常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒方法的建立及其应用

目的建立GI、GII型诺如病毒的常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测方法,并对两种方法进行应用。方法优化筛选出最佳PCR反应体系与反应条件,并从灵敏性、特异性、临床样品检测等方面对建立的方法进行比较与评价。结果该两种方法特异性强,与札幌病毒、轮状病毒、星状病毒、腺病毒同时检测无交叉反应,同一体系内GI、GII型诺如病毒相互之间没有干扰;常规RT-PCR最低检测限为103copies/μL,荧光定量RT-PCR最低检测限为102copies/μL;对180份临床粪便样品进行检测,常规RT-PCR则检测率为5.56%(10/180),符合率达97.22%,荧光定量RT-PCR检测率为8.33%(15/180),符合率达100%;对15份阳性样品测序分析,证实均为诺如病毒。结论建立的常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR均可用于诺如病毒的快速检测,荧光定量RT-PCR更为灵敏。     

多重荧光RT-PCR同时检测GⅠ型和GⅡ型诺如病毒方法的建立

目的建立可同时检测GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的双重荧光RT-PCR快速检测方法,并应用于临床标本的检测。方法使用针对GI型和GⅡ型诺如病毒各亚型代表株保守序列设计的特异性引物和TaqMan探针,通过调整引物、探针浓度优化最佳反应条件,建立一步法荧光RT-PCR快速检测反应体系。对该方法的灵敏度、特异性、稳定性进行评估,并对临床粪便标本进行检测,与已有的单重荧光RT-PCR方法进行比较。结果实验结果表明,该检测方法特异性强,对GⅠ型、GⅡ型诺如病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、甲型肝炎病毒进行检测,均无交叉反应;对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒核酸的最低检出限分别可达1pg/mL和10pg/mL,并且重复性好;对101份临床标本分别用已有的单重荧光RT-PCR和本文建立的多重荧光RT-PCR进行检测,结果显示本文建立的多重荧光RT-PCR方法对GⅠ型诺如病毒的检测能力优于前者。结论本研究建立的多重荧光RT-PCR方法能同时对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒进行快速检测,并且灵敏度高,特异性好,可用于感染性腹泻暴发中诺如病毒的快速检测。     

贝类中GI、GII诺如病毒快速检测与分群方法的建立

目的 建立贝类中GI、GII诺如病毒快速检测与分群方法。 方法 对比分析6株主要流行的GI、GII诺如病毒及参考诺如病毒的基因序列,筛选保守区域引物,优化建立SYBR Green I荧光定量检测与熔解曲线快速分群方法,并对实际样品检测验证。结果 引物P289/290可同时检测GI、GII诺如病毒,SYBR Green I荧光定量检测方法在病毒浓度10³~10⁹ copies 之间呈现良好的线性关系(R²=0.993,P＜0.01),熔解曲线Tm值可区分GI和GII不同基因群的诺如病毒(F=7 507.60,P＜0.05 )。120份贝类样品阳性检出率5.83%,其中阳性结果测序鉴定与快速分群方法结论一致。 结论 该方法成本低、检测快速、分群准确,具有良好重复性,适用于贝类中GI、GII诺如病毒的快速检测与分群。     

Real-time RT-PCR检测西尼罗病毒一步法的建立

目的建立针对西尼罗病毒E基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于西尼罗病毒感染样本的快速准确检测和定量。方法针对西尼罗病毒的保守基因E设计引物和探针,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性。结果本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出西尼罗病毒,不与日本脑炎病毒及其他病毒产生交叉反应。该方法的最低检出浓度为3.6×102copies/μl,标准曲线的线性范围为3.6×102～3.6×107copies/μl。结论本研究建立的一步法real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于西尼罗病毒感染样本的检测。     

口蹄疫病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立

摘要：为了快速高效的检测所有血清型口蹄疫病毒（FMDV）,根据FMDV聚合酶3D基因序列比对结果,设计特异性引物和MGB探针,通过反应条件的优化,建立了一步法荧光定量RT-PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果表明,该方法能特异性检测A型、O型、Asia I型FMDV,而对猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病毒、猪细小病毒、猪狂犬病毒、猪乙型脑炎等病原检测结果均为阴性;检测质粒的敏感性可达83.4copies/μL,检测病毒RNA的敏感性可达7.1fg/μL,比多重RT-PCR敏感性高10倍;对4份样品进行5次批内和批间重复检测,检测结果变异系数均小于2%。该方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于口蹄疫临床样品诊断、流行病学调查和畜产品安全监测。     

鼠类携带淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立检测鼠类携带淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV）的实时荧光定量RT-PCR方法。方法根据LCMV核蛋白编码基因序列设计合成特异性引物对和TaqMan荧光探针,经优化反应体系和条件,建立LCMV实时荧光定量RT-PCR检测方法,然后进行灵敏度、特异性和重复性试验,并对79份宁波口岸捕获的鼠样品进行检测。结果建立实时荧光定量RT-PCR方法对鼠肺总RNA检测的灵敏度为20pg,是常规PCR方法的100倍;试验的重复性良好,CV值为0.85%;试验的特异性为100%。用该方法检测79份鼠样品有3份LCMV阳性,与常规RT-PCR结果一致。结论成功建立了鼠LCMV实时荧光定量RT-PCR检测方法,对于监测和防控鼠传LCM有重要意义。     

一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的 建立一种汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)和汉城病毒(Seoul virus,SEOV)双重实时定量荧光RT-PCR检测方法。方法 根据HTNV和SEOV S基因设计引物和探针、优化反应条件,建立2种汉坦病毒的双重实时荧光定量RT-PCR方法。以甲型流感病毒、登革热病毒、新布尼亚病毒、寨卡病毒、新冠病毒阳性核酸为模板验证方法的特异性,将建立的方法与巢氏RT-PCR比较,确定方法对临床样本的适用性。结果 建立了一种HTNV和SEOV 双重实时定量荧光RT-PCR检测方法,该方法对2种型别病毒的最低检测限均为10 copies/μL,不同浓度标准品Ct值批内和批间差异均小于2%。与登革热病毒、新布尼亚病毒、寨卡病毒、新型冠状病毒、甲型流感病毒均无交叉反应。对10份肾综合征出血热急性期血清样本进行检测,结果9份为HTNV、1份为SEOV,与巢式RT-PCR方法结果一致。结论 建立的双重实时荧光定量RT-PCR方法可以快速对HTNV和SEOV 进行分型和定量检测,适用于肾综合征出血热临床早期诊断。     

应用Taq Man荧光定量RT-PCR快速检测肠道病毒的研究

目的建立一种快速、灵敏、特异的荧光定量RT-PCR检测肠道病毒的方法。方法根据GenBank中肠道病毒5′UTR序列,应用生物软件在保守区设计与筛选特异引物和TaqMan探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性和重复性。并通过对急性临床样本的检测,评价该方法的实际应用价值。结果该方法对肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型及柯萨奇病毒和埃可病毒等的检测有高度特异性,甲肝病毒、乙脑病毒、登革病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、诺如病毒等均呈阴性。该方法的检测下限达10-1TCID50/100μl。12份急性结膜炎病例结膜拭子标本中7份肠道病毒核酸阳性,普通RT-PCR方法5份阳性。结论TaqMan荧光定量RT-PCR方法快速、敏感、特异,适于肠道病毒的快速检测。     

尼帕病毒巢式RT-PCR方法的建立和初步应用

目的 建立灵敏、特异的检测尼帕病毒的巢式RT-PCR方法。方法 根据GenBank公布的尼帕病毒N基因序列,设计2对特异性引物(外引物和内引物),建立巢式RT-PCR方法,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行临床样品的检测。结果 该方法扩增的片段序列与源序列同源性均为100%。特异性试验结果表明本试验设计的内外侧引物不能从新城疫病毒、牛瘟病毒和日本乙型脑炎病毒中扩增出条带。敏感性试验结果表明,该方法最低能检测出的标准模板RNA浓度为39 fg/μL。100份临床样品检测结果全部为阴性。结论 初步建立了快速、灵敏、特异的检测尼帕病毒 N基因的巢式RT-PCR方法,可用于动物疫病监测和检验检疫等领域。     

一起诺如病毒GⅡ.17型引起的急性胃肠炎病原学诊断及基因特征分析

目的对长沙市2014年12月某厂区暴发的一起急性胃肠炎疫情进行病原学诊断及对其致病原进一步的基因分型研究。方法共采集6例病人肛拭子标本和可疑水源标本4份,提取核酸后,诺如病毒GI/GII型real-time RT-PCR试剂盒检测;阳性标本普通RT-PCR扩增VP1基因片段,产物测序后BLAST比对确定其型别,并构建进化树分析其进化关系。结果 10份标本real-time RT-PCR扩增结果显示为诺如病毒GII型,VP1区片段RT-PCR扩增后产物测序,BLAST比对发现与2014年香港诺如病毒株GII/Hu/HKG/2014/GII.17/CUHK-NS-463同源性最高,达99%,证实为诺如病毒GII.17型;构建系统进化树分析显示本次疫情分离的毒株与日本、香港、台湾等亚洲地区的毒株亲缘关系更为接近,而与美国、法国等地区的毒株亲缘关系则较远。结论诺如病毒是引起此次急性胃肠炎疫情的病原体,且引起暴发的病毒株属于GII.17型。     

贝类中GⅠ、GⅡ诺如病毒快速检测与分群方法的建立

目的建立贝类中GⅠ、GⅡ诺如病毒快速检测与分群方法。方法对比分析6株主要流行的GⅠ、GⅡ诺如病毒及参考诺如病毒的基因序列,筛选保守区域引物,优化建立SYBR Green Ⅰ荧光定量检测与熔解曲线快速分群方法,并对实际样品检测验证。结果引物P289/290可同时检测GⅠ、GⅡ诺如病毒,SYBR Green Ⅰ荧光定量检测方法在病毒浓度10~3～10~9 copies之间呈现良好的线性关系(R~2=0.993,P0.01),熔解曲线Tm值可区分GⅠ和GⅡ不同基因群的诺如病毒(F=7 507.60,P0.05)。120份贝类样品阳性检出率5.83%,其中阳性结果测序鉴定与快速分群方法结论一致。结论该方法成本低、检测快速、分群准确,具有良好重复性,适用于贝类中GⅠ、GⅡ诺如病毒的快速检测与分群。     

2018—2021年长沙市诺如病毒暴发疫情流行特征分析

目的 了解2018年1月至2021年3月长沙市诺如病毒(Norovirus, NoV)暴发疫情的流行病学和进化特征。方法 采集2018年1月至2021年3月急性胃肠炎暴发疫情临床病例标本463份，采用实时荧光RT-PCR法进行诺如病毒GI和GII基因群的鉴定；对阳性标本采用特异引物RT-PCR扩增，所得扩增产物测序后进行进化分析。结果 2018年1月至2021年3月共报告诺如病毒疫情64起，采集标本463份，NoV检出阳性率为57.67%,男性检出率为60.16%,女性检出率为54.71%;12～18岁年龄组检出率最高，达74.24%。每年冬春季(10月至次年3月)为流行高峰季节；有64.06%(41/64)的疫情发生在托幼机构。64起暴发疫情中由GII基因群NoV引起的占82.81%(53/64),由GI基因群NoV引起的占7.81%(5/64),混合基因型占9.38%(6/64)。GI基因群NoV的具体基因型别有GI.2[P2]、GI.3[P13]、GI.5[P4]、GI.6[P11];测序分型成功的GII基因群NoV具体基因型别有GII.1[P16]、GII.2[P16]、GII...     

Flanders病毒TaqMan RT-PCR检测方法的建立

目的 应用TaqMan PCR技术建立针对Flanders病毒(Flanders virus, FLAV)的实时荧光定量PCR检测方法。方法 下载GenBank中FLAV基因序列资料并进行多序列比对分析,选择其L基因中的高保守序列片段进行FLAV特异引物与探针的设计,使用来自于不同科属的15株病毒验证方法特异性,通过重复/平行实验验证方法稳定性,并利用体外转录的L基因RNA标准品建立基因拷贝数绝对定量分析模型。结果 引物与探针工作特异性良好,同一样品重复检测Ct值的变异系数均小于1.7%,定量分析模型灵敏度达到100 copies/PCR。结论 建立完成针对FLAV的TaqMan PCR检测方法。实验结果显示,本方法具有高特异性、高敏感性、高稳定性、简便、易操作的特点,为今后对FLAV的检测、监测及相关研究提供技术手段。     

狂犬病病毒荧光定量RT—PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立狂犬病病毒快速检测法。方法根据狂犬病病毒核蛋白基因的保守序列分别设计两对引物及其相应的TaqMan探针。构建pMD-N重组质粒,建立荧光定量RT-PCR绝对定量标准品,并对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并与普通RT-PCR法进行比较;作重复性和特异性检验后进行临床标本的检测。结果构建了绝对定量的参照质粒,标准曲线相关系数为0.998。狂犬病病毒荧光定量RT-PCR检测反应的灵敏度为10个TCID_(50);5种非狂犬病病原体检测均为阴性。结论建立的狂犬病病毒的荧光定量RT- PCR检测方法快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好,可以应用于临床样品的检测。     

应用含内参的多重实时荧光RT-PCR方法快速检测登革病毒和基孔肯雅病毒

目的 建立一种登革病毒、基孔肯雅病毒并含人类基因内参检测的多重实时荧光RT-PCR方法,能在同一反应管内同时检测目前发现的所有来源的登革病毒或基孔肯雅病毒。方法 针对登革病毒3′端非编码区和基孔肯雅病毒结构蛋白E2-6K-E1区以及人体各类组织细胞中均能稳定表达的RNAse P基因,设计了3套特异性引物和探针,建立了1套能同时检测登革病毒、基孔肯雅病毒及含有人类基因检测内参的多重实时荧光RT-PCR方法,对其灵敏性和特异性进行了验证,并对临床发热病人标本进行了应用评估。结果 该方法对检测体外转录合成的登革病毒和基孔肯雅病毒RNA的灵敏性可达最低每个反应10～100拷贝,对检测登革1型病毒和基孔肯雅病毒的灵敏性分别可达最低每个反应0.1 TCID₅₀/mL和1 TCID₅₀/mL。用20株登革病毒、4株基孔肯雅病毒和日本脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、盖塔病毒、辛德毕斯病毒各1株进行检测,方法的特异性均为100%。方法应用于189份发热病人血清标本检测,可准确地鉴定出其中登革病毒或基孔肯雅病毒核酸阳性的标本,且所有血清标本均能被内参引物和探针有效地扩增和杂交。结论 本研究建立了一种高灵敏性、高特异性且含人类基因内参检测的登革病毒和基孔肯雅病毒多重实时荧光RT-PCR检测方法,可作为登革热或基孔肯雅热病人早期快速鉴别诊断的有效工具,也可用于蚊媒携带登革病毒或基孔肯雅病毒的高通量快速筛查。     

基于TaqMan探针的猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒实时荧光定量PCR方法的建立

目的 建立一种能检测猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒（PRRSV）的TaqMan探针荧光定量PCR方法。方法 根据PRRSV的ORF7基因保守区的核苷酸序列设计引物和TaqMan探针,通过探针浓度的优化,建立检测PRRSV的TaqMan探针荧光定量PCR方法。用该方法对30份临床疑似病料进行检测, 并与常规RT-PCR方法和病毒分离方法进行比较。结果 TaqMan荧光PCR检测PRRSV的最佳探针浓度为0.4μmol,检测灵敏度可达3.51拷贝/μl。检测的30份样品与病毒分离结果的符合率为100%,与普通PCR的检测结果（25/30）比较,本方法对临床样品的检出率（28/30）更高。结论 建立的方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床样品的检测。     

实时荧光定量RT-PCR检测急性出血性结膜炎CoxA24v病毒

目的对检测急性出血性结膜炎(AHC)病原CoxA24v的实时荧光定量RT-PCR方法进行特异性、敏感性、稳定性等方面的评估。方法利用实时荧光定量RT-PCR检测肠道病毒CoxA24v和其他几种肠道病毒,验证方法的特异性;根据TCID50进行倍比稀释,验证该方法的敏感性;将样品进行倍比稀释,做重复试验,验证方法的准确性。利用实时荧光定量RT-PCR对疑似AHC患者眼拭子进行检测。结果该方法对CoxA24v病毒的检测具有高度的特异性,对柯萨奇病毒A16、肠道病毒71等其他肠道病毒均无交叉反应。检测的灵敏度达0.1TCID50。用该方法对6个不同浓度的CoxA24 v进行5次检测,获得的结果重复性好。采用该方法检测疑似AHC患者标本,阳性者均测序,证明是Cox-A24v,未出现假阳性。结论实时荧光定量RT-PCR法是一种快速、敏感、特异、准确的方法,适用于急性出血性结膜炎的早期诊断和鉴别诊断。     

基因1型狂犬病病毒一步法荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的在我国狂犬病均由基因1型狂犬病病毒（rabies virus,RV）引起。本研究针对RV N基因保守序列设计并合成了一套简并引物和Taqman探针,在优化反应条件的基础上,建立了检测RV核酸的一步法荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）检测方法。方法与结果该方法能特异检测基因1型,不能检测基因2-7型和犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）、犬腺病病毒（CAV）、水泡性口炎病毒（VSV）、日本乙型脑炎病毒（JEV）等5种非狂犬病病原体,其检测灵敏度可达到4.68个TCID50的病毒含量。用该方法对29份新鲜和5份腐败的临床犬脑组织样品进行检测,并与国际金标准确诊方法狂犬病荧光抗体染色法（FAT）和乳鼠脑内接种试验（MIT）及本实验室建立的套式RT-PCR方法进行比较。结果表明所建立的qRT-PCR与套式RT-PCR的符合率为100%,二者均检测出12份阳性的新鲜样品和5份阳性的腐败样品,而FAT只检测出12份阳性的新鲜样品和1份阳性的腐败样品,MIT只检测出12份阳性,未检测出阳性腐败样品。检测中FAT和MIT确诊的所有阳性样品在qRT-PCR检测均是阳性,而在FAT检测为阴性的4份腐败样品在qRT-PCR为阳性,说明所建立的qRT-PCR方法准确性达到了FAT和MIT的水平,而且灵敏度更高,更适合于腐败样品的检测。结论研究结果表明该qRT-PCR方法特异性好、灵敏度高、污染率低、操作简单,在我国动物狂犬病临床诊断上具有巨大的应用价值。     

一种水中诺如病毒富集方法的建立及应用

目的建立混合纤维素膜—聚乙二醇(PEG)沉淀法富集水中诺如病毒的方法并评价效果,以便应用于不同水源中诺如病毒的检测。方法采集乌鲁木齐市地区自来水、河水、污水样品15份,在样品中加入MS2噬菌体,通过混合纤维素膜—聚乙二醇(PEG)沉淀法富集;计算外加MS2回收率,并采用实时荧光RT-PCR方法检测样品中诺如病毒。结果自来水、河水和污水中MS2的平均回收率分别为4.8%,5.4%和9.7%;15份水样中未检出诺如病毒。结论本方法富集效果较好,可用于本地自来水、河水和污水中诺如病毒的检测,但仍需进一步优化以增强病毒的富集效果。     

猪戊型肝炎病毒SYBR Green Ⅱ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

目的建立一种快速检测猪戊型肝炎病毒(HEV)的方法。方法针对HEVORF2基因保守序列设计1对引物,基于SYBR GreenⅡ染料,建立了检测HEV的实时荧光定量RT-PCR方法。结果该方法只能对猪戊型肝炎病毒检测到荧光,对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪嵴病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒均不能检测到荧光信号,特异性好;检测HEV时,在4.10×10~2~4.10×10~8拷贝/μL内具有良好的线性关系,灵敏度可以达到1.00×10~2拷贝/μL,扩增相关系数为0.996,扩增产物的熔解温度为84.0℃±0.1℃,该检测方法组内变异系数为0.83%~0.94%,组间变异系数为0.83%~0.94%,重复性较好。利用该方法对临床61份来自四川各地的猪肠内容物进行检测,检出9份阳性,且与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。结论建立的针对HEV的荧光定量RT-PCR有效可行,对HEV的临床检测和进一步研究奠定了基础。