重组人干扰素α2b大批量发酵条件的研究

目的 探索大批量发酵生产毕赤酵母菌所表达的重组人干扰素a2b的培养条件并确定诱导时间.方法 选用5L玻璃发酵罐作为人干扰素α2b发酵工艺研究系统,用30L不锈钢发酵罐做验证.探索了培养基中基础盐(Fermentation Basal Salts Medium FBS)的浓度对菌株生物量的积累和重组蛋白表达量的影响,并用确定了利用甲醇进行诱导的时间.结果 培养基中基础盐浓度在FBS原始浓度的60%左右时,菌株的细胞浓度及目的蛋白表达量均最好;诱导39h就可获得高表达.在优化工艺条件下,用30L罐放大,验证方法改进后对人干扰素α2b表达量的影响,此时总蛋白得量为600mg·L-1～800mg·L-1,与过去同样30L罐的表达量相比,增加了30%左右.     

重组人α-2b干扰素发酵及粗提条件的优化研究

目的：探讨从基因工程菌Escherichia coli发酵表达和提取α-2b干扰素的优化方法。方法：采用高密度发酵表达α-2b干扰素,并对发酵培养条件进行优化。用9M尿素提取包涵体,在复性液中加入适量的还原剂,探索提取干扰素的最佳条件。结果：湿菌体平均产量22g/L,生物活性7．92×10~8IU/L。复性后α-2b干扰素纯度达到80%,收率为62%。结论：发酵、提取效果令人满意,收率较高。     

RGD-TRAIL工程菌发酵工艺的摸索研究

经过培养基筛选、培养温度和诱导条件的优化,确定了表达RGD-TRAIL(RGD-TNF related apoptosis inducing ligand)融合蛋白的基因工程菌RT发酵的最佳条件为:TB培养基分别作为RGD-TRAIL的发酵培养基,发酵生长温度控制在37℃,诱导温度控制在25℃,IPTG的最佳诱导浓度为0.8 mmol/L。诱导16 h后目的蛋白表达量到30%,可溶性目的蛋白表达量达15%。并在10 L发酵罐进行验证,确定了发酵工艺。     

重组复合干扰素摇瓶发酵条件的研究

目的对表达重组复合干扰素(con-IFN)的工程菌E.coli DH5α的摇瓶发酵条件进行研究。方法利用单因素比较实验及正交试验等方法考查工程菌摇瓶发酵条件,探讨发酵条件对工程菌的生长和con-IFN表达的影响。结果优化后条件为培养基含玉米粉6%、牛肉膏5.5%、谷氨酸钠0.5%,发酵液初始pH 7.2,30℃培养7 h后升温至42℃诱导表达6 h,转速220r/min,装样量10%,接种量2%。结论优化后平均蛋白质表达量达到36.39%,和LB培养基相比,目的蛋白质表达量提高了4.8%,为工程菌的大规模发酵提供参考。     

重组人凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1在毕赤酵母中表达条件的优化

采用单因子和正交试验对毕赤酵母重组菌株产生人凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(rhLOX-1)的发酵过程进行了优化,确定了最佳发酵条件:0.8%甲醇,1.8%酪蛋白水解物,初始pH 7.0,3×接种量。在此培养条件下,rhLOX-1在毕赤酵母重组菌株中的表达量可超过100 mg/L,比对照提高了1倍以上。本研究为大规模发酵制备rhLOX-1蛋白奠定了基础,更好地满足了LOX-1的理论研究及新药筛选的需要。     

蝎毒镇痛活性肽在毕赤酵母中表达条件的优化

采用单因子和正交试验对毕赤酵母重组菌产生蝎毒镇痛活性肽BmK AngM1的发酵过程进行优化, 确定了最佳发酵条件: 1.2%甲醇, 0.6%酪蛋白水解物, 初始pH 6.0, 3×接种量。在此发酵条件下, BmK AngM1在毕赤酵母重组菌中的表达量可超过500 mg·L^-1, 比对照提高了两倍以上。本研究为大规模发酵制备BmK AngM1奠定了基础, 更好地满足了BmK AngM1的理论研究及新药开发的需要。     

利普司他汀生产菌株发酵工艺的研究

目的 研究Lipstatin发酵配方和培养条件,确定最佳生产工艺。方法 从Lipstatin的摇瓶发酵着手,通过考察pH、碳源、氮源、无机盐、种龄、接种量、温度、发酵时间等因素的影响,优化发酵培养基以及发酵培养条件。结果 最佳初始pH为6.5-7.0;最佳的碳源是丙三醇;最佳的氮源是去脂黄豆粉;对发酵影响最大的无极离子为锌离子;最佳培养温度是30℃;最佳种龄是25h;最佳接种量是4％－6%。结论 采用优化的发酵配方和发酵条件可提高发酵活性单位。     

乳糖诱导表达重组人甲状旁腺激素rhPTH(1-34)

目的研究以乳糖代替异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组人甲状旁腺激素的可行性。方法对乳糖浓度、诱导时间及发酵培养方式进行研究,确定了乳糖诱导的最佳条件。结果 0.6%的乳糖诱导4 h,目的蛋白的表达量约占菌体总蛋白的56.8%,采取分批补料培养方式,5 L发酵罐中蛋白表达量达到42.6%。结论乳糖能作为诱导剂诱导rhPTH(1-34)在大肠杆菌中的表达。     

纤溶酶产生菌株BS-26的发酵工艺优化

目的对纤溶酶产生菌株BS-26发酵工艺进行优化。方法通过单因素试验和正交试验,确定了摇瓶发酵的最佳条件。结果该菌株产纤溶酶最佳的发酵条件为:3%糊精、1%酵母粉、0.02%CaCl2、0.07%MgSO4,初始pH7.0,接种量为6%,装液量为70/250(mL/mL),摇床温度37℃,转速180 r/min,发酵时间60 h,在该条件下产酶酶活可达593.03 U/mL,是原发酵培养条件下产酶活力的4.5倍。结论此发酵条件可以很好地提高纤溶酶的活力,为发酵规模的扩大奠定了基础。     

海洋放线菌Streptomyces parvulus OUCMDZ-2554产放线菌素D的发酵条件优化

目的 对海洋放线菌Streptomyces parvulus OUCMDZ-2554产放线菌素D的发酵条件进行优化,提高放线菌素D的产量。方法 对培养基的组成、种龄、接种量、温度、装液量、pH、盐度和发酵时间等条件的研究,通过单因素和正交试验,选择最优发酵条件;并通过波谱分析及其理化性质确定放线菌素D结构。结果 最佳培养基为：K2HPO4 1.5 g、MgSO4 0.5 g、酵母浸膏5 g、可溶性淀粉22.5 g、陈海水1000 mL;最佳发酵条件：装液量150/500 mL（v/v）、种龄4天、接种量5%、盐度3%、起始pH 7.5、发酵温度28℃、摇床（180转每分）发酵12天。结论 以最佳发酵条件发酵,优化后放线菌素D的产量为优化前的3.6倍,达到364 mg/L。     

肿瘤坏死因子受体1 PLAD结构域工程菌表达条件的优化

为提高可溶性GST-PLAD蛋白的表达量,对含有GST-PLAD基因的E.coli BL21(DE3)工程菌的发酵条件进行优化。采用单因素实验和正交实验,对影响大肠杆菌生长及融合蛋白表达的培养基组分、培养条件进行了优化。结果显示最优培养基配比(%)为:蔗糖0.5、蛋白胨1、酵母提取物1.5、硫酸铵0.4、氯化钠1、硫酸镁0.03;最佳表达条件为:诱导剂IPTG浓度为0.4 mmol/L,37℃培养5.5 h,诱导9 h,摇瓶装瓶量为100 mL/500 mL。表达条件优化后菌体生长密度是优化前的1.89倍,GST-PLAD表达量是优化前的2.05倍。     

重组人白细胞介素-18工程菌的培养及高密度发酵

目的优化重组人白细胞介素-18的发酵工艺,以获得工程菌的高密度发酵和目的蛋白的高表达.方法在10L发酵罐中,研究重组人白细胞介素-18工程菌在不同的pH值、溶氧和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响.结果根据优化条件,连续三批重复发酵10L工程菌,最终菌体密度均达A600nm=28,菌体获得量均可达湿重50g?L-1以上.目的蛋白表达量均为40%以上.结论优化了重组人白细胞介素-18基因工程菌的发酵和表达条件,为规模化生产奠定了基础.     

重组人SOD工程菌发酵表达条件的优化

采用正交试验优化重组人超氧化物歧化酶工程菌的LB培养基,得到培养基最佳配比(g/L):蛋白胨12,酵母膏5,葡萄糖1和氯化钠10.以此为基础优化基因工程菌发酵条件,确定培养基初始pH 6.5～7.5,装液量20％,菌体密度(D600) 0.55～1.4,42℃诱导表达2～3h,目的蛋白相对表达量由优化前的25％提高至4...     

重组人胰岛素样生长因子-Ⅰ工程菌高密度发酵工艺优化

目的优化表达重组人胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)工程菌的高密度发酵条件。方法考察培养基以及诱导时机、诱导剂量和诱导时间对蛋白表达的影响;用自控发酵罐进行分批补料培养实验,确定优化工艺条件。结果以2×YT+0.5%葡萄糖为发酵培养基,经0.8 mmol/L IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导5 h,通过pH-stat反馈补料方式实现工程菌高密度发酵与目的蛋白高效表达,每1 L发酵液收获干菌体50.1 g,IGF-Ⅰ含量达5.25 g/L。结论建立了IGF-Ⅰ工程菌优化的高密度发酵工艺,为IGF-Ⅰ的下游纯化和工业化生产奠定了基础。     

重组人抗HBsAg单链抗体工程菌的中试发酵工艺研究

目的研究表达重组人抗HBsAg单链抗体工程菌的中试发酵工艺。方法首先采用摇瓶培养,对培养基配方、pH值、诱导表达时机和诱导剂量进行优化,确定基本发酵参数,然后在30L发酵罐上进行中试规模发酵培养。结果在摇瓶培养时,发现含有甘油和微量元素等成分的改良培养基效果明显优于LB培养基和2×YT培养基,另外,工程茵的最佳pH值为7.0,最佳诱导时机为对数中期,最佳诱导剂浓度为0.4mmoL/L异丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖,最佳诱导时间为4h,将摇瓶培养确定的关键参数应用到30L发酵罐中,控制溶氧大于30%,进行3批发酵试验,发现发酵产物的湿菌产量可达58-61.9g/L,目的蛋白质表达量可达28.9%-31.2%以上。结论建立了工程菌M15[pQE-scFv]的中试发酵工艺,为进一步开发打下良好基础。     

重组人干扰素α-2b原液的制备

目的 优化重组人干扰素α-2b原液的发酵纯化方法,降低生产成本,提高产品的安全性。方法 构建重组大肠杆菌,通过逐级扩大培养、发酵、纯化,收集菌体;菌体裂解后,进行变性、复性,通过不同的纯化方法,得到符合质量标准的重组人干扰素α-2b原液;通过对各步工艺的考察,优化重组人干扰素α-2b的发酵、纯化方法。结果 制得的重组人干扰素α-2b菌种表达量高,原液纯度可达95.0 %以上,生物学比活性高于1×108 U·mg^-1,符合《中华人民共和国药典》的质量要求,安全性强。结论 此法可应用于重组人干扰素α-2b原液的生产。     

重组人干扰素α-2b原液的制备

目的优化重组人干扰素α-2b原液的发酵纯化方法,降低生产成本,提高产品的安全性。方法构建重组大肠杆菌,通过逐级扩大培养、发酵、纯化,收集菌体;菌体裂解后,进行变性、复性,通过不同的纯化方法,得到符合质量标准的重组人干扰素α-2b原液;通过对各步工艺的考察,优化重组人干扰素α-2b的发酵、纯化方法。结果制得的重组人干扰素α-2b菌种表达量高,原液纯度可达95.0%以上,生物学比活性高于1×108U.mg-1,符合《中华人民共和国药典》的质量要求,安全性强。结论此法可应用于重组人干扰素α-2b原液的生产。     

含双噁唑环的大环双内酯化合物FW-04-806发酵条件优化

目的对链霉菌FIM-04-806的次级代谢产物,含双噁唑环的大环双内酯化合物FW-04-806进行发酵条件研究。方法采用单因素试验进行培养基优化,探讨装液量、初始pH值等发酵参数的影响,同时逐级放大进行中试验证。结果确定了最佳培养条件:种子培养基为葡萄糖3%,蔗糖3%,玉米浆粉2%,CaCO3 0.75%,pH7.5;发酵培养基为可溶性淀粉3%,葡萄糖2%,黄豆粉1%,玉米浆粉2%,CaCO3 0.7%,pH7.5,接种量10%。优化后的摇瓶效价较初始水平提高了7倍以上,并在100L自动发酵罐及1.5吨发酵罐上得到验证。结论 FW-04-806优化的发酵条件为其工业化生产奠定了基础。     

改造的sTRAIL基因在重组毕赤氏酵母菌中的表达及活性分析

利用甲醇毕赤氏酵母系统对改造的TRAIL基因进行优化表达研究及产物活性分析,确定改造后的基因表达量是否提高。应用电转化技术将4种重组表达载体转化毕赤氏酵母菌GS115,经Zeocin抗生素筛选、PCR检测获得阳性酵母工程菌,采用摇瓶发酵及SDS-PAGE进行高效表达菌株的筛选,经CM-柱层析、Western blot及MTT法对重组蛋白进行初步纯化、抗原活性检测和生物学活性分析,确定了最佳摇瓶发酵条件:培养基最适pH值5.5~6.5,最佳甲醇诱导浓度为1%,最适甲醇诱导周期为96h。筛选到高效表达菌株pPICZα-A-sTRAIL/GS115、pPICZα-A-sTRAILK/GS115、pPICZα-A-sTRAILA/GS115、pPICZα-A-sTRAILAK/GS115,其表达量分别达到67,113.4,98,145mg/L,改造后的TRAIL具有抗原活性和生物学活性。对TRAIL基因的改造可以提高其在甲醇毕赤氏酵母系统中的表达。     

庆大霉素发酵工艺的研究

目的通过对庆大霉素发酵条件的优化,提高发酵生产的能力。方法以绛红色小单孢菌2-25为对象,通过单因素试验和四因素三水平(4×3)正交试验筛选出了菌株2-25的最佳培养基配方及培养条件。结果该菌种的最佳发酵条件:5.0%玉米淀粉,3.0%黄豆饼粉,0.6%蛋白胨,0.15%硝酸钾,在33℃、pH 7.8、接种量25%,培养84h,产品质量符合中国药典2005版(CP2005)、美国药典28(USP28)。结论优化发酵条件后菌株2-25发酵水平明显提高。