠的基因型存在113 bp的缺失突变。与WT组相比,KO组心脏组织中PPP2R3A mRNA和蛋白表达量明显下降(均P<0.05),参与心脏发育的G蛋白信号转导调控因子(RGS)19表达量明显升高(P<0.05)。PPP2R3A蛋白表达受损引起了心脏组织...