日本血吸虫重组Bb（pGEX—Sj26GST）疫苗免疫BALB／c小鼠脾细胞动态观察

目的观察日本血吸虫重组Bb（pGEX—Sj26GST）疫苗免疫BALB／c小鼠后脾细胞增殖、亚群和凋亡的动态变化。方法将疫苗分别经皮下注射（SC组）和鼻腔粘膜接种（IN组）免疫BALB／c鼠,在免疫后O～22周每2周每组随机剖杀4只小鼠,无菌取脾,制成单个悬浮脾细胞,用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）检测脾细胞增殖水平、用流式细胞仪（FACsort）检测T细胞亚群和脾细胞凋亡状况。结果未刺激及sjAWA刺激时SC组小鼠脾细胞增值水平于免疫后4～20周明显升高,ConA刺激时于4～18周显著升高,均于免疫后8周达最高水平;IN组脾细胞增殖水平原液组、SjAwA组和ConA组分别于2～18周、2～10周及14～18周、2～8周和12～18周显著升高,均于免疫后4周达最大值（P〈0．01或P〈0．05）。SC组和IN组CD＋T细胞分别于免疫后2～14周、2周及6～16周升高,并于8周达峰值（P〈0．01或P〈0．05）;两组CD＋T细胞均于2～20周轻微升高,分别于8周和6周达较高值（P〉0．05）。未刺激和ConA刺激时SC组脾细胞凋亡水平分别于免疫后2～4周、2～6周升高显著,均于免疫后2周达最大值（P〈O．01或P〈O．05）;IN组均于4周显著升高并达峰值（P〈O．01）。结论日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj26GST）疫苗可诱导脾细胞的增殖,增加cD＋T细胞的数目,抑制脾细胞的凋亡而发挥保护性免疫应答。     

日本血吸虫混合DNA疫苗pBK-CMV-Sj26/Sj32诱导小鼠的免疫应答

目的　观察含日本血吸虫候选疫苗分子谷胱甘肽S -转移酶 (Sj2 6 )和天冬酰胺肽链酶 (Sj32 )的真核载体 pBK-CMV -Sj2 6 /Sj32诱导小鼠的免疫应答情况。 方法　将质粒按 5 0 μg/只在 0w ,3w ,5w免疫小鼠股四头肌 ,第一次免疫后取小鼠脾细胞作T淋巴细胞转化实验 ;在 0w、3w和 6w经小鼠尾静脉取血 ,ELISA检测血清中抗体效价及阳性反应率。结果　淋巴细胞转化实验示血吸虫成虫抗原能特异性刺激免疫鼠脾细胞 ;第一次免疫后特异性抗体效价开始升高。抗体最高效价为 1∶2 0 ,3次免疫后有 91.7%小鼠血清呈阳性反应。结论　真核载体 pBK -CMV -Sj2 6 /Sj32可诱导小鼠体液及细胞免疫应答     

日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗的构建及鉴定

目的构建并鉴定日本血吸虫重组双歧杆菌属两歧双歧杆菌(Bb)(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗。方法从本室保存的BL21(DE3)(pET28α-Sj26GST-Sj32)重组菌中抽提质粒pET28α-Sj26GST-Sj32,PCR扩增Sj26GST-Sj32融合基因,将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-Sj26GST-Sj32。将此重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,抽提质粒并进行BamHⅠ及EcoRⅠ双酶切,鉴定载体片段及目的基因片段长度。用电穿孔法将重组质粒pGEX-Sj26GST-Sj32转化至Bb,构建重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32),抽提质粒,进行PCR鉴定。结果 PCR成功扩增出长度为1 991bp的Sj26GST-Sj32融合基因;双酶切证实Sj26GST-Sj32融合基因成功插入质粒pGEX-1λT中;PCR证实从重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗中扩增出1991bp的Sj26GST-Sj32融合基因。结论成功构建重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗。     

日本血吸虫混合DNA疫苗pBK-CMV-Sj26/Sj32诱导小鼠的免疫应答

目的　观察含日本血吸虫候选疫苗分子谷胱甘肽S -转移酶 (Sj2 6 )和天冬酰胺肽链酶 (Sj32 )的真核载体 pBK-CMV -Sj2 6 /Sj32诱导小鼠的免疫应答情况。 方法　将质粒按 5 0 μg/只在 0w ,3w ,5w免疫小鼠股四头肌 ,第一次免疫后取小鼠脾细胞作T淋巴细胞转化实验 ;在 0w、3w和 6w经小鼠尾静脉取血 ,ELISA检测血清中抗体效价及阳性反应率。结果　淋巴细胞转化实验示血吸虫成虫抗原能特异性刺激免疫鼠脾细胞 ;第一次免疫后特异性抗体效价开始升高。抗体最高效价为 1∶2 0 ,3次免疫后有 91.7%小鼠血清呈阳性反应。结论　真核载体 pBK -CMV -Sj2 6 /Sj32可诱导小鼠体液及细胞免疫应答     

日本血吸虫重组两歧双歧杆菌pGEX-Sj14-3-3疫苗免疫BALB/c小鼠的血清抗体动态观察

目的 动态观察重组两歧双歧杆菌(Bb)pGEX-Sj14-3-3疫苗免疫BALB/c小鼠后血清IgG及其亚类、IgE和IgA的变化.方法 将96只BALB/c小鼠接体质量随机分为2组,每组48只,分别经口服灌胃(PO组)和鼻腔黏膜途径(IN组)用重组Bb( pGEX-Sj14-3 -3)疫苗单次免疫小鼠,免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22周时每组各剖杀4只小鼠,眼球取血,采用常规酶联免疫吸附实验(ELISA法)检测小鼠血清IgG及其亚类、IgE和IgA水平.结果 PO组和IN组小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE、IgA水平分别在免疫后2～22、2～ 14、2 ～ 22、2～22、2～20、2～22、2～22周升高,PO组分别在8、6、6、4、8、10、6周达最高水平(0.065±0.001、0.021±0.002、0.011±0.001、0.015±0.003、0.014±0.002、0.011±0.001、0.013±0.002),与同组0周(0.032±0.001、0.015±0.002、0.005±0.002、0.005±0.001、0.006±0.001、0.006±0.001、0.005±0.001)比较,除IgG1、IgG2b外,差异有统计学意义(P均＜0.05或＜0.01);而IN组分别在4、6、4、4、8、10、8周达最高水平(0.064±0.003、0.022±0.002、0.012±0.003、0.019±0.001、0.013±0.001、0.015±0.001、0.014±0.003),与同组0周(0.032±0.001、0.015±0.002、0.005±0.002、0.005±0.001、0.006±0.001、0.006±0.001、0.005±0.001)比较,除IgG1、IgA外,差异均有统计学意义(P均＜0.05或＜0.01).结论 重组Bb(pGEX-Sj(1)4-3-3)疫苗在免疫早期(2～ 10周)可通过促进IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG1、IgE、IgA合成诱导小鼠产生Th1和Th2混合型免疫应答.     

日本血吸虫重组两歧双歧杆菌(pGEX-Sj32)疫苗构建及鉴定

目的 构建和鉴定日本血吸虫重组两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum,Bb)pGEX-Sj32疫苗.方法 从重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所构建的重组大肠埃希菌BL21 (pET28α-Sj32)中抽提质粒pET28α-Sj32,通过PCR扩增Sj32抗原编码基因;将Sj32基因定向克隆至大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-Sj32,将该重组质粒转化至大肠埃希菌BL21感受态细胞(DE3),抽提质粒后进行双酶切鉴定;采用电穿孔法,将重组质粒pGEX-Sj32转化至Bb,构建Bb(pGEX-Sj32)疫苗,再从该疫苗中抽提重组质粒pGEX-Sj32,以其为模板进行PCR鉴定.结果 从抽提质粒pET28α-Sj32中PCR扩增出长度约为1 270 bp的Sj32基因片段;重组质粒pGEX-Sj32经双酶切鉴定,获得长度为4 947 bp的载体片段和长度为1 270 bp的Sj32基因片段;以抽提的疫苗质粒pGEX-Sj32为模板进行PCR扩增,得到了长度约为1 270 bp的Sj32基因片段,与预期结果相符.结论 成功构建了日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗.     

致弱日本血吸虫尾蚴诱导BALB/c小鼠早期免疫应答动态变化研究

目的比较辐照致弱日本血吸虫尾蚴免疫小鼠与正常感染小鼠早期免疫活化程度及其动态变化差异。方法采用流式细胞术（FCM）和免疫组织化学（IHC）方法比较辐照致弱尾蚴免疫小鼠与正常感染小鼠早期脾组织和/或肺组织中树突状细胞（DC）表面分子CD11c、T细胞表面分子CD25表达差异及脾细胞和外周血中CD3＋CD25＋/CD3＋T细胞比例,分析T细胞免疫活化程度及其动态变化。结果在感染后7d,脾细胞中的CD3＋CD25＋/CD3＋T细胞比例致弱尾蚴免疫组为（19.52±3.65）%,明显低于正常感染组的（22.12±3.24）%;而在第14、21天,致弱尾蚴免疫组这一比例分别为（28.73±3.94）%和（26.43±0.40）%,均高于正常感染组的（13.68±3.64）%和（14.42±2.24）%。在攻击感染后7、14、21d,致弱尾蚴免疫组与正常感染组小鼠在肺组织中的CD11c＋DC表达率分别为（1.05±0.16）%和（0.96±0.15）%、（1.34±0.15）%和（1.09±0.17）%、（1.49±0.14）%和（0.97±0.16）%,脾组织中CD11c＋DC表达率分别为（2.05±0.26）%和（1.95±0.18）%、（2.24±0.25）%和（2.17±0.25）%、（2.18±0.26）%和（2.06±0.18）%。在攻击感染后7、14、21d,致弱尾蚴免疫组与正常感染组小鼠在肺组织中CD25＋T细胞表达率分别为（1.24±0.13）%和（1.17±0.16）%、（1.48±0.11）%和（1.25±0.13）%、（1.55±0.14）%和（0.97±0.12）%,脾组织中CD25＋T细胞表达率分别为（3.25±0.22）%和（2.93±0.20）%、（4.57±0.23）%和（3.69±0.24）%、（4.28±0.24）%和（3.86±0.26）%,紫外线辐照致弱尾蚴免疫小鼠较正常感染小鼠在攻击感染后第7、14、21天能在肺组织募集更多的CD11c＋DC并激活更多的CD25＋T细胞。结论致弱日本血吸虫尾蚴免疫小鼠在攻击感染后14、21d,小鼠体内T细胞激活程度和肺部DC活化程度均高于正常感染组,提示致弱尾蚴在肺部可募集更多抗原递呈细胞并使之活化。     

日本血吸虫重组BCG—Sj26GST疫苗诱导小鼠血清IgG及其亚类免疫应答的研究

目的 研究日本血吸虫重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗接种小鼠,尾蚴攻击后诱导的血清ＩｇＧ及其亚类变化。方法 采用１０＾６ＣＦＵ和１０＾８ＣＦＵ疫苗皮下接种ＢＡＬＢ／Ｃ鼠,接种后８周用日本血吸虫尾蚴进行攻击感染,感染后６周扑杀小鼠,收集血清,用常规ＥＬＩＳＡ法检测ＩｇＧ及其亚类。结果 疫苗免疫后８周血清ＩｇＧ水平明显升高;疫苗免疫,尾蚴攻击后６周血清ＩｇＧ２ａ显著培养,但ＩｇＧ１和ＩｇＧ２ｂ无明显变化。结论 日本血吸虫重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗可能诱导宿 主产生高水平的ＩｇＧ和ＩｇＧ２ａ,从而提高其抗血吸虫感染的保护性免疫力。     

重组日本血吸虫副肌球蛋白诱导小鼠保护力的研究

目的 用重组日本血吸虫副肌球蛋白（rSj97)免疫小鼠,观察保护效果。方法 小鼠随机分为3组,免疫组在0、2、15周,皮下注射rSj97加佐剂Quil,同一时间佐剂对照组和空白对照组注射等量QuilA和缓冲液A,第3次免疫后,每鼠经腹部贴片攻击感染50条尾蚴,感染后45d剖杀小鼠,观察其减虫和减卵效果。结果 与缓冲液和QuilA对照组相比,rSj97 QuilA免疫组的减虫率分别为44．1％（P＜0．01）和17．8％（P＜0．05）,每克肝组织虫卵数（LEPG）减少率分别为76．5％（P＜0．01）和16．9％（P＜0．05）,每雌肝组织虫卵数（LEPF）减少率分别为62．2％（P＜0．01）和6．1％（P＜0．05）。结论 rSj97加佐剂QuilA可诱导小鼠产生明显的抗血吸虫攻击感染的保护性免疫力及抗生殖免疫力。     

日本血吸虫噬菌体肽疫苗诱导小鼠免疫保护作用的初步研究

日本血吸虫病是我国五大寄生虫病之一 ,严重危害人民健康〔1〕,作为预防和控制血吸虫病的一种手段 ,疫苗的研究具有非常重要的意义。目前 ,国内外研究的侯选疫苗有照射致弱尾蚴疫苗 ,可溶性虫卵抗原疫苗 ,核酸疫苗 ,基因工程重组疫苗及血吸虫多抗原肽疫苗等。但由于疫苗的安全性和保护性效果不理想或不稳定 ,以及虫体来源困难等因素 ,至今尚未得到可实际应用的疫苗。噬菌体呈现技术 (PDT)是利用丝状噬菌体体外表达外源性肽段 ,研究蛋白质与蛋白质之间相互识别相互作用的分子生物学技术〔2〕。筛选噬菌体肽库获得的血吸虫特异抗原模拟表位…     

日本血吸虫重组铁蛋白疫苗和表位疫苗联合免疫诱导的保护性免疫研究

目的 探讨日本血吸虫重组铁蛋白疫苗和日本血吸虫抗原表位疫苗联合免疫对昆明感染鼠的免疫保护作用。方法 将制备的日本血吸虫重组铁蛋白疫苗和用特异性抗体筛选噬菌体随机12肽库获得的日本血吸虫抗原表位疫苗联合或单独免疫昆明鼠,共3次,分别在0、2、4周进行。每次背部皮下多点注射50μg重组铁蛋白和/或10~(13)pfu表位疫苗,第6周每鼠经腹部感染(40±1)条日本血吸虫尾蚴。攻击感染后42d剖杀冲虫,计数成虫及肝虫卵数。在免疫前和末次免疫后从小鼠尾静脉采血,分离血清,用间接ELISA法检测抗体反应。结果 联合免疫组与对照组相比,获得了32.8％的减虫率和63.0％的减卵率;单独重组铁蛋白疫苗免疫组的减虫率为21.6％,减卵率为49.5％;单独表位疫苗免疫组减虫率和减卵率分别为17.1％和44.3％,显著低于联合组(P<0.05);联合免疫组小鼠体内IgG的抗体水平明显高于其他各组。结论 日本血吸虫重组铁蛋白疫苗和表位疫苗联合免疫的效果优于单独应用铁蛋白免疫和表位疫苗免疫。     

日本血吸虫重组抗原rSjGST-32诱导小鼠保护性免疫效果的比较

目的　探索日本血吸虫重组抗原rSjGST-32适合的免疫剂量。　方法　以50、100、200μg3个不同剂量rSjGST-32加佐剂皂角甙A(QuilA)50μg免疫BALB/c小鼠,同时设QuilA和PBS对照组。ELISA法检测抗体水平。末次免疫4wk后攻击感染,用减虫率及减卵率表示保护力。　结果　与PBS对照组比较,50、100、200μgrSjGST-32组的减虫率分别为38.1%,47.8%和48.8%;每克肝卵(LEPG)减少率分别为39.1%,53.5%和53.6%;每条雌虫每克肝所含虫卵数(LEPF)减少率分别为22.5%,22.8%和21.8%;抗体滴度分别达1∶51200,1∶102400和1∶102400。　结论　重组抗原rSjGST-32加QuilA佐剂免疫小鼠,以100μgrSjGST-32剂量较为适合。     

日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗免疫小鼠保护力的观察

目的探讨日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗免疫鼠后对尾蚴攻击感染的保护作用。方法采用10^6和10^8CFU疫苗皮下接种免疫BALB／C鼠，免疫后8周用日本血吸虫尾蚴进行攻击感染，感染后6周剖杀小鼠，计算减虫率和减卵率，观察肝脏病理变化，测量虫卵肉芽肿周长和面积，测定血清中CAg、IgG及其亚类水平，同时设有PBS和BCG对照。结果疫苗接种组的减虫率为16．64％-46．20％，减卵率为55．75％-60．50％，肝组织病变明显减轻，虫卵肉芽肿的平均周长和平均面积显著减少，血清IgG和IgG2a水平明显升高，10^8CFU组CAg升高。结论日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗是一种新型比较理想的疫苗，值得进一步深入研究。     

恶性疟原虫重组质粒DNA接种诱导BALB/c小鼠的免疫应答

目的：观察重组质粒ＤＮＡ直接免疫接种诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的免疫应答水平，为恶性疟原虫ＤＮＡ疫苗在动物和人体的应用提供依据。方法：构建编码多价保护性抗原的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８，ＰＣＲ法检测免疫鼠的肌肉、肝脏、肾脏、心脏、脾脏和肺组织中ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８，ＥＬＩＳＡ、Ｔ淋巴细胞转化试验、体外抑制试验观察其诱导的体液免疫及细胞免疫水平。结果：用ＰＣＲ法从上述组织中均检测到ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８，ＥＬＩＳＡ法测得免疫鼠血清的特异性抗体滴度达１２５６０，淋巴细胞转化试验显示恶性疟原虫可溶性抗原能特异性地剌激免疫鼠脾细胞增殖，免疫血清在体外还能抑制恶性疟红内期疟原虫的生长、发育。结论：编码恶性疟原虫多价保护性抗原的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８直接免疫接种，能特异性地剌激ＢＡＬＢ／ｃ小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答，其免疫血清在体外对疟原虫生长发育具有明显抑制作用。     

恶性疟原虫重组质粒DNA接种诱导BALB/c小鼠的免疫应答

目的：观察重组质粒DNA直接免疫接种诱导BALB／c小鼠的免疫应答水平，为恶性疟原虫DNA疫苗在动物和人体的应用提供依据。方法：构建编码多价保护性抗原的重组质粒pcDNA3－Pf8，PCR法检测免疫鼠的肌肉、肝脏、肾脏、心脏、脾脏和肺组织中pcDNA3－Pf 8，ELISA、T淋巴细胞转化试验、体外抑制试验观察其诱导的体液免疫及细胞免疫水平。结果：用PCR法从上述组织中均检测到pcDNA3－Pf8，ELISA法测得免疫鼠血清的特异性抗体滴度达12560，淋巴细胞转化试验显示恶性疟原虫可溶性抗原能特异性地剌激免疫鼠脾细胞增殖，免疫血清在体外还能抑制恶性疟红内期疟原虫的生长、发育。结论：编码恶性疟原虫多价保护性抗原的重组质粒pcDNA 3-Pf 8 直接免疫接种, 能特异性地剌激BALB/c 小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答, 其免疫血清在体外对疟原虫生长发育具有明显抑制作用。     

重组日本血吸虫铁蛋白粘膜免疫诱导小鼠保护力的研究

目的　探讨重组日本血吸虫铁蛋白(rSjFer)粘膜免疫诱导小鼠抗血吸虫的保护性免疫。　方法　实验鼠分为8组,每组10只,包括rSjFer、霍乱毒素B亚单位(CTB)和rSjFer+CTB灌胃免疫组,以及rSjFer、CTB和rSjFer+CTB滴鼻免疫组,PBS灌胃及滴鼻对照组。在第3次免疫后2wk,经腹部感染日本血吸虫尾蚴40±1条,45d后解剖观察减虫率和减卵率。在免疫前和感染前尾静脉采血和取粪样,ELISA检测血清IgA、IgG及粪内sIgA水平。　结果　灌胃及滴鼻各组减虫率依次为3.98%、3.77%、25.57%及7.69%、4.50%、33.35%,每克肝减卵率依次为3.76%、2.46%、34.75%及4.40%、0.06%、60.10%。　结论　rSjFer粘膜免疫能诱导小鼠产生抗血吸虫的保护性免疫。     

日本血吸虫成虫31/32kD抗原诱导小鼠产生抗卵免疫的初步研究

本文采用超凝胶柱层析法分离纯化日本血吸虫31/32kD抗原.免疫小鼠诱导保护性免疫力.结果表明,这种保护性免疫力仅有抗卵效果,无抗成虫作用.31/32kD免疫小鼠后可使小鼠粪卵减少63.8%—78.3%;雌虫子宫内虫卵降低53.2%;肝、肠中死卵量明显增加,说明31/32kD抗原可诱导小鼠产生抗卵免疫干扰虫卵形成,加速虫卵死亡,提示它可能是一种有希望的抗血吸虫病理疫苗的候选抗原.     

重组日本血吸虫铁蛋白诱导小鼠保护性免疫的研究

目的 用重组日本血吸虫铁蛋白免疫小鼠,观察抗血吸虫的免疫保护作用。方法 用重组的日本血吸虫铁蛋白（ＧＭ－ＣＳＦ－ＳｊＦｅｒｒｉｔｉｎ）免疫小鼠,经皮下免疫３次,在第３次免疫后４周,经腹部感染日本血吸虫尾蚴４０条或５０条,４５ｄ后杀鼠,观察减虫效果。结果 用ＧＭ－ＣＳＦ－ＳｊＦｅｒｒｉｔｉｎ,ＩＬ－１２＋ＧＭ－ＣＳＦ－ＳｊＦｅｒｒｉｔｉｎ和ＦＣＡ＋ＧＭ－ＣＳＦ－ＳｊＦｅｒｒｉｔｉｎ免疫小鼠分别获得２     

日本血吸虫Mr 26000 GSTDNA疫苗和重组蛋白疫苗联合免疫的保护作用研究

目的 观察日本血吸虫Mr26000谷胱甘肽S-转移酶(Sj26)DNA疫苗和重组蛋白(rSj26GST)疫苗联合免疫对小鼠的保护作用。方法 将Sj26基因克隆入含有增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N3,构建重组质粒pEGFP-Sj26,并转染幼仓鼠肾细胞(BHK),用荧光显微镜和蛋白质印迹法(Western blotting)检测蛋白的表达。联合免疫组BALB/c小鼠分别在第0、2周用pEGFP-Sj26免疫2次,第4周再用rSj26GST加强免疫1次;而单独免疫的pEGFP-Sj26组及rSj26GST组,与上组同步各自免疫3次。末次免疫后2周进行感染攻击,45d后剖杀,计数成虫及肝内虫卵。同时设PBS对照组。结果 pEGFP-Sj26在BHK中能有效表达。联合免疫组的减虫率为50·8%,显著高于pEGFP-Sj26(28.0%)和rSj26GST组(25.5%)(P值均<0.01)。联合免疫组以及pEGFP-Sj26、rSj26GST组减卵率分别为32.7%、20.6%、33.0%;联合免疫组及rSj26GST组,肝组织中每条雌虫平均产卵数显著低于PBS对照组(P值均<0.01)。结论 联合免疫组的保护作用优于pEGFP-Sj26和rSj26GST单独免疫组。