以假病毒为基础的HIV-1中和抗体检测体系的建立以及初步应用

目的 建立以假病毒为基础的HIV-1中和抗体检测方法,并对其进行初步应用.方法 从重组质粒中扩增出gp160基因片段,并克隆到pcDNA3.1质粒上,酶切鉴定得到阳性克隆.将阳性克隆分别和pSG3△env质粒共转染获得假病毒.用假病毒分别检测单克隆抗体和HIV-1抗体阳性血清的中和活性.结果 成功地获得了4株假病毒CHB01、CHB02、CHBC03和CHAE04.单克隆抗体4E10可以中和4株假病毒;单克隆抗体2F5不能中和CHBC03假病毒株,但可以中和CHB01、CHB02和CHAE04假病毒株;单克隆抗体IgG1b12 可以中和CHBC03、CHB01和CHB02假病毒株,则不能中和CHAE04假病毒株.43份HIV-1抗体阳性血清中针对不同假病毒的中和抗体明显不同.结论 所获得的假病毒可以用于中和抗体的检测,但不同假病毒株的中和特性不同.     

新型冠状病毒614D和614G假病毒生物学特性研究

目的利用HIV慢病毒包装系统构建新型冠状病毒(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)原始株614D和突变株614G假病毒, 并初步研究其生物学特性。方法将重组表达质粒pCDNA3.1-614D和pCDNA3.1-614G分别与慢病毒质粒psPAX2和pLenti CMV Puro LUC瞬时共转染293T细胞, 72 h后收集上清, 进行20%蔗糖垫层超速离心, 检测假病毒的滴度、形态、S蛋白表达和中和活性。结果间接免疫荧光检测可见S蛋白特异性荧光, Western blot分析可见2019-nCoV 614D和614G假病毒S蛋白表达, 透射电镜下可见假病毒颗粒具有明显刺突。614D和614G假病毒的滴度分别为1.12×104和2.52×104 TCID50/ml, 均能够中和S蛋白兔多克隆抗体, 表明假病毒具有特异性。结论本研究成功构建了2019-nCoV 614D和614G假病毒, 为建立基于假病毒的体外中和抗体检测平台奠定基础。     

HIV-1B′亚型毒株抵抗VRC01抗体中和作用的机制研究

目的:探讨具有广谱中和活性的患者DRVI01血浆来源的HIV-1B′亚型毒株抵抗VRC01抗体中和的机制。方法:比较同期感染相同亚型且对VRC01抗体敏感的病毒序列,结合文献报道筛选可能影响VRC01中和作用的关键氨基酸,通过定点突变、不同来源膜蛋白序列交换,验证这些位点氨基酸对VRC01抗体中和作用的影响。结果:位于...     

H5N1禽流感病毒HA假病毒的构建及特性研究

目的 构建包膜蛋白为H5N1禽流感病毒HA蛋白的假病毒,对其生物学特性进行研究,并将其初步应用于H5N1禽流感病毒的血清检测.方法 将我国分离的高致病性H5N1禽流感病毒的HA基因插入真核表达质粒,得到pLP-HA,与假病毒构建体系的三种质粒pLP1,pLF2和pEmGFP,瞬时共转染人胚肾细胞293T,48 h收集假病毒上清,对其感染性,血凝活性进行测定,并应用于微量中和实验.同时,构建了优化HA基因的假病毒以及一株含有越南禽流感病毒HA基因的假病毒,进行比较.结果 电镜下观察到假病毒颗粒的存在;Western-Blot表明HA蛋白存在于假病毒颗粒中;HA假病毒与野生型活病毒的微量中和实验相比,两者结果具有很好的相关性.结论 成功构建了不同高致病性H5N1禽流感病毒HA蛋白的假病毒,所构建的假病毒可以应用于微量中和实验.研究发现不同禽流感病毒株HA蛋白假病毒的包装效率不同,并且真核表达优化基因并不能显著提高假病毒颗粒包装效率.     

用单克隆抗体作柯萨奇病毒A24型抗原分析

用我国分离的一株C A24 V制备的单克隆抗体,对10株C A24病毒作了抗原分析。8个荧光阳性的单抗对所试验的9株C A24 V均呈现明显荧光反应,其中4个对C A24原型株荧光试验也阳性,另4个则为阴性。5个具有中和作用的单抗均不中和C A 24原型株,其中一个单抗对新加坡E H24/70株有低滴度中和,3个单抗中和日本分离的二株病毒及我国1986年福建分离的一株病毒。而所有这5个单抗均中和我国1986年从河南、上海分离的二株病毒及1988年从北京、辽宁和福建分离的三株病毒。     

基于H5N1假病毒的体内中和试验模型的建立

目的建立H5N1假病毒的体内感染模型, 并对抗体FHA3的体内中和活性进行鉴定。方法依据A/Anhui/1/2005/H5N1毒株血凝素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(neuraminidase, NA)的序列信息, 构建重组表达质粒pcDNA3.1-HA5和pcDNA3.1-NA1, 并与质粒pNL4-3.Luc.R-E-共转染293T细胞制备H5N1假病毒上清, 电镜观察上清中假病毒颗粒形态。假病毒上清感染MDCK细胞后, 测定病毒滴度;经腹腔注射入BALB/c小鼠体内, 在感染后2、5、8、12 d进行生物发光成像, 检测假病毒体内感染情况。利用建立的小鼠感染模型, 评价抗体FHA3的体内功能活性。结果重组表达质粒pcDNA3.1-HA5和pcDNA3.1-NA1构建正确, 与pNL4-3.Luc.R-E-质粒共转染293T细胞可制备出高滴度的假病毒上清, 电镜下可见圆形的病毒颗粒。H5N1假病毒感染后, 小鼠体内发出较强的荧光, 而攻毒前给予抗体FHA3处理可减弱其荧光信号。结论成功构建出H5N1假病毒体内感染模型, 并证实抗体FHA3对假病毒的感染具有体内...     

人类免疫缺陷病毒-1包膜糖蛋白进化对抗原表位及病毒亲嗜性的影响

目的调查同一供体来源的人类免疫缺陷病毒（HIV）-1感染不同个体后病毒包膜糖蛋白的变异、病毒侵入靶细胞能力以及包膜抗原主要中和表位的变化,为了解病毒感染规律及机体抗病毒免疫奠定基础。方法对病毒包膜糖蛋白基因序列进行基因离散分析;用包膜蛋白表达质粒与HIV-1骨架质粒共转染293T细胞构建包膜包膜假病毒,用假病毒感染HIV-1靶细胞U87．CD4．CCR5或U87．CD4．CXCR4细胞检测假病毒侵入靶细胞的能力及病毒亲嗜性;对包膜糖蛋白中已知的广谱中和抗体识别表位进行分析。结果24个有完整开放读码框的env基因克隆与河南省HIV-1毒株CNHN24的基因离散率为（7．91±0．78）％,与云南省分离毒株RIA2的基因离散率为（6．904-0．79）％。各可变区基因离散率呈现严重不均衡性,其中,VI／V2区的离散率最高,V4区的离散率次之,V3区离散率最小。包膜假病毒中既有CCR5亲嗜性和CXCR4亲嗜性的,也有双亲嗜性的包膜。而且上述包膜中主要中和表位IgGlbl2、2F5和4E10抗体识别表位保守,但447—52D抗体识别表位变异较大。结论同一来源的HIV包膜糖蛋自在4～7年间的不同受者体内发生了较大变异并影响了病毒侵入靶细胞的能力;主要广谱中和抗体的识别表位部分保守。     

重组杆状病毒表达的EIAV Env蛋白与含有env基因重组痘苗病毒的联合免疫

目的：构建新型的马传染性贫血病毒(EIAV)的候选疫苗：方法：利用BAC—To—BAC杆状病毒表达系统，将中国马传贫驴白细胞弱毒疫苗(EIAV DLV)及其亲本株(EIAV LN)env基因导入到杆状病毒基因组中。转染昆虫细胞后，得到的重组病毒用SDS—PAGE和Western blot检测表达产物。以本实验室构建的含有EIAV env基因的重组痘苗病毒，单独或与重组杆状病毒表达的EIAV Env蛋白联合免疫小鼠。结果：构建的重组杆状病毒能正确表达全长Env蛋白。与单独免疫组相比，联合免疫组免疫应答显著增强，其中中和抗体的滴度提高5～9倍。结论：含有EIAV env基因的重组痘苗病毒与Env蛋白抗原联合免疫，能够诱导高滴度的中和抗体。     

SFTSV重组假病毒的构建及Gc糖基化对病毒感染力的影响

目的为探究发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)中Gc及其N-糖基化位点与病毒感染性的关系, 构建了含有SFTSV Gc糖基化位点突变体的重组假病毒。方法利用定点突变和同源重组技术构建了SFTSV Gc及3个N-糖基化位点突变的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Gc、pcDNA3.1(+)-Gc(N291Q)、pcDNA3.1(+)-Gc(N352Q)和pcDNA3.1(+)-Gc(N374Q)。验证其在293T细胞中成功表达后, 感染VSVΔG-Fluc*G假病毒, 构建4株重组假病毒并检测其对细胞感染力的影响。结果双酶切鉴定和序列测定证实成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-Gc、pcDNA3.1(+)-Gc(N291Q)、pcDNA3.1(+)-Gc(N352Q)和pcDNA3.1(+)-Gc(N374Q)。间接免疫荧光和Western blot结果表明4个重组质粒均成功表达。SFTSV Gc重组假病毒对Vero细胞有感染特异性。糖基化位点突变后假病毒感染能力明显降低, 且352位糖基化位点突变株感染水平最低(P<0.001、P=0.001)。结论 SFTSV G...     

整合深圳人源H5N1禽流感病毒株血凝素蛋白的假型逆转录病毒的构建

目的 构建整合深圳人源H5N1禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)株血凝素(HA)的假型逆转录病毒.方法 利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增深圳人源H5N1禽流感病毒株HA基因,将扩增产物与pGEM-T载体连接,在经过酶切及测序鉴定后,通过Sal Ⅰ与BamHⅠ酶切位点将HA基因克隆至真核表达载体CMV/R,然后协同转移载体pHR-Luc、包装载体pCMV&8.2通过磷酸钙共沉淀法转染人胚肾细胞(293T),72 h后收集假病毒上清,超速离心后通过Western blot鉴定假病毒颗粒HA、P24蛋白的表达,同时测定HIV-HA假病毒对犬肾传代细胞(MDCK)、宫颈癌上皮细胞(HeLa)、中国仓鼠卵母细胞(CHO)和293T等4种不同细胞株的感染活性.结果 深圳人源HSN1禽流感病毒株A/Shenzhen/406H/06属于subelade2.3,其HA基因开放读码框编码567个氨基酸,在GenBank登录号为EF137706.经Sal Ⅰ与BamH Ⅰ双酶切鉴定HA基因成功克隆至真核表达载体CMV/R.将pHR-Luc、pCMV&8.2、CMV-HA共转染293T细胞后,所收集的假病毒经Western blot证实假病毒颗粒不仅含有HIV基质蛋白P24,还可以整合AIV HA蛋白,并且能够由前体蛋白HA0裂解为具有生物活性的HA1和HA2蛋白.HIV-HA假病毒可以感染MDCK、HeLa、CHO、293T等4种靶细胞,表明所构建的假病毒具有感染活力,且具有广泛的宿主范围.结论 本研究成功构建整合A/Shenzhert/406H/06 HA蛋白的假型逆转录病毒,并且HIV-HA假病毒具有良好的感染活性,从而为下一步筛选中和抗体及抗原表位分析奠定基础.     

埃博拉假病毒突变体感染性及靶向抗体中和作用评价

目的：利用埃博拉假病毒（EBOV）报告系统，体外评价埃博拉病毒突变体对4种细胞系的相对感染力及3株单抗对突变体的中和能力。方法：构建表达埃博拉假病毒及其突变体GP蛋白的重组质粒GP-pcDNA3.1，与含有萤火虫荧光素酶报告基因的HIV骨架载体pSG3.ΔEnv.CMV.Fluc共转染HEK293T细胞获得假病毒上清。利用Western blot法及HIV p24 ELISA抗原定量试剂盒对假病毒进行鉴定及定量，采用等量的假病毒感染HEK293T、Huh7、A549及THP-1细胞，36 h后，裂解细胞测荧光素酶活性（RLU），计算突变体与母本的相对感染力。将mAb114、ADI-15946、rEBOV-520与EBOV及其突变体假病毒预孵育1 h，将假病毒上清和抗体混合液感染HEK293T细胞，36 h后测RLU值，计算抑制率。结果：相对于母本，所有突变体感染细胞的能力均有不同程度增强。单抗mAb114、ADI-15946能有效中和母本及14株突变体，rEBOV-520对N107D-P330S-G480D中和作用减弱。结论：体外实验证明14株突变体入侵靶细胞能力增强。3株中和抗体对突...     

广西HIV-1 CRF01-AE重组毒株env基因V3环序列变异及其与生物表型的关系

目的研究广西HIV-1 CRF01-AE重组毒株env基因V3环序列变异及其与生物表型间的关系。方法从广西主要流行区收集来的50份HIV-1感染者血液样本中提取前病毒DNA，使用巢式聚合酶链反应（nested-PCR）扩增HIV-1 env基因片段并进行亚型鉴定，选择38份CRF01-AE重组型HIV-1毒株env，基因V3环及邻近区域的序列进行系统树和氨基酸变异分析。结果38份CBF01-AE重组毒株中36份与分离于广西地区的CRF01-AE.97CNGX2f和泰国代表毒株THCM240接近，另外2份与中非共和国代表株90CF402聚成一簇；CRF01-AE重组毒株V3环顶端四肽存在着4种类型：CPCQ、GPGR、GPGH和GPGA；根据V3环关键氨基酸推测辅助受体使用情况，结果显示：71．05％的CRF01-AE重组毒株可能使用CCR5作为辅助受体，28．95％不能对其辅助受体的使用情况做出预测。结论广西HIV-1 CRF01-AE重组毒株V3顶端四肽变异较大，而且大部分毒株可能为NSI型。这可为广西该毒株的防治和诊断试剂的更新提供参考。     

新型冠状病毒抗体检测结果的标准化和平行比较北大核心CSCD

目的通过世界卫生组织(world health organization,WHO)新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)抗体国际标准品(international standard,IS)(G样本)、抗体参考盘(样本E、F、H、I、J)的应用降低SARS-CoV-2抗体检测结果差异、提高检测结果一致性。方法利用基于SARS-CoV-2活病毒的微量中和试验、假病毒中和试验以及商品化的ELISA试剂盒对WHO的SARS-CoV-2抗体IS和参考盘等共10个样本(A~J)分别进行检测,对检测结果进行分析比较。结果以IS为参考品确定其他样本的相对浓度,降低了检测结果之间的差异。假病毒中和试验、ELISA检测血清抗体参考盘结果与基于SARS-CoV-2 HB02株的中和试验基本一致,个别试剂可检测弱阳性样本。结论SARS-CoV-2抗体IS的使用促进了血清学检测方法的标准化,抗体参考盘适用于基于SARS-CoV-2原型株的所有检测方法,假病毒中和试验、ELISA等在一定程度上可作为活病毒中和试验的替代方法。     

新型冠状病毒灭活疫苗对Beta和Delta变异株的交叉中和活性

目的评估新型冠状病毒灭活疫苗免疫人群和小鼠血清对变异株(Delta株和Beta株)的交叉中和活性。方法各取20份人群常规两剂基础免疫血清、三剂加强免疫血清和两剂小鼠免疫血清作为实验材料, 采用新型冠状病毒原型株、Delta和Beta变异株3株病毒, 在生物安全三级实验室中采用微量中和试验检测中和抗体。通过分析不同稀释度血清对固定剂量病毒的中和活性, 计算血清阳性率和抗体几何平均滴度(geometric mean titer, GMT), 评估免疫血清的交叉中和水平。结果人免疫血清对不同变异株的阳性率均大于95%;基础免疫后, 接种者血清对原型株、Delta和Beta变异株的中和抗体GMT分别为109、41和15, 与原型株比较, 针对Delta和Beta变异株的中和抗体GMT分别下降2.7倍和7.3倍;加强免疫后, 接种者血清对原型株、Delta和Beta株的中和抗体GMT分别为446、190和86, 与原型株比较, 针对Delta和Beta变异株的中和抗体GMT分别下降2.3倍和5.2倍。小鼠免疫血清对不同变异株的阳性率均为100%;对原型株、Delta和Beta变异株的中和抗体GM...     

云南省一株柯萨奇病毒B组5型分离株的全基因组解析

目的对云南省2022年一例流感样病例的咽拭子分离得到的柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirus B5, CVB5)病毒株进行全基因组测序, 并分析其遗传进化、基因突变和重组特征。方法通过人宫颈癌细胞培养获得病毒分离株, 应用全基因组测序技术对分离株进行病毒基因序列测定, 采用MEGA、RDP4及SimPlot软件, 解析病毒基因组学特征。结果分离株YN-01/CHN/2022与2株广东CVB5流行株核苷酸同源性为96.6%, 属GⅠ.C1分支, 与国内大多其他CVB5流行株相似度低(≤90.3%), 揭示国内CVB5流行株间基因组差异较大。该分离株VP1序列存在2个特有的氨基酸突变(T246A和T275A), 但其95位氨基酸未发生改变。基因重组分析显示YN-01/CHN/2022可能为重组株, 重组位点发生在P1区VP4(940)和P2区2A(3 540)。结论本研究分离株YN-01/CHN/2022属于CVB5 GⅠ.C1基因型, 存在特异的核苷酸分歧, 也证实了CVB5基因组有重组现象发生。该数据提示增强CVB5分子流行病学研究工作, 持续追踪病毒进化规律, 不断提高相关...     

中国HIV-1B''/C亚型感染者对自身病毒中和作用与疾病进展关系的研究

目的：探讨中国HIV-1 B’/C亚型感染者对自身病毒中和作用与疾病进展的关系。方法：将24例HIV-1 B’/C感染者自身原代病毒与同期和6个月自身血浆作用后,感染正常PBMC,培养7天测定p24抗原浓度,以正常人血浆加病毒悬液为对照。以抑制50%对照孔p24浓度的血浆最高稀释倍数的倒数计算中和抗体滴度,中和抗体滴度≥8倍为具有中和作用。结果：在同期血浆中和自身病毒试验中,3例缓慢进展者（SP）均具有中和作用,HIV组仅4例（4/21）具有中和作用,SP组中和抗体滴度明显高于HIV组。在6个月血浆中和自身病毒试验中,SP组中和抗体滴度明显增加,HIV组12例具有中和作用,SP组中和抗体滴度明显高于HIV组。中和抗体滴度与病毒载量呈明显的负相关。结论：疾病缓慢进展的HIV-1 B’/C亚型感染者对自身病毒中和作用明显高于HIV组,提示中和抗体在延缓疾病进程中发挥重要作用。     

新冠灭活疫苗序贯免疫对Wuhan-Hu1和Omicron变异株的体液免疫反应

目的研究新冠灭活疫苗序贯免疫策略对Wuhan-Hu1和Omicron变异株中和抗体的影响。方法 BALB/c小鼠免疫两针Wuhan-Hu-1灭活疫苗, 再分别用Omicron或Wuhan-Hu-1灭活疫苗加强免疫, 采用酶联免疫吸附试验检测小鼠血清结合抗体水平;用水疱性口炎病毒假病毒检测系统检测小鼠血清中Omicron变异株中和抗体水平;采用酶联免疫吸附斑点实验检测特异性T细胞反应。结果与免疫一针Wuhan-Hu1灭活疫苗相比, 免疫两针疫苗提高小鼠血清特异性Wuhan-Hu1、Delta和Omicron受体结合域(receptor binding domain, RBD)IgG滴度。与加强免疫Wuhan-Hu1灭活疫苗组相比, 小鼠加强免疫Omicron灭活疫苗后, 血清Wuhan-Hu1和Omicron特异性结合抗体RBD IgG GMT分别提高1.41和1.26倍;针对Omicron变异株BA.1、BA.2、BA.4/5和BF.7的中和抗体GMT分别提高4.5、3.4、12.1和6.5倍。加强免疫Wuhan-Hu1或Omicron灭活疫苗后, 小鼠血清Wu-RBD IgA滴度高于...     

HIV-1包膜蛋白2G12和2F5中和表位的改造对假病毒形成及中和活性的影响

目的 研究HIV-1膜蛋白(Env)特定中和表位的改造对功能性假病毒形成及中和活性的影响.方法 采用环形诱变及Dpn I筛选的方法对Env进行定点突变,将2G12和2F5两个中和表位整合入不含该表位的BC亚型的Env上,比较改造对假病毒的形成情况及对2G12和2F5单抗的中和活性的影响.结果 对5株假病毒(BC02、BE03、BC04、BC05和BC12)的Env特定中和表位进行改造,其中BC04和BCl2的2G12表位改造后,不能形成假病毒,BC02、BC03和BC05增加2G12和2F5两个表位后,仍能够形成假病毒,且假病毒滴度较改造前无明显变化,改造后的BC03假病毒较改造前对单抗2G12和2175的中和活性均有所提高,而改造后的BE02和BC05假病毒较改造前对单抗2F5的中和活性增强,而对单抗2G12的中和活性无变化.结论 2G12中和表位部分位点的改造影响假病毒的形成,中和表位的增加能够提高单抗2G12的中和活性,为免疫原的优化提供了新思路.     

HIV-1毒株V3环顶端四肽多态性及原发耐药性研究

目的 探索我国河南省新蔡县既往献血人群中HIV-1病毒流行株env基因V3环顶端四肽多态性和pol基因原发耐药性变异特征.方法 套式聚合酶链反应（Nested-PCR）扩增51例确认HIV阳性样本env、pol基因部分区段并测序,PCR产物纯化后克隆,挑选克隆株鉴定为阳性后测序,以MEGA（version 3.0）等软件进行分析.结果 env基因V3环顶端四肽主要为GPGR、GPGQ、GPGK、GQGR;在pol基因PR区未发现有关蛋白酶抑制剂（PIs）的主要耐药性突变位点,在RT区共发现9条序列存在对NRTIs或NNRTIs中的一类药物耐药性突变.结论 GPGR这一典型的欧美B亚型V3环顶端四肽序列比例最高为44.44%;原发性耐药发生的比例较低,药物敏感性资料表明耐药性突变位点多表现为低度耐药性,因此提示我们在对该地区因献血感染HIV的患者在首次治疗时可不必以耐药性检测做指导.     

重组假病毒与活病毒法在评价抗HIV-1病毒药物中的比较

目的对比重组假病毒法与活病毒法在评价抗HIV-1药物中的效果。方法将pSG3△env质粒和带有ENV基因的质粒B01共转染获得重组假病毒。用重组假病毒分别与不同稀释度的药物共孵育,根据相对荧光单位的不同分析计算EC50、ED50。在P3实验室用活病毒分别与不同稀释度的药物共孵育,根据细胞病变程度的不同分析计算EC50。结果用重组假病毒法和活病毒法分别检测抗HIV-1药物奈维拉平（NVP）,其EC50。分别是88．9nmol／L、89．5nmol／L,CV值分别是0和0．6％。用重组假病毒法和活病毒法分别检测抗HIV-1药物茚地那韦（IDV）,其EC50。分别是0．36umol／L、0．23umol／L,CV值分别是0和60％。用重组假病毒法检测抗HIV-1药物可以定量计算出ED50,IDV和NVP的ED50分别是70．6nmol／L和0．62umol／L,CV值分别是14．3％和9．7％。结论重组假病毒法可以用于对抗HIV-1药物的评价。计算EC50时,重组假病毒法与活病毒法的结果相差不超过2倍,但活病毒具有生物危害,而重组假病毒法的重复性较好,并且还可以定量计算出药物的ED50.