利巴韦林对病毒性心肌炎的疗效及机制的实验研究

目的研究利巴韦林对小鼠病毒性心肌炎(VM)的疗效及机制。方法将Balb/c小鼠120只随机分为A组:空白对照组、B组:病毒对照组、C组:利巴韦林治疗组,B、C组接种0.2mL(10-7.5Tcid50/mL)柯萨奇B3(CVB3)病毒液,接种后d7、14、21、28分别处死10只,观察小鼠病死率、心肌光镜和电镜检查病理变化,计算心肌病理积分,检测心肌病毒滴度、血清肌钙蛋白I(cTnI)、血清丙二醛(MDA)、心肌细胞凋亡率(CMAR)。结果治疗组小鼠病死率、心肌病毒滴度、心肌病理积分、血清cTnI显著低于病毒对照组,血清MDA、CMAR无显著性差异。结论利巴韦林对小鼠VM有较好疗效,其机制主要是降低心肌病毒滴度,从而降低血清cTnI,减轻心肌病变。     

静脉滴注人血免疫球蛋白对病毒性心肌炎心肌细胞凋亡与坏死的影响

目的　研究静脉滴注人血免疫球蛋白 (IVIG)对病毒性心肌炎 (VM)小鼠心肌细胞凋亡与坏死的影响。方法　将 32 0只Balb/c小鼠随机分为 8组 ,治疗组分别在接种病毒后不同时间予以不同疗程的IVIG治疗 ,并与黄芪治疗作对比。测定心肌病毒滴度、心肌细胞凋亡率和坏死率 ,计算心肌病理组织学积分。结果　各IVIG治疗组上述 3项指标均明显低于病毒对照组(P均 <0 .0 5)和黄芪治疗组 (P均 <0 .0 1 ) ,以早期长程治疗组最低。结论　IVIG能降低VM小鼠心肌细胞凋亡率、坏死率及心肌病毒滴度 ,疗效优于黄芪。     

病毒性心肌炎不同时点血管内皮细胞生长因子mRNA的表达

目的 探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)在BALB/c小鼠感染柯萨奇病毒B3(CVB3)所致病毒性心肌炎(VM)病程中的作用.方法 取BALB/c小鼠70只,随机分为VM组60只,腹腔感染CVB3,分别于实验第3、7、10、14、18、21天取心肌组织;正常组10只,于实验第21天取心肌组织.用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测其心肌组织VEGF mRNA的表达.结果 病毒性心肌炎小鼠心肌VEGF mRNA表达较正常组高,且在感染病毒后表达渐增高,14 d达最高峰,其后表达降低,但仍维持一较高水平,与正常组比较仍有统计学意义(P<0.01).VEGF mRNA表达与心肌病理损害程度密切相关.结论 VEGF可能参与BALB/c小鼠病毒性心肌炎的病理生理过程.     

黄芪和大青叶治疗小鼠病毒性心肌炎的对比研究

目的：通过中药单剂黄芪、大青叶治疗小鼠病毒性心肌炎(VM C)的疗效观察,探讨VMC的有效治疗措施。方法：Balb/C小鼠给予柯萨奇病 毒B3(CVB3)稀释液腹腔注射后,随机分为感染对照组、黄芪治疗组和大青叶治疗组,于CVB3 感染后第3,5,7,10,14,21天分批处死,作HE染色,比较各组小鼠心肌病变积分,并行 心肌组织病毒分离。于感染后第7天各组小鼠电镜观察心肌细胞超微结构改变。结果：黄芪治疗组自CVB3感染后第5～21天、大青叶治疗组在CVB3感染后第5天和7天时,其心肌病变积分较感染对照组明显减轻(P＜0.05)。而大青叶治疗组CVB3感染后 第10～21天心肌病变积分与感染对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。电镜观察发 现感染对照组小鼠心肌细胞线粒体肿胀、嵴断裂、肌浆网扩张、肌丝溶解,治疗组上述病变轻,且大青叶治疗组可见大量溶酶体。病毒分离结果显示3组小鼠CVB3感染后第3天即可分离 出病毒,阳性率均为66.7%,第5～10天3组均为100%,第14天感染组病毒分离阳性率为33.3%,治疗组均未分离到病毒,第21天时3组均未分离出病毒。不同时间点的3组间病 毒分离阳性率差异无显著性(P>0.05)。结论：黄芪具有保护心肌 的作用。大青叶在CVB3感染早期对VMC的病理改变具有显著影响。     

CD_(40) Ig融合蛋白阻断共刺激信号通路对病毒性心肌炎小鼠的治疗作用

目的探讨CD40Ig融合蛋白(简称CD40Ig)对柯萨奇B3病毒(CVB3)所致病毒性心肌炎(VMC)小鼠死亡率、心肌病理改变和病毒复制的影响。方法106只4～6周龄健康雄性BALB/c小鼠,体质量12～16 g,随机分为CD40Ig组(16只)、病毒组(40只)、IgG组(40只)及正常对照组(10只)。CD40Ig组、病毒组和IgG组小鼠腹腔注射半数组织细胞感染量(TCID50)为10-3L-1的CVB30.15 mL,正常对照组小鼠接种0.15 mL不含病毒的Eagle液。CD40Ig组、IgG组小鼠于接种病毒后6 h、72 h分别注射CD40Ig(0.1 mg.kg-1)及IgG(0.1 mg.kg-1)。接种病毒后第7天处死所有小鼠。在光镜下观察其心肌病理变化,并计算心肌病理组织学积分;采用实时荧光定量PCR检测其心肌组织中CVB3mRNA的表达;采用免疫组织化学法检测其心肌组织中CD40蛋白表达。结果1.与病毒组比较,CD40Ig组小鼠死亡率降低(80.0%vs50.0%,P<0.05)、心肌病理组织学积分下降[(8.88±2.95)分vs(3.42±1.21)分,P<0.05]、心肌CVB3mR...     

FTY720对柯萨奇B3病毒感染大鼠心肌细胞的保护作用及信号转导机制研究

目的　观察新型免疫抑制剂FTY72 0对病毒性心肌炎 (VM)的保护作用 ,探讨其治疗VM的分子机制。方法　建立实验性VM模型。采用Westernblot法分别测定ERK1 / 2蛋白 ,磷酸化ERK1 / 2 (P ERK1 / 2 )的表达变化。结果　FTY72 0能明显减少柯萨奇B3病毒 (CVB3)感染后心肌酶释放 ,心肌细胞搏动较病毒感染组维持时间长 ,心肌细胞病变发展亦较缓慢 ,病毒滴度显著低于病毒感染组。而且感染CVB3后FTY 72 0治疗组的心肌细胞内P ERK1 / 2活性持续降低。结论　FTY72 0对CVB3病毒感染的乳鼠心肌细胞有明显的保护作用 ,它可以通过抑制ERK1 / 2信号通路使病毒复制能力降低 ,从而抑制CVB3基因的表达和复制。     

黄芪甲甙对病毒性心肌炎小鼠心肌组织蛋白酶B mRNA表达的影响

目的探讨黄芪活性成分黄芪甲甙对病毒性心肌炎(VM)小鼠心肌中组织蛋白酶B(cathepsinB,CB)mRNA表达的影响。方法Balb/c小鼠100只随机分为6组。非感染小鼠腹腔无菌注射病毒培养液,分为正常对照组(A组10只,以羧甲基纤维素钠0.1mL灌胃7d)、9%黄芪甲甙对照组(B组10只,9%黄芪甲甙0.1mL灌胃7d);余80只小鼠以柯萨奇病毒(CVB3)腹腔无菌注射制作VM模型,VM小鼠随机分为VM对照组和1%、3%、9%黄芪甲甙干预VM组,分别以生理盐水、1%、3%、9%黄芪甲甙0.1mL灌胃7d(分别为C、D、E、F组,每组20只)。14d后处死全部小鼠并取其心脏。采用RT-PCR半定量检测心肌CBmRNA表达水平。结果F组小鼠较C组死亡率明显降低[10%(2/20)vs45%(9/20),χ2=6.14P<0.05],B组无小鼠死亡;与C组比较CBmRNA表达水平及心肌病变积分在F组显著下降,而1%、3%黄芪甲甙对VM小鼠CBmRNA表达及心肌病变积分无明显影响。结论黄芪甲甙可能通过抑制CB表达,对Balb/c小鼠CVB3心肌炎具有良好的治疗作用。     

CD8+T淋巴细胞在病毒性心肌炎发病机制中作用的研究

目的探讨CD8 T淋巴细胞在病毒性心肌炎发病机制中的作用。方法70只4周龄Balb/c健康雄性小鼠随机分为正常对照组(n=15)、病毒感染组(n=55)。正常对照组小鼠腹腔接种不含病毒的Eagle氏液0.15ml,病毒感染组小鼠腹腔接种TCID50为109/ml的CVB3 Nancy株病毒液0.15ml。分别于第7、10、14、21、28天随机取正常对照组小鼠3只,病毒感染组小鼠8只断髓处死。取各组小鼠心肌组织固定、脱水、石蜡包埋,切片后行HE染色、计算心肌病理组织学积分、免疫组化法检测CD8 T淋巴细胞及TUNEL法检测细胞凋亡,光镜下计算CD8 T淋巴细胞数所占浸润细胞数的百分比作为阳性细胞百分率。结果病毒感染组小鼠心肌病理积分、心肌组织中CD8 T淋巴细胞百分率及细胞凋亡率均于第10、14天达高峰(P<0.01);心肌组织中CD8 T淋巴细胞数百分率与心肌病理积分、心肌细胞凋亡率呈显著正相关。结论CD8 T淋巴细胞系小鼠病毒性心肌炎心肌损伤的重要效应细胞,其可能主要通过诱导心肌细胞凋亡而致病。     

柯萨奇病毒B3诱导体外培养心肌成纤维细胞增殖与骨桥蛋白表达

病毒性心肌炎(viral myocarditis,VM)是小儿常见获得性心脏疾病之一,系病毒感染引起的心肌弥漫性或局灶性病变,近年来VM的发病呈上升趋势[1].目前VM的发病机制尚不十分清楚,病毒可引起心肌细胞发生裂解性溶解、细胞凋亡.近来研究发现变异型柯萨奇病毒B3(myocarditic coxsackievirus B3,CVB3)可通过其他受体进入心肌成纤维细胞[2],进入细胞后的CVB3毒力增加并使细胞呈持续感染状态,产生多种细胞因子,最终导致心肌纤维化、扩张性心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)[3-4].     

核因子κB在病毒性心肌炎小鼠发病中的作用

目的 探讨核因子κB(NF-κB)在病毒性心肌炎(VMC)发病机制中的作用.方法 BALB/c小鼠100只,随机分成2组.对照组40只,腹腔注射MEM培养液0.1 ml;病毒组60只,腹腔注射107/ml柯萨奇B3病毒(CVB3)病毒液0.1 ml.两组在接种后第O、4、7、10天取心肌组织用Westem blot法检测心肌细胞核NF-kB的含量,同时测定心肌病毒载量、心肌病理积分.结果 病毒感染后第4、7、10天病毒组心肌细胞核NF-kB的含量明显高于对照组,差异有统计学意义,且与心肌病变积分呈显著正相关(r=0.985、0.965,P＜0.05);第4、7天CVB3载量与心肌病理积分(坏死)呈正相关(r=0.790、0.759,P＜0.05),而第10天无相关性(r=-0.058,P＞0.05).结论 NF-KB在病毒性心肌炎的发病机制中有重要作用;CVB3感染可调节心肌细胞核NF-kB的含量,这种调节作用不依赖于CVB3的复制.     

抗FasL抗体对小鼠病毒性心肌炎作用机制的研究

目的探讨抗FasL抗体对小鼠柯萨奇病毒性心肌炎的治疗作用及作用机制。方法80只BALB／c小鼠随机分为4组：1组为空白对照组、2组为病毒对照组、3组为IgG对照组、4组为抗FasL抗体治疗组。于接种病毒后第10天每组处死小鼠8只,取心脏,分别采用光镜检查心肌组织的病理变化,原位末端标记法（TUNEL）检测心肌细胞凋亡的情况,免疫组化方法检测活化caspase-3的表达,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测心肌组织中caspase-3和CVB,mRNA表达。结果（1）病毒对照组可见活化的caspase-3表达和心肌细胞的凋亡,且均与心肌病变积分成正相关（r=0．81,P〈0．05;r=0．73,P〈0．05）。（2）抗FasL抗体治疗组小鼠心肌组织病变积分、心肌细胞凋亡率、caspase-3蛋白和mRNA表达及心肌细胞内CVB,mRNA表达均明显低于病毒对照组（P〈0．01,P〈0．01,P〈0．01,P〈0．01,P〈0．05）和IgG对照组（P〈0．01,P〈0．01,P〈0．05,P〈0．01,P〈0．05）。结论凋亡是病毒性心肌炎心肌损伤的重要机制之一,抗FasL抗体可降低caspase-3活化和mRNA表达,减少心肌细胞凋亡,降低心肌细胞内病毒复制,使心肌损伤明显减轻。     

TRAIL及其受体DR5在病毒性心肌炎小鼠心肌组织中的表达和意义

目的 研究肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)及其死亡受体5(DR5)在病毒性心肌炎小鼠心肌组织中病变不同时期的表达及与细胞凋亡的关系.方法 建立病毒性心肌炎小鼠模型,于注射病毒后第7、10、14、21、28天取心肌组织,HE染色做心肌病理积分,TUNEL法检测凋亡细胞百分率,免疫组织化学法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测心肌组织中TRAIL和DR5蛋白及mRNA的表达.结果 病毒感染组小鼠和正常对照组小鼠心肌组织中均存在TRAIL和DR5蛋白和mRNA的表达.病毒感染后第14天,病毒感染组小鼠心肌组织中TRAIL蛋白表达高于同期正常对照组(P<0.05)和第7天病毒感染组(P<0.05),组间比较差异有统计学意义(F=9.17,P<0.01).病毒感染后第10、14、21天,病毒感染组小鼠DR5蛋白表达高于同期正常对照组(P<0.01)和第7天病毒感染组(P<0.01),组间比较差异有统计学意义(F=13.32,P<0.01).且TRAIL和DR5蛋白的表达与心肌病理积分、心肌细胞凋亡率密切相关(P<0.05).病毒感染组第10天TRAIL mRNA表达高于同期正常对照组(P<0.01)和第7天病毒感染组(P<0.01),组间比较差异有统计学意义(F=10.86,P<0.01).病毒感染组第10、14天DR5 mRNA表达高于同期正常对照组(P<0.01)和第7天病毒感染组(P<0.01),组间比较差异有统计学意义(F=22.75,P<0.01).结论 病毒性心肌炎小鼠发病中期,TRAIL及其受体DR5在心肌组织中出现高表达,且与病理积分、心肌细胞凋亡率成正相关,TRAIL及其受体DR5可能通过调控心肌细胞凋亡参与病毒性心肌炎的病理过程.     

细胞外信号调节激酶信号转导通路在病毒性心肌炎心肌细胞中的调控作用

目的：细胞外信号调节激酶(ERK)与细胞生长，分化，增殖等生理病理过程有密切关系。该研究通过比较ERK1/2在病毒性心肌炎心肌细胞中表达变化及ERK特异性阻断剂PD98059干预后细胞活性的改变，探讨ERK信号传导通路在病毒性心肌炎早期病毒攻击心肌细胞过程中的作用。方法：取新生SD大鼠，采用酶消化法分离得到心肌细胞。将培养细胞分为对照组，柯萨奇B3(CVB3)感染组，20 μmol/L和50 μmol/L PD98059干预组，后3组用柯萨奇B 3M 株感染。采用Westen blot分别测定ERK1/2，ERK激活后产物(P-ERK1/2)表达变化，采用MTT法检测细胞活性，采用细胞病变法计算细胞病变。结果：4组ERK1/2表达总量差异无显著性；CVB3感染组P-ERK1/2表达为 135.57 ± 0.7 高于对照组的 119.41 ± 1.97 ，差异有显著性( P < 0.01 )。经20 μmol/L或 50 μmol/L PD98059干预后心肌细胞P-ERK1/2 表达为 113.75±1.03，42.56±2.17 比感染组细胞低，差异有显著性(均P<0.01)；其中50 μmol/L PD98059干预组P-ERK1/2表达较20 μmol/L组低(P<0.01)。PD98059干预组心肌细胞活性0.53±0.13，0.41±0.04 明显高于感染组0.17±0.04，差异有显著性(P<0.01)；不同浓度PD98059干预组间心肌细胞活性差异无显著性(P>0.05)。PD98059干预组细胞出现细胞病变的时间较感染组晚，程度较感染组轻，感染面积较感染组小。结论：病毒在攻击心肌细胞时启动了ERK信号通路；PD98059能干预病毒对心肌细胞的感染。     

雷帕霉素对柯萨奇病毒B3诱导的心肌成纤维细胞eIF-4E表达的影响

目的：探讨雷帕霉素对柯萨奇病毒B3诱导的心肌成纤维细胞eIF-4E表达的影响,寻找病毒性心肌炎的药物治疗靶点。方法：选用MOI为0.5 PFU/cell的柯萨奇病毒B3感染心肌成纤维细胞,利用细胞形态及RT-PCR法检测细胞内柯萨奇病毒B3 mRNA表达,确定柯萨奇病毒B3成功感染心肌成纤维细胞。以10nM雷帕霉素干预,采用RT-PCR及Western blot检测对照组、病毒组(MOI为0.5 PFU/cell)、雷帕霉素组及病毒+雷帕霉素组eIF- 4E表达。结果：MOI为0.5 PFU/cell的柯萨奇病毒B3感染心肌成纤维细胞,透射电镜下可见细胞形态改变,胞浆内可见病毒颗粒。RT-PCR结果显示：感染后第1天、第2天、第3天及传代后第2天细胞有病毒mRNA表达。RT-PCR检测上述4组的eIF- 4E /β-actin 光密度比值分别为：0.73±0.07,0.87±0.03,0.32±0.03,0.56±0.04;Western blot灰度值分别为：0.79±0.09,1.35±0.12,0.55±0.04,0.62±0.07;RT-PCR及Western blot结果显示：病毒组eIF- 4E表达高于对照组,雷帕霉素组和病毒+雷帕霉素组低于对照组及病毒组（均P<0.05）。结论：柯萨奇病毒B3可感染心肌成纤维细胞,并使eIF- 4E表达增加,雷帕霉素可抑制其表达,提示心肌成纤维细胞可能通过mTOR/eIF- 4E信号通路参与病毒性心肌炎的发病机制,雷帕霉素对病毒性心肌炎有潜在的治疗作用。［中国当代儿科杂志,2007,9（6）：587-590］     

川芎嗪对柯萨奇B3病毒感染乳鼠心肌细胞的保护作用及信号转导机制研究

目的：临床显示川芎嗪对病毒性心肌炎有治疗作用,但机制不明,该研究拟探讨川芎嗪对病毒感染的心肌细胞的作用及信号转导机制。方法：利用培养的Sprague-Dawley乳鼠心肌细胞,分为空白对照组（心肌细胞正常培养）、阴性对照组（心肌细胞加入川芎嗪至终浓度100 μmol/L后培养）、病毒感染组［心肌细胞感染柯萨奇病毒B3(CVB3)］、川芎嗪干预组(心肌细胞感染病毒后加入终浓度100 μmol/L川芎嗪干预)。观察心肌细胞搏动频率及培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性。采用Western blot测定NF-κB蛋白表达变化,MTT法检测心肌细胞活性。结果：病毒感染组与川芎嗪干预组比较,心肌细胞搏动频率明显降低(32.0±3.6次/min vs 84.3±3.5次/min, P<0.01),细胞病变加重,LDH活性显著升高(P<0.05)。川芎嗪干预组细胞NF-κB蛋白表达明显低于病毒感染组(P<0.01),存活率明显高于病毒感染组［(86.7±2.7）％ vs （35.3±3.4）%, P<0.01］。结论：在病毒性心肌炎时川芎嗪可以抑制NF-κB的表达,起到保护心肌细胞的作用。［中国当代儿科杂志,2009,11（8）：687-690］     

病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡和坏死的研究

目的： 探讨病毒性心肌炎小鼠心肌细胞的凋亡与坏死之间的相互关系。方法：　用4周龄Balb/c雄性小鼠腹腔接种柯萨奇B3病毒 (CVB3)制成病毒性心肌炎小鼠模型 ,采用膜联蛋白V联合PI染色双参数技术(AnnexinV/PI)在流式细胞仪上定量检测心肌细胞的凋亡和坏死。结果：　病毒性心肌炎小鼠心肌细胞的凋亡百分率和坏死百分率均显著高于正常对照小鼠(P<0.01),并且心肌细胞凋亡百分率及坏死百分率均与心肌病理积分呈正相关(r =0.70 ,P<0.01和r=0.93,P<0.01)。结论：　病毒性心肌炎小鼠同时存在着心肌细胞的凋亡和坏死 ,两者均与心肌病理损害程度密切相关,为病毒性心肌炎的重要病理过程     

制造病毒性心肌炎动物模型毒株的比较

目的 比较柯萨奇Ｂ３ｍ株病毒（ＣＶＢ３ｍ）和柯萨奇Ｂ３ａ株病毒（ＣＶＢ３ａ）在实验中引起小鼠心肌炎的发病情况,为心肌炎造模者客观的实验参考。方法 用ＣＶＢ３ｍ和ＣＶＢ３ａ感染Ｂａｌｌ３／ｃ实验小鼠,测定两株平素在鼠心肌细胞中的滴度;用常规病毒理法观察两株病毒致小鼠心肌炎的情况。结果ＣＶＢ３ｍ和ＣＶＢ３ａ感染组小鼠心肌病毒滴度的峰值出现的时间基本相同,ＣＶＢ３ｍ的滴度较高;ＣＶＢ３ｍ感染组小鼠死亡率     

Bcl-2和Bax基因产物在小鼠柯萨奇病毒性心肌炎心肌组织中的表达

目的　探讨Bc1 2和Bax基因在病毒性心肌炎进展中的作用。方法　柯萨奇病毒B3 (CVB3 )感染12 5只雄性Balb/c小鼠 ,分别于d7、10、14、2 1、2 8随机取 2 0只实验组小鼠和 5只对照组小鼠处死 ,采用免疫组织化学方法检测CVB3 病毒性心肌炎小鼠不同时期心肌组织中Bcl 2和Bax蛋白表达情况。结果　病毒性心肌炎发病率为 86 % ,其中 80 %小鼠为轻、中度病变。正常对照组心肌中 ,无Bc1 2蛋白表达。在实验组中Bc1 2蛋白表达的动态变化与心肌病变积分呈显著正相关 (r =0 .93　P <0 .0 1) ,感染后 7～ 14d ,实验组小鼠心肌组织中Bax蛋白表达显著高于正常对照组 (P <0 .0 5 )。少数心肌浸润淋巴细胞表达Bc1 2和Bax。结论　Bc1 2和Bax基因参与病毒性心肌炎细胞凋亡的调控。