人骨髓间充质干细胞诱导分化为汗腺细胞的实验研究

目的：研究人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在体外诱导分化为人汗腺细胞（hSGCs）。方法：体外分别分离培养hMSCs和hSGCs,原代培养hSGCs融合后,收集细胞,制备汗腺细胞匀浆,用含10%汗腺细胞匀浆的汗腺培养基来诱导培养hMSCs。1周后,检测诱导培养的hMSCs的抗原表达。结果：培养的hSGCs表达CK19和CEA;hMSCs表达CD44、105,不表达CK19、CD34和CEA。诱导培养1周,免疫细胞化学染色示诱导培养组少量细胞表达CEA和CK19,而对照组未见CEA和CK19阳性细胞;流式细胞仪检测CEA在诱导培养组的阳性表达率约为（6.2±1.2）%,对照组（0.9%±0.0）%（P〈0.05）。结论：在无完整汗腺细胞存在的情况下,hMSCs在体外也可诱导分化为hSGCs。     

兔骨髓间充质干细胞体外BrdU标记的实验研究

目的 探讨体外5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyuridine, BrdU)标记兔骨髓间充质干细胞 (bone marrow-derived mesenchymal stem cells, MSCs) 的方法,探索BrdU体外标记兔MSCs的最佳时间和最佳浓度。方法 通过形态学及流式细胞术鉴定全骨髓培养法分离培养的细胞为MSCs。MSCs经不同BrdU浓度标记及不同BrdU标记时间, 免疫细胞化学法鉴定并评估。结果 全骨髓培养法培养的MSCs经流式细胞术检测,证明所培养的细胞为较纯的MSCs。BrdU标记的阳性细胞率随标记时间延长以及标记物BrdU的浓度增加而逐渐增高, 40μmol/L及72h标记阳性率达85-95%。结论 应用BrdU体外标记MSCs是安全可靠的,兔MSCs体外BrdU标记最佳时间和最佳浓度分别为72h和40μmol/L。     

全骨髓贴壁改良法分离培养人骨髓间充质干细胞及标记鉴定

目的对比、探求分离培养人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells,hMSCs）的方法,探讨hMSCs鉴定和标记的方法,为进一步的实验研究打下基础。方法采集成人健康志愿者骨髓5mL,全骨髓贴壁法、全骨髓贴壁改良法、密度梯度离心法分离纯化、培养和扩增,获得hMSCs,对比三种方法。＂慢冻速融＂的原则进行细胞冻存、复苏。流式细胞术检测hMSCs的表面标志。hMSCs经5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）标记,免疫细胞化学法测定并评估。结果 hMSCs运用三种方法均可获得,比较全骨髓贴壁改良培养法最为方便高效分离获取hMSC、体外扩增迅速。流式细胞仪检测结果显示：CD44阳性及CD71弱阳性,表达率分别为95.05%,78.86%;CD34、CD45阴性,表达率分别为3.40%,2.88%。Brdu最佳标记浓度和时间分别为10μmol/L和72 h。结论 hMSCs采取全骨髓贴壁改良法进行较好的纯化和扩增,Brdu标记可用于hMSCs的生长和分化的动态示踪观察。有望建立hMSCs库,为组织工程、细胞移植研究打好基础。     

哺乳动物初级精母细胞体外培养的研究

目的:探讨哺乳动物初级精母细胞体外培养分化的可能性.方法:制备雄性大鼠睾丸初级精母细胞,与非洲绿猴肾上皮细胞(Vero细胞)共培养,观察初级精母细胞体外培养过程中的生长行为,用5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)标记跟踪观察大鼠初级精母细胞在体外培养中的分化情况.结果:大鼠初级精母细胞与Vero细胞共培养后能进行减数分裂阶段分化,生成精子细胞;BrdU标记检测结果显示,培养前在体内标记BrdU的细胞为初级精母细胞,培养后在有BrdU标记的细胞中有早期精子细胞.结论:哺乳动物初级精母细胞在体外培养中能进行分化.     

腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染人骨髓间充质干细胞成骨特性研究

目的 通过腺病毒介导CTLA-4Ig基因转染人骨髓间充质干细胞(human marrow mesenchymal stem cells, hMSCs),观察被修饰细胞CTLA-4Ig蛋白表达情况,以及基因修饰对hMSCs诱导成骨特性的影响.方法 采用荧光显微镜观察腺病毒介导CTLA-4Ig基因转染hMSCs的绿色荧光蛋白表达,流式细胞术检测确定转染率,观察对比转染前后细胞形态和细胞周期,用免疫细胞化学方法检测转染hMSCs的CTLA-4Ig蛋白表达,转染hMSCs成骨诱导培养3周后进行成骨特异性标记检测.结果 分离培养的hMSCs CD105表达阳性, CD34表达阴性.重组腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染hMSCs的转染率为81.14%, CTLA-4Ig基因转染hMSCs(CTLA-4Ig-hMSCs)的形态无明显变化,生长良好.免疫细胞化学结果显示,CTLA-4Ig-hMSCs的CTLA-4Ig蛋白表达阳性,诱导培养3周的CTLA-4Ig-hMSCs,碱性磷酸酶染色呈强阳性,免疫细胞化学检测骨钙素表达阳性,钙的四环素荧光标记法显示细胞间有钙的沉积.结论 腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染hMSCs能够分泌CTLA-4Ig蛋白,并保持了成骨分化潜能,可用于异基因hMSCs作为骨组织工程种子细胞的应用研究.     

BrdU标记在大鼠生精细胞体外培养中的应用

目的探讨应用5-溴-2-脱氧尿苷（5-bromo-2-deoxy-uridine，Brdu）标记检测大鼠生精细胞体外的分化、发育情况。方法采用BtdU体内标记生精细胞的DNA，免疫细胞化学法跟踪观察大鼠生精细胞在体外培养中的分化、发育情况。结果培养前在体内标记BrdU的细胞为初级精母细胞。经培养后在BrdU标记的细胞中出现早期精子细胞。结论大鼠生精细胞体外培养过程中，应用BrdU标记能检测生精细胞的分化、发育情况。     

人骨髓间充质干细胞向汗腺细胞诱导培养中基因表达方式的研究

目的通过诱导人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向汗腺细胞（hSGCs）分化并检测经诱导后细胞的基因表达变化,探讨hMSCs的可塑性分化机制。方法分离纯化并体外扩增hMSCs,设立对照组（DM组）和向hSGCs诱导的SG组、EGF10组和EGF20组等四组不同培养基体系,观测细胞形态学变化和采用流式细胞仪、RT-PCR等方法检测融合细胞的基因和蛋白表达特征。结果细胞在不同条件培养液中诱导培养均能存活;诱导培养2d后细胞数量开始扩增,细胞形态也由间充质干细胞的长梭状开始向hSGCs的扁平状转变,在SG组尤其明显;诱导培养1周后细胞数量扩增明显;与汗腺发生形成密切的基因EGF和EGFR出现高丰度表达,并且表达了仅hSGCs才有表达的CK7蛋白。结论 hMSCs在不同介质诱导培养下可在形态学和分子水平上呈现向hSGCs横向分化的潜能,hMSCs的可塑性现象丰富了皮肤创面修复和汗腺再生理论。     

人骨髓间充质干细胞与成骨细胞共培养诱导破骨细胞方法的建立和鉴定

目的：建立人骨髓间充质干细胞（hMSCs）与人成骨细胞共培养体系,为人破骨细胞体外培养提供更完善的方法。方法：采用酶消化法分离流产胎儿头盖骨,获取人成骨细胞,对在体外培养的成骨细胞进行碱性磷酸酶染色（ALP染色）;利用Percoll 梯度分离法和贴壁筛选法培养hMSCs,应用流式细胞术检测hMSCs 免疫学表型,对其进行鉴定;将获得的成骨细胞和hMSCs在体外共培养作为实验组,单独培养的成骨细胞作为对照组;对诱导后的细胞应用抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）进行鉴定。结果：体外分离、培养的hMSCs具有独特的细胞免疫学表型, 即CD73和CD105阳性, CD34和CD45 阴性。hMSCs与成骨细胞共同培养5 d后,即可见单个核细胞融合成多核细胞,TRAP 染色可见多数细胞胞浆呈酒红色,为诱导成功的破骨细胞。结论：hMSCs与人成骨细胞共同培养能诱导为具有典型的破骨细胞表型的多核细胞。     

树突状细胞的体外培养及鉴定

目的:建立树突状细胞(dendritic cells,DCs)体外培养的方法.方法:从正常人外周血分离获得单核细胞,加入rhGM-CSF1000U/ml、rhIL-4500U/ml体外培养.取培养7天的细胞,采用免疫细胞化学方法和流式细胞仪测定细胞表型,并对其进行鉴定.结果:免疫细胞化学方法显示,90%以上培养7天的细胞表达DCs特异性标志CD1a,而单核细胞特异性标志CD14表达小于5%;FACS分析显示,培养7天的细胞高表达HLA-A、B、C,HLA-DR和协同刺激分子CD40、B7-1.表明加入细胞因子体外培养后,由单核细胞生成了DCs.结论:通过该方法对人外周血单核细胞进行体外扩增,能够得到成熟的DC.     

人脐血间充质干细胞体外分离、培养与鉴定

目的 建立体外分离和培养人脐血间充质干细胞的方法,并探讨脐血间充质干细胞是否具有与骨髓间充质干细胞相一致的免疫表型.方法 无菌条件下采集正常产胎儿脐血,用相对密度为1.077的淋巴细胞分离液分离脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCB-MSCs),采用贴壁培养法获得MSCs,体外培养并对其增殖进行观察.用流式细胞仪检测细胞周期状态和白细胞表面抗原.结果 来源于脐血的MSCs在含有15%胎牛血清和低糖DMEM培养基中可以贴壁,并表现为间充质样细胞;传3代后,此类细胞可以纯化、扩增;其细胞倍增时间为60h左右.流式细胞分析细胞周期显示大部分细胞(85%)处于G0/G1期;此类细胞稳定地表达相关的抗原标记CD29、CD44、CD54、CD105,但不表达造血细胞系的表面标记CD34、CD45.结论 脐血中可培养出非造血干细胞,其白细胞表面抗原表达与骨髓间充质干细胞有较强的一致性.     

人骨髓间充质干细胞体外分化为肝样细胞的实验研究

目的 探索肝细胞生长因子（HGF）联合成纤维细胞生长因子-4（FGF-4）诱导人骨髓间充质干细胞（HMSCs）向肝细胞方向分化的能力,为生物人工肝及肝细胞移植等找到新的种子细胞来源。方法 分别用HGF、FGF-4、HGF＋FGF-4诱导HMSCs分化为肝样细胞：以未加诱导因素的HMSCs、L-02人肝细胞株为阴、阳性对照组。相差显微镜观察细胞形态的变化：在不同诱导分化阶段免疫细胞化学染色检测AFP和CK18,并用图像分析法计算HMSCs的分化比率;免疫荧光细胞化学染色法检测AFP、ALB的表达;RT-PCR检测AFP和ALB mRNA表达的情况。结果 HMSCs经诱导向肝样细胞转化,变成纺锤形、不规则圆形或多角形细胞。免疫细胞化学染色各诱导组均可检测出AFP和CK18表达,图像分析表明HGF＋FGF-4联合诱导分化的AFP、CK18阳性率最高,HGF次之,FGF-4则较弱;免疫荧光细胞化学染色发现各诱导组AFP、ALB均为阳性表达,而阴性对照组则为阴性表达;各诱导组RT-PCR均可检测出AFP和ALB mRNA的表达,而阴性对照组则没有表达。结论 HGF、FGF-4、HGF＋FGF-4均能诱导HMSCs分化为肝样细胞,分化的肝样细胞能分泌肝细胞特异性产物AFP、ALB、CK18等。以HGF＋FGF-4诱导HMSCs分化为肝样细胞的阳性率最高,HGF次之,FGF-4则较弱。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为心肌细胞实验方法的建立

目的:探讨体外培养并诱导人骨髓间充质干细胞(hMSCs) 分化为心肌细胞（CMs）的实验方法。方法:采用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离、纯化hMSCs,采用5-氮杂胞苷( 5-Aza)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对hMSCs进行联合诱导,诱导3～4周,观察细胞形态学的变化,免疫组织化学方法鉴定肌细胞及心肌细胞特异蛋白的表达。结果:hMSCs体外经5-Aza 和bFGF联合诱导1～2周后,细胞体积较诱导前增大,呈长梭形。诱导2～3周后细胞伸出伪足呈多爪形;诱导3～4周后细胞伪足间相互连接形成肌管样结构。联合诱导3～4周后免疫组织化学鉴定结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白(cTnⅠ)和横纹肌肌动蛋白（α-sarcomeric actin）表达均呈阳性。结论:hMSCs在体外经5-Aza和bFGF联合诱导可以分化为CMs。     

人骨髓间充质干细胞在大鼠体内转化为肝样细胞的实验研究

目的 探讨诱导人骨髓间充质细胞在大鼠肝损伤模型中转分化为肝样细胞的可能性。方法 建立肝叶切除和亚致死量照射两种肝脏损伤模型,植入人间充质干细胞,检测大鼠谷丙转氨酶、总胆红素和凝血酶原时间的变化;聚合酶链反应检测大鼠肝脏内人特异性DNA序列Alu-sx。结果 造模后行干细胞移植组大鼠肝功能均有明显改善。聚合酶链反应显示各干细胞移植组大鼠肝脏中均能同时检测人特异性DNA序列Alu sx和大鼠特异性DNA序列Sox11。结论 人骨髓间充质干细胞能在肝损伤大鼠肝脏内存活,表达人特异性抗原,并能在肝损伤大鼠肝脏内分化为具有肝功能的肝样细胞,有助于肝损伤大鼠肝功能恢复。     

人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化的实验研究

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向血管内皮细胞（ECs）诱导分化的可行性。方法：用贴壁法从成人骨髓中分离出间充质干细胞,培养扩增后,加入10ng／ml的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和人血管内皮生长因子（hVEGF）向ECs诱导分化,分别于0、24d流式细胞术检测细胞表型及荧光染色鉴定细胞。结果：hMSCs向ECs诱导分化24d,细胞CD34、KDR转为阳性,CD54、CD106、vWF表达增加。可摄取ac—LDL,并可结合UEA。结论：hMSCs经bFGF和VEGF作用,分化为具有ECs的表型和部分功能的细胞。     

Targeted induction of differentiation of human bone mesenchymal stem cells into neuron-like cells

A systematic method of isolating and culturing human bone mesenchymal stem cells （hMSCs）, and inducing them to differentiate into neuron-like cells in vitro was established. The hMSCs were isolated from bone marrow with the lymphocyte-separating medium, cultured and expanded in vitro, and induced after addition of compound neuro-revulsants. The morphological changes of hMSCs were observed, and the expression of surface markers in induced hMSCs was immunocytochemically identified during induction period. The hMSCs could be separated, cultured and expanded in vitro. After induction by compound neuro-revulsants for 48 h, the changes of neuron-like cells, such as cellular shrinkage and neurite growth, were observed in some cells. The immunochemical staining revealed nestin （＋） or NF （＋）, and GFAP （-）. It was concluded that hMSCs were successfully cultured and induced to differentiate into neuron-like cells.     

ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构成皮肤类似物的分化

【目的】以ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞构建皮肤类似物，探讨其在皮下的分化潜能。【方法】Hoechst33342标记E14-ES细胞，经羊膜诱导4d后，形成表皮干细胞克隆，并以其作为种子细胞，取129胎鼠成纤维细胞与复合凝胶-明胶海绵复合，形成皮肤类似物，埋植于129小鼠皮下组织。术后2周、4周、6周、8周取材，做HE染色观察，B1整合素、CK15、CK19、CEA、CK18免疫组化荧光双标和免疫组化观察。【结果】术后2周和4周，植块内可见单层立方或柱状上皮构成的管状和泡状结构，6周和8周后，可见角化复层上皮、毛囊样、汗腺样、皮脂腺样等结构，免疫双标结果显示，植入2周和4周，带有蓝色核标记的细胞形成的管状或泡状结构呈B1整合素、CK15、CK19、CEA和CK18阳性，6周和8周后，HE染色中汗腺样结构呈CEA、CK18阳性。[结论]ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构建的皮肤类似物。在同种小鼠皮下有分为角化复层上皮、汗腺样、毛囊样、皮脂腺样等结构的潜能。     

均一的成人骨髓源性神经干细胞的简捷获取

目的 探讨建立具均一性的、未分化且具有神经分化能力的成人骨髓源性神经干细胞（human adult bone marrow-derived neural stem cells,Md-NSCs）的有效获取方案。方法 抽取成人志愿者全骨髓,梯度离心分离成人骨髓基质细胞（human adult bone marrow stromal cells, hMSCs）,贴壁培养法纯化及扩增hMSCs;以神经干细胞培养基体外诱导培养hMSCs成为Md-NSCs,以诱导培养基于体外诱导培养Md-NSCs向神经系细胞分化;相差显微镜下观察 hMSCs及Md-NSCs的形态学特征;免疫组化法检测Md-NSCs中Nestin的表达,以及由 Md-NSCs诱导分化后得到的神经系细胞中GFAP、NG2及MAP2ab的表达。结果 传代纯化后的hMSCs呈梭形,贴壁生长,增殖旺盛。经10~15d诱导培养,hMSCs可分化为Md-NSCs,其形态为均一性的、呈球形的细胞克隆,不贴壁生长,增殖旺盛,并聚集成神经球结构,Md-NSCs克隆高度表达神经干细胞标志蛋白Nestin。经7~10天诱导培养,Md-NSCs于体外可分化成神经系细胞,分化细胞可表达星形胶质细胞标志蛋白GFAP、少突胶质细胞标志蛋白NG2及神经元细胞标志蛋白MAP2ab。 结论 通过本方案可简捷有效地获得均一的成人骨髓源性神经干细胞,可为体内移植治疗人类神经系统疾病提供丰富而理想的神经干细胞来源。     

克隆化的人骨髓间充质干细胞系的建立及其生物学特性的研究

目的:分离人骨髓间充质干细胞(hMSCs),建立克隆化扩增的细胞系并初步鉴定其分化特性和细胞的分子标记.方法:利用间充质干细胞贴壁生长的特性,显微镜下挑取原代单个成纤维样生长单位中的细胞,逐步扩大培养,最终得到克隆化扩增的hMSCs.选择有利于其生长的血清,低密度培养,传70%～80%生长汇合时传代保种.RT-PCR检测其Oct-4、SDF1、CD49a、CK19、c-met基因的表达;流式细胞术检测细胞表面抗原CD34、CD45、CD14、CD44、CD29、CD90、HLA-1和HLADR;体外向骨、软骨、脂肪细胞方向诱导分化鉴定其分化潜能.结果:建立了人骨髓间充质干细胞系并在体外实现了克隆化扩增,该细胞系在体外连续培养达60个细胞倍增时间仍保持多向分化的潜能.细胞不表达CD34、CD45、CD14、HLA-DR,但表达Oct-4、SDF-1、CD49a、CK19、c-met、CD44、CD29、CD90、HLA-1.体外能诱导出骨、软骨、脂肪细胞.结论:得到了一个可稳定传代的克隆化扩增的人骨髓间充质干细胞系,该细胞系在体外可以分化为骨、软骨、脂肪细胞,并表达Oct-4、CK19和c-met.     

人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的超微结构

目的：培养人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,体外向心肌细胞(CMs)定向诱导分化,进行超微结构观察,为hMSCs体外向CMs诱导分化提供理论依据。方法：体外分离培养扩增hMSCs并进行流式细胞仪分析鉴定;选用生长良好,纯度高的P5代hMSCs,用5-氮杂胞苷（5-Aza,10 μmol•L^-1）体外定向向CMs诱导分化,对其进行Desmin检测,在倒置显微镜及透射电镜下观察细胞形态学和超微结构。结果：流式细胞仪检测显示体外分离纯化培养扩增出细胞不表达CD34,高表达CD44,表明扩增细胞为hMSCs。hMSCs经5-Aza诱导分化后其形态发生改变,逐渐由长梭形变为多角形及星形,并表达Desmin。透射电镜下可见细胞大小不一致,细胞表面有许多微绒毛;细胞器丰富,胞质内可见丰富的线粒体、粗面内质网;部分细胞内可见大量糖原颗粒沉积,小部分细胞内可见髓样小体;胞浆内可见肌丝样结构,细胞间存在细胞连接。结论：体外分离培养扩增的hMSCs经5-Aza诱导,可分化成具有CMs超微结构特性的心肌样细胞。