人类杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因PCR-SSP分型方法的建立及其应用

目的建立PCR-SSP方法检测人类杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）基因。方法参照K／R基因数据库，采用计算机软件设计一系列特异性引物建立PCR-SSP方法，以人类生长激素基因特异性引物作为内对照，以Dynal公司的KIR PCR-SSP分型试剂盒作为验证。结果本实验所设计的KIR特异性引物可检测出所有K／R基因，扩增产物条带清晰，特异性强。结论本实验建立的KIR PCR-SSP方法结果准确，具有可行性。     

短片段扩增KIR基因的PCR-SSP分型法的建立及其应用

目的建立短片段扩增杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因的序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)分型法。方法选取330例湖南汉族健康志愿者血液标本,提取基因组DNA;合成短片段扩增KIR基因的序列特异性引物,采用PCR-SSP分型法扩增已知的16个KIR基因,分析湖南汉族人群KIR基因的频率分布特征。从330例DNA标本中随机选取100例,比较长、短片段扩增KIR基因的PCR-SSP分型法检测基因的阳性率差异。结果①短片段扩增KIR基因的PCR-SSP分型法可检测出所有KIR基因,扩增产物条带清晰,结果准确;②湖南汉族健康人群KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR3DP1基因阳性率均为100%,KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR2DS4、KIR2DP1基因阳性率分别为96.4%、96.1%、94.2%、94.2%和99.7%,而KIR2DS1、KIR2DL5、KIR3DS1、KIR2DL2、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS5基因阳性率均40%;③长、短片段扩增KIR基因的PCR-SSP分型法(长、短片段方法)均可检测出16个KIR基因,且KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR3DP1基因的阳性率一致,但长片段方法检测其余KIR基因的阳性率均低于短片段方法,其中短片段方法检测KIR3DL1、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR3DS1基因阳性率均明显高于长片段方法(分别为94%vs.84%、40%vs.26%、94%vs.62%、38%vs.20%,均P0.05),同时漏检和误检降低。结论短片段扩增KIR基因的PCR-SSP分型法简单、易行、准确,具有良好的应用价值。     

浙江汉族人群KIR2DL3基因遗传多态性

目的探讨浙江汉族人群KIR2DL3基因的多态性分布情况。方法采用PCR测序分型方法进行KIR2DL3等位基因分型。首先合成引物特异性扩增KIR2DL3基因的两个片段,然后对KIR2DL3基因第4、5、7、8和9外显子进行测序分析,根据多态性位点格局判断样本的KIR2DL3等位基因情况。结果样本中共检测到两种等位基因,其中KIR2DL3*001等位基因占77%。结论PCR测序分型方法可有效检测KIR2DL3等位基因。     

桥本甲状腺炎患者杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性分析

目的 探讨杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin-like receptor, KIR)基因多态性与桥本甲状腺炎(HT)的关联性.方法 选择100例散发HT患者,260例无血缘关系的正常人作为对照,提取全血基因组DNA,采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)的方法,对KIR2DL1～5、KIR3DL1～3、KIR2DS1～5、KIR3DS1及KIR2DP1共15个KIR基因进行检测,其中除KIR2DS5基因外,每个基因均采用2对不同的特异性引物.结果 HT病例组中KIR2DL5基因的基因频率较对照组显著降低(0.200 vs 0.312,RR=0.64,P<0.01).结论 KIR2DL5基因频率的降低可能与HT的发病相关.     

中国新疆维吾尔族、云南彝族KIR多态性分析

分析中国新疆维吾尔族、云南彝族健康人群的KIR基因多态性及单倍型特点。采用序列特异性引物PCR方法(PCR-sequencespecificprimer,PCR-SSP)对维吾尔族、彝族人群基因多态性进行低分辨率检测和单倍型分析。维吾尔族中共检出15种基因型,以AH(5,2)型最常见,频率为22.7%,其次为AF(1,2)和M(2,8),频率分别为13.7%,9.09%。在彝族中共检出19种基因型,以AJ(2,2)型最常见,频率为33.3%,其次为AF(1,2),频率为17.5%。此外,在维吾尔族、彝族中共发现8种新基因型,提示中国少数民族有着自己独特的KIR基因分布频率、单倍型频率和基因型频率。     

KIR3DL1基因内含子一个新缺失位点在中国九个民族中的多态性

目的探讨一个KIR3DL1基因内含子区变异在我国不同民族人群中的多态性和分布特点。方法采用聚合酶链式反应-序列特异性引物PCR(PCR-SSP)结合DNA测序,对来自云南、贵州、西藏和内蒙古地区9个民族10个人群共676例样本的KIR3DL1基因内含子区多态性进行分析。结果中国不同地区的民族人群中均发现KIR3DL1基因内含子2/3区存在一个4bp缺失位点,在不同民族中的基因频率为0-6.56%,其中以汉族和仡佬族较多,藏族和蒙古族较少,在不同人群之间的差异具有统计学意义。结论 KIR3DL1基因内含子2/3区域4bp缺失位点在中国不同地区和民族人群中有多态性,且不同民族间的缺失型等位基因分布存在明显差异,环境因素和民族源流可能在这种差异性形成过程中起作用。     

Graves病患者杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因型分析

目的: 探讨杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因型在Graves病(GD)患者中的分布规律.方法: 采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP) 的方法,分析96例Graves病患者和96 例正常对照人群的KIR基因型.结果: GD患者中2DS2-,2DL2-,2DL3+,2DL1+,3DL1+,3DS1-,2DL5-,2DS3-,2DS5-,2DS1-,2DS4-基因型频率高于对照组(6.25% vs 0,P<0.05);对照组中,基因频率最高的基因型为2DS2-,2DL2-,2DL3+,2DL1+,3DL1+,3DS1-,2DL5-,2DS3-,2DS5-,2DS1-,2DS4+,该基因型的基因型频率较GD患者组高,且有显著性差异(28.13% vs 10.42%,P<0.01);GD患者组不携带活化性KIR基因的基因型频率较对照组明显升高(10.42% vs 0%,P=0.001).结论: KIR基因型在GD患者与正常人群分布的差异可能与GD的发病有关.     

异基因骨髓移植中PCR-SSP和RFLP对HLA-DRB、DPB1分型的应用

目的:探讨序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）和聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）对HLA-DRB、DPB1分型在异基因骨髓移植中应用的可行性。方法:应用19对不同的DRB抗原所对应等位基因序列特异性的引物,PCR扩增供受者各20个样本DRB,产物直接琼脂糖凝胶电泳分析;同时用另一对引物PCR扩增DPB1第二外显子,产物10种限制性内切酶酶切分析。结果:各DRB带清晰可辨,直接确定为该型;DPB1的多态性片段编码转换后确定其基因型;4例找到供者。结论:它们是异基因骨髓植前快速、精确和可靠的基因分型手段。     

中国HIV-1感染者KIR基因多态性与疾病进展关系的研究

目的 通过对中国HIV-1感染缓慢进展者(TP)和典型进展者(TP)杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因频率的研究,探讨中国人群K/R基因多态性与HIV-1感染者疾病进程的关系.方法 采用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)技术,分析43例HIV-1感染SP和38例TPKIR基因位点的多态性.结果 SP组和TP组的KIR2DS3等位基因频率分别为3.6%和14.2%,SP组显著低于TP组,两组的KIR2DS3等位基因频率差异具有统计学意义(P=0.018,OR=0.210,95%CI=0.053-0.833);SP组的活化性KIR基因数目低于TP组,但差异无统计学意义(P=0.208).结论 低表达KIR2D53基因可能是延缓中国HlV-1感染者疾病进程的保护因素之一.     

浙江汉族人群KIR3DL2等位基因的多态性分析

目的探讨浙江汉族人群KIR3DL2等位基因的多态性分布情况。方法KIR3DL2等位基因分型采用聚合酶链反应寡核苷酸探针杂交方法，利用引物特异性扩增KIR3DL2基因的两个片段，合成21条探针检测KIR3DL2基因的多态性位点，根据探针的格局判断出样本的KIR3DL2等位基因情况。结果样本中共发现17种探针格局，检测到7种等位基因，其中KIR3DL2＊002等位基因占57％。1例样本无法用现有等位基因探针格局进行分析。结论聚合酶链反应寡核苷酸探针杂交方法可有效检测KIR3DL2等位基因，浙江汉族人群KIR3DL2等位基因的分布有其特点。     

四川凉山地区彝族家系KIR单体型分析

目的了解四川凉山地区彝族家系KIR单体型的基因组成情况。方法采用多重PCR-SSP的方法对89个四川凉山地区彝族家系共364人的16个KIR基因位点进行基因分型;根据KIR基因型结合家系分析推导KIR单体型。对部分样本中某些不能确定拷贝数的KIR基因进行荧光定量PCR分析,再结合家系分析得到其KIR单体型。结果 89个四川凉山地区彝族家系中发现22种KIR基因型,21种单体型,其中3种A单体型,18种B单体型;并发现了2种较为独特的KIR单体型。结论四川彝族家系有其独特的KIR单体型种类,其基因组成具有以下规律:2DL1、2DP1总是和3DP1同时出现;有2DS1时则2DS4缺失,反之亦然;2DS2总是和2DL2同时出现。     

烟台地区汉族无偿献血人群杀伤细胞免疫球蛋白受体基因多态性研究

目的:探讨烟台地区汉族无偿献血人群杀伤细胞免疫球蛋白受体(killer cell immunoglobulin receptor,KIR)基因多态性及基因型的特征。方法:收集2019年6月至2019年12月烟台市中心血站检测合格的无偿献血者外周血样本95例,采用聚合酶链反应序列特异性引物(polymerase chai...     

杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性与原发性胆汁性肝硬化的相关性分析北大核心CSCD

目的探讨江苏汉族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因多态性与原发性胆汁性肝硬化(PBC)的相关性。方法收集2011-06-01/2013-07-31期间江苏省常州三院住院的PBC患者122例和198例相匹配的无血缘关系健康人群外周血标本。采用实时荧光定量PCR检测KIR基因多态性,分析KIR基因及基因型频率在2组人群间的差异。结果 PBC患者KIR2DL2和2DS2基因频率比对照组显著性降低,与降低疾病的患病风险有关。共检测出55种KIR基因型,其中PBC组24种,对照组47种。最常见的基因型为AA1,其次为BX2、BX8、BX4、BX14。对存在于5个或以上个体的11个基因型进行分析,未发现PBC组与对照组之间有显著性差异。结论 KIR2DL2和2DS2的缺失可能是江苏地区汉族人群PBC发病潜在的保护因子。     

杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性与原发性胆汁性肝硬化的相关性分析

目的探讨江苏汉族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因多态性与原发性胆汁性肝硬化(PBC)的相关性。方法收集2011-06-01/2013-07-31期间江苏省常州三院住院的PBC患者122例和198例相匹配的无血缘关系健康人群外周血标本。采用实时荧光定量PCR检测KIR基因多态性,分析KIR基因及基因型频率在2组人群间的差异。结果 PBC患者KIR2DL2和2DS2基因频率比对照组显著性降低,与降低疾病的患病风险有关。共检测出55种KIR基因型,其中PBC组24种,对照组47种。最常见的基因型为AA1,其次为BX2、BX8、BX4、BX14。对存在于5个或以上个体的11个基因型进行分析,未发现PBC组与对照组之间有显著性差异。结论 KIR2DL2和2DS2的缺失可能是江苏地区汉族人群PBC发病潜在的保护因子。     

Real-time PCR分型法检测苏南地区汉族人群KIR基因多态性

目的利用SYBR Green I Real-time PCR分型方法检测杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin-likereceptor,KIR)基因,探讨苏南地区汉族人群KIR基因的分布特点。方法应用SYBR Green I Real-time PCR法对191名苏南地区汉族非亲缘健康人群进行KIR基因分型。结果 SYBR Green I Real-time PCR法有效地进行了KIR基因分型。已知的16种KIR基因在苏南地区汉族人群均被检出。框架基因2DL4、3DL2、3DL3和假基因3DP1存在于所有受检个体中。最常见的非框架基因为2DL1、2DL3、3DL1、2DS4以及假基因2DP1。共检出33种KIR基因型,最常见的为AA1(39.27%),其次为BX2、BX4和BX8。发现仅在新加坡华人报道的罕见基因型BX331和BX337,及仅在墨西哥人群罕见的基因型BX427。结论苏南汉族人群中检测出已知的16种KIR基因,共发现33种基因型,最常见的为AA1,并见到3个罕见基因型BX331、BX337和BX427。     

建立一种实时荧光PCR对维生素D受体基因单核苷酸多态性快速分型

目的:建立实时荧光PCR快速检测维生素D受体(VDR)基因rs2228570、rs1544410、rs7975232位点多态性。方法:以VDR基因的rs2228570、rs1544410、rs7975232三个SNP位点的变异碱基分别设计并合成特异性引物。11例体检健康儿童血液标本作为检测样本,采用实时荧光PCR方法检测样本中VDR基因型,采用Sanger法对检测结果测序验证。结果:利用所设计的特异性引物对人全血基因组中VDR进行SNP位点特异性扩增,根据7500 FAST实时荧光PCR仪的分析结果得到基因型,与测序结果比对后发现,11个样本采用实时荧光PCR方法基因分型结果与测序结果均一致。结论:实时荧光PCR快速检测VDR基因rs2228570、rs1544410、rs7975232位点多态性的方法或可用于临床VDR基因SNP快速分型。     

中国北方人群系统性红斑狼疮患者KIR基因多态性的研究

目的:检测和分析系统性红斑狼疮患者的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因的多态性, 探讨系统性红斑狼疮(SLE)从基因到临床表达的发病机制.方法:应用PCR-SSP技术检测北方62例确诊SLE患者和61例同一区域同一民族正常对照者的KIR基因位点多态性.结果:SLE 患者KIR基因表型分布较常见的为KIR3DP1、 2DL1、 2DP1、 3DL1、 2DL3及1D, 其次为2DS4、 2DL5、 3DS1、 2DS2、 2DS5和2DL2, 较低者为2DS1、 2DS3及3DP1V, SLE病例组KIR3DS1, 2DL2、 2DL5和2DL3基因型频率比对照组显著降低(P<0.01).结论:中国北方人群的SLE的发生可能与多个KIR基因等位基因有相关性.     

慢性粒细胞白血病患者杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因研究

目的探索CML患者的KIR（killer cell immunoglobulin-like receptors）基因的多态性与正常人群是否存在差异。方法应用PCR-SSP技术进行KIR基因的检测。结果共检出目前已知的18个KIR基因,在检测的全部个体中,3DL3,3DL2及2DL4出现频率均为100%。在CML的研究中发现KIR2DL1基因频率（0.509）比正常对照组（1.000）显著降低,KIR2DL1与CML呈现强负相关P〈0.001,与CML负相关的KIR基因尚有3DS1,2DL5和3DL1,P值分别等于0.021,0.029,0.031。其他KIR基因位点频率未发现统计学差异。结论CML患者具有其独特KIR基因位点频率的特点。     

杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DS4及其变体KIR1D与梅毒的关联性研究

目的 探讨杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunogloblin-like receptor,KIR)基因KIR2DS4及其变体KIR1D与属于KIR基因单体型A (haplotype A)的梅毒(syphilis)患者的关联性.方法 采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)法,分析192例无血缘关系的健康人和190例梅毒患者KIR基因的单体型,在归类于单体型A的梅毒患者和健康人群中分析KIR2DS4和KIR1D基因与梅毒的关联.结果 在192例健康者中,含有KIR2DS4基因的个体为187例,其中有91例归类于纯合子(homozygous)单体型A,占48.7% (91/187);在190例梅毒患者中,出现KIR2DS4基因的个体为181例,其中有89例归类于纯合子单体型A,占49.2% (89/181).在归属于单体型A的人群中,KIR1D/KIR1D在梅毒病例组的基因型频率为16.9%,显著高于对照组(6.6%,P＝0.032),而KIR2DS4/KIR2DS4和KIR2DS4/KIR1D基因型频率在两组间差异均无统计学意义(P>0.05).结论 KIR1D/KIR1D可能与纯合子单体型A中的个体的梅毒发生相关联.

Abstract：

Objective To investigate the killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes, KIR2DS4 and its variant KIR1D for an association with syphilis in the comparison between syphilis patients and unrelated healthy subjects. Methods One hundred and ninety syphilis patients and 192 unrelated healthy subjects were performed to determine the KIR genotypes by PCR-SSP method. The gene frequencies of KIR2DS4 and KIR1D were analyzed for an association with syphilis in the patients and healthy people who belonged to KIR gene haplotype A. Results Of 192 healthy individuals, 187 were identified with a KIR2DS4 gene. And 91 individuals were classified as homozygous haplotype A with the percent of 48.7% (91/187) in 187 KIR2DS4 positive individuals. Of 190 syphilis patients, 181 were identified with a KIR2DS4 gene. And 89 individuals were classified as homozygous haplotype A with the percent of 49.2% (89/181) in 181 KIR2DS4 positive individuals. The frequency of KIR1D/KIR1D in syphilis patients classified as haplotype A was 16.9%, and was significantly higher than that in the control group (6.6%, P=0.032). However, there was no significant difference for the frequencies of KIR2DS4/KIR2DS4 and KIR2DS4/KIR1D between the two groups (P>0.05). Conclusion KIR1D/KIR1D might be associated with syphilis in the comparison between syphilis patients and unrelated healthy controls who were classified as homozygous haplotype A.     

杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性与不明原因复发性早期自然流产的关联性研究

目的探讨杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR）基因多态性与不明原因的复发性早期自然流产的关联性。方法采用序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）法，分析我院就诊的100例不明原因的复发性早期自然流产（unexplained recurrent spontaneous abortions，URSA）患者和112例无血缘关系的正常妇女KIR基因位点的多态性。结果URSA病例组KIR2DS1（P=0．003）、KIR2DS2（P=0．008）、KIR2DL5（P=0．003）基因的阳性率较随机对照组显著升高，URSA病例组活化性KIR基因数目较对照组显著增多（P=0．002）。具有3个或3个以下活化性KIR基因的个体在病例组中占40．00％，在对照组中占58．04％；而具有3个以上活化性KIR基因的个体在病例组中占60．00％，在对照组中占41．96％，两者差异具有统计学意义（P=0．009）。结论活化性KIR基因数目增多可能参与不明原因复发性早期自然流产的发病。KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DL5基因频率升高可能是不明原因复发性早期自然流产的原因之一。