mOX40-Ig的表达及其生物学活性的初步研究

目的:构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,转染CHO细胞进行稳定表达,获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白.方法:RT-PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,构建pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒并经测序证实.从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段,将其插入pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒中构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体.脂质体法转染CHO细胞获得稳定表达,用RT-PCR与ELISA法检测其表达,蛋白A亲和纯化后,SDS-PAGE进行鉴定.3H-TdR掺入法研究OX40信号对B细胞的体外促增殖作用.结果:测序证实hIgG1Fc段、mOX40胞外段及mOX40-Ig基因序列正确,RT-PCR与ELISA证实mOX40-Ig的表达,SDS-PAGE证实其为mOX40-Ig融合蛋白,3H-TdR掺入法显示mOX40-Ig在体外能有效地促进B细胞增殖.结论:成功地构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,并获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白的稳定表达,为进一步开展OX40相关领域的横向应用研究奠定了基础.     

hTSHR胞膜外区片段真核表达载体的构建和表达

目的:构建人类促甲状腺激素受体(hTSHR)胞膜外区氨基端的两个片段hTSHRf(aa29 ～100)、 hTSHRe(aa101～278)的真核表达载体pcDNA3.1-hTSHRf和pcDNA3.1-hTSHRe, 并在CHO细胞中进行表达.方法:RT-PCR法从人甲状腺正常组织的cDNA中扩增hTSHRf和hTSHRe,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(D)/V5-His-TOPO中, 经酶切、 PCR和测序鉴定后通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行表达, RT-PCR扩增转染细胞的cDNA、 Western blot分别鉴定hTSHR在CHO细胞中mRNA和蛋白水平的表达.结果:RT-PCR分别扩增两个片段的阳性克隆株, 所得片段大小与预期一致, 经Western blot鉴定, 相对分子质量(Mr)分别为11900、 23600左右, 与预期的大小相符.结论:真核表达载体pcDNA3.1-hTSHRf和pcDNA3.1-hTSHRe构建成功, RT-PCR和Western blot检测证实重组质粒能在CHO细胞中高效表达, 为进一步研究pcDNA3.1-hTSHRf和pcDNA3.1-hTSHRe在体内的基因表达, 建立Graves'病的动物模型奠定了基础.     

mOX40-Fc的真核表达及其对混合淋巴细胞反应的影响

构建重组pcDNA3.1-mOX40-Fc真核表达载体,在CHO细胞中表达,并初步研究融合蛋白mOX40-Fc对MLR中细胞增殖的影响。克隆编码hIgG1Fc基因片段,与编码小鼠OX40胞外段的基因融合,构建mOX40-Fc融合基因及其分泌型真核表达载体pcDNA3.1-mOX40-Fc;转染CHO细胞构建融合蛋白的稳定真核表达细胞株,用RT-PCR及夹心ELISA检测其表达,纯化后经SDS-PAGE及Western blot法对其进行鉴定,混合淋巴细胞反应(MLR)测定其生物学活性。结果:核苷酸序列测定显示构建的mOX40胞外段和hIgG1Fc段基因序列与GenBank序列一致、阅读框完整;RT-PCR、ELISA和Western blot检测表明转染细胞有分泌型重组蛋白的表达;功能实验提示mOX40-Fc能抑制MLR中的细胞增殖。成功构建mOX40-Fc真核表达载体并获得高效表达,该重组蛋白可在体外通过抑制OX40/OX40L共刺激通路抑制淋巴细胞增殖。     

小鼠4-1BB-Fc分子的真核表达及其体外抑制T细胞增殖的效应

目的 克隆并构建含小鼠4-1BB胞外段和人IgG Fc融合基因的真核表达质粒，表达具有生物学活性的4-1BB-Fc融合蛋白，初步探讨其体外生物学效应。方法 借助RT-PCR技术，从小鼠脾脏总FLNA中扩增4-1BB全长编码基因，并导入克隆载体pGEM-T Easy。经测序证实，用PCR扩增其膜外区cDNA，酶切后与hIgG1 Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3．1中。应用脂质体将重组子pcDNA3．1-4-1BB-Fc转染COS-7及CHO细胞，经G418筛选，获得稳定表达4-1BB-Fc融合蛋白的CHO细胞株。双抗体夹心ELISA检测融合蛋白表达，经蛋白A亲和层析纯化，借助免疫印迹进行鉴定。应用FACS检测融合蛋白与DC细胞系DC2．4表面4-1BBL结合情况。采用MTT及CFSE（羧基荧光素乙酰乙酸）标记法检测4-1BB-Fc融合蛋白对同种异基因小鼠T细胞增殖的抑制作用。结果 经测序证实，所克隆和构建的小鼠4-1BB-Fc cDNA阅读框及连接部位序列正确；ELISA与免疫印迹证实4-1BB-Fc蛋白的表达及其对T细胞增殖具有明显抑制作用。结论 成功构建4-1BB-Fc融合基因并获稳定表达，可望用于探讨4-1BB参与移植排斥的作用及其机制。并为研究4-1BB-Fc的其他生物学作用奠定初步基础。     

人端粒酶反转录酶936-1132氨基真核表达载体的构建及在293T细胞中表达

摘要 背景：人端粒酶反转录酶是端粒酶的重要组成之一,可使端粒酶表现活性从而拮抗端粒缩短或细胞衰老。 目的：构建人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基真核表达载体,并在人胚肾细胞293T表达,为其在细胞内定位研究奠定基础。 方法：以人端粒酶反转录酶cDNA为模板,PCR扩增出带有酶切位点其 C端 936-1132氨基序列片段,并与真核表达载体pcDNA3.1-HisA连接,构建出重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132,将重组质粒转染入人胚肾细胞293T中,使蛋白表达,并对蛋白进行免疫印迹鉴定。 结果与结论：经双酶切和基因测序等方法证实,人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132构建成功,经免疫印迹鉴定可检出融合蛋白。 关键词：人端粒酶反转录酶C端;重组质粒;人胚肾细胞293T;蛋白表达;免疫印迹 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.11.018     

hBAFF-R-Fc融合分子的构建、表达与鉴定

目的 构建人hBAFF-R-Fc基因的真核表达质粒,并表达有生物学活性的人hBAFF-R-Fc融合蛋白.方法 化学合成法合成人hBAFF-R膜外区cDNA编码基因,酶切测序证实后,与hIgG4.Fc/Leu235Glu突变体一起导入线性化pSec/WG真核表达载体,阳性重组体酶切测序证实后,采用脂质体法稳定转染CHO细胞,用夹心ELISA检测其表达;收集的蛋白经蛋白A亲和纯化,以SDS-PAGE与Western blot进行鉴定并检测hBAFF-R-Fc的活性.结果 测序证实构建的hBAFF-R膜外区与hBAFF-R-Fc cDNA阅读框完整,EIJSA证实转染hBAFF-R-Fc基因的CHO细胞培养上清中含有hBAFF-R-Fc蛋白,SDS-PAGE与 Westernblot鉴定证实其为hBAFF-R-Fc蛋白.hBAFF-R-Fc蛋白对活化后的B细胞有抑制增殖的作用.结论 成功构建了人hBAFF-R-Fc真核表达载体,并使有生物学活性的hBAFF-R-Fc蛋白在CHO细胞上获得了稳定表达.为进一步研究该蛋白在狼疮性肾炎等自身免疫性疾病治疗中的作用奠定了基础.     

CD80/IgG融合基因真核表达载体的构建及在CHO细胞中的表达

目的：构建CD80/IgG真核表达载体，使其在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中呈分泌型表达，为白血病免疫基因治疗的研究奠定基础。 方法： 采用多聚酶链反应（PCR）技术分别从小鼠脾细胞和含小鼠CD80全长互补DNA（cDNA） 的质粒pcDNA/B7中扩增出免疫球蛋白IgG1的Fc段和CD80胞外区，以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.0中，获得重组表达载体pcDNA/CD80-IgG；采用脂质体转染技术转染CHO细胞,G418筛选得到稳定表达细胞株；免疫印迹、斑点ELISA及流式细胞术鉴定融合蛋白的表达,并初步检测其活性。 结果： DNA测序证明两段基因正确克隆至pcDNA3.0的多克隆位点，CHO细胞的培养上清中可检测到融合蛋白的表达，其分子量大小和预期的基本一致，该融合蛋白可提高白血病细胞表面CD80的表达。 结论： 成功构建pcDNA／CD80-IgG真核表达载体，并在CHO细胞中分泌性表达有活性的CD80-IgG融合蛋白。     

人OX40-Fc分子的构建、真核表达及活性研究

目的构建人OX40-Fc基因的真核表达质粒，并表达有生物学活性的纯化人OX40-Fc融合蛋白。方法从活化的人T细胞cDNA文库中以PCR方法扩增OX40膜外区cDNA编码基因，并导入真核表达载体pcDNA3中。测序证实后，进行酶切并与人IgG1Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中，采用脂质体法稳定转染COS-7细胞，用夹心ELISA检测其表达情况，经蛋白A亲和纯化，用SDS-PAGE与Western blotting进行鉴定。检测其对活化后Jurkat细胞增殖的抑制活性。结果测序证实构建的OX40膜外区与OX40-Fc cDNA阅读框完整，连接部位序列正确；ELISA证实OX40-Fc蛋白的表达；SDS-PAGE与Western blotting证实其为OX40-Fc蛋白。增殖实验证明其对活化后的Jurkat细胞有抑制增殖作用。结论成功构建了人OX40-Fc真核表达载体，并使有生物学活性的OX40-Fc融合蛋白在COS-7细胞上获得了稳定表达。为进一步研究该蛋白在自身免疫性疾病治疗中的作用及调节免疫自稳机制中的地位奠定了基础。     

融合蛋白mTSLPR-Ig的表达、纯化及其鉴定

目的:构建含小鼠TSLPR胞外段与小鼠Ig Fc段融合基因的腺病毒表达载体(Ad-mTSLPR-Ig),体外表达、纯化并鉴定可溶性融合蛋白mTSLPR-Ig。方法:运用PCR方法从小鼠胸腺cDNA文库中扩增mTSLPR胞外段基因,构建并鉴定mTSLPR胞外段与小鼠Ig Fc段融合基因的腺病毒表达载体(Ad-mTSLPR-Ig);将Ad-TSLPR-mIg转染COS-7细胞,收集细胞上清液;采用双抗体ELISA夹心法检测上清中融合蛋白表达;经蛋白A亲和层析,制备纯化可溶性融合蛋白mTSL-PR-Ig。结果:经测序证实,所构建表达载体的目的基因片段mTSLPR-Ig序列正确,成功包装出腺病毒表达载体Ad-mTSL-PR-Ig;ELISA法检测到上清中融合蛋白mTSLPR-Ig的表达;通过亲和层析法获得纯化的融合蛋白,经Western blot鉴定融合蛋白表达无误。结论:成功获得可溶性融合蛋白mTSLPR-Ig,为进一步研究其生物学特性奠定基础。     

小鼠趋化因子CCL19Ig融合蛋白表达载体的构建、表达及鉴定

通过特异引物扩增出去掉终止密码的mCCL19编码序列,经酶切、亚克隆、拼接构建了真核表达载体pcDNA3.1-mCCL19Ig,酶切和测序鉴定插入序列;将重组质粒转染CHO细胞进行体外表达,通过RT-PCR、Western blot鉴定目的基因的表达,利用趋化小室法测趋化活性。结果测序证实重组表达载体含mCCL19编码序列和人IgG1 Fc段序列,其序列分别与GenBank中公布序列比对一致,IgG1 Fc段读码框未发生改变;Western blot结果证实转染了pcDNA3.1-mCCL19Ig的CHO细胞培养上清中有相对分子质量为38 000的融合蛋白mCCL19Ig表达;体外趋化实验表明融合蛋白mCCL19Ig对小鼠脾细胞有趋化活性,且呈剂量依耐关系。     

CD80-IgG1 Fc段融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人CD80-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并住CHO细胞中进行表达。方法：应用T—A克降技术和亚克降技术，构建人CD80膜外段-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并将其转染人CHO细胞株并筛选，进行稳定表达：通过Western blot及ELISA法，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并建立CHO细胞稳定表达株。Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地构建了人CD80膜外段-IgGI Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgGI Fc／pcDNA3．1（＋），并在CHO细胞中稳定表达，为下一步抗肿瘤的研究奠定了基础。     

CTLA4-FasL双功能融合蛋白分子抑制混合淋巴细胞反应及促进淋巴细胞凋亡

目的 构建人CTLA4-FasL融合蛋白真核表达载体，表达CTLA4-FasL融合蛋白，通过体外实验初步研究其生物学特性。方法 通过特异引物分别扩增出CLTA4和FasL胞外区的cDNA，将它们拼接后，克隆入真核表达载体pcDNA3．1( )中，体外表达纯化。Western blot分析CTLA4-FasL融合蛋白的抗原性。体外细胞结合试验研究其结合特异性配体作用。混合淋巴细胞反应研究其抑制免疫应答的效应。结果 测序证实所扩增的PCR产物分别是CLTA4和FasL胞外区的cDNA，其序列与文献报道相符。成功构建了pcDNA3．1-CTLA4-FasL真核表达载体。Western blot分析结果显示，表达获得的蛋白具有CTLA4和FasL的抗原性。体外细胞结合试验显示，CTLA4-FasL融合蛋白可以分别与Jurkat细胞表面的Fas受体和Raji细胞表面的町分子结合。混合淋巴细胞反应结果显示，该融合蛋白可以有效抑制异基因淋巴细胞的刺激作用及诱导淋巴细胞凋亡，并显示了显著的协同效应。结论 成功构建了CTLA4-FasL融合蛋白真核表达载体，体外表达并纯化了CTLA4-FasL融合蛋白，体外实验证实CTLA4-FasL融合蛋白是一个可以有效抑制免疫应答的双功能分子。     

Cloning and expression of human TNFR (P55)-IgG Fc fusion protein in eukaryotic cells]

OBJECTIVE: To express soluble biologically active TNF receptor protein in eukaryotic cells, which can inhibit cytotoxic activity of TNF. METHODS: PCR amplified the extra-cellular region of TNF receptor P55 and IgG Fc gene. Then the two were linked through an oligomer encoding a thrombin-sensitive peptide linker and cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (+). The eukaryotic expression plasmid pcDNA3. 1/TI was then transfected to the mammalian cell line COS7 and BHK. Using the G418 system, BHK cell clones were selected and can continuously secrete biological protein in large amount. RESULTS: The expressed protein was fused with IgG Fc and secreted into the cell culture supernatant. It has good antigenicity and binding ability to TNF. It can also inhibit the cytotoxic activity of TNF on L929 cell. CONCLUSION: The TNFR-IgG Fc fusion protein expressed in eukaryotic cells has biological activities of human TNF receptor P55.     

TNF受体（P55）和IgG Fc的融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达

目的 在真核细胞表达具有生物活属性的可溶性肿瘤坏死因子（TNF）受体蛋白,用于中和TNF的毒性。方法 将TNFR（P55）的胞外区基因和人IgG Fc段基因通过18个碱基的凝血酶切点连接,克隆入真核表达载体pcDNA3.1( ),在COS7和BHK细胞分别得到目的蛋白的表达。结果 在真核表达系统表达了TNFR（P55）胸外区与人IgG Fc段的融合蛋白,免疫学实验及L929细胞体外实验均表明该蛋白具有TNR（P55）特异的抗原性、与TNF结合的活性以及抑制TNF的活性。结论 真表达的融合蛋白产物具有可溶性TNF受体（P55）的生物学活性。     

人CD28-Fc融合蛋白在真核细胞中的表达与纯化

目的建立稳定表达CD28-Ig融合蛋白系统,提供用于研究的CD28-Ig融合蛋白。方法构建高表达的真核细胞表达载体,利用FAD批准的、可用于生产人用重组蛋白药物的CHO细胞进行表达,MTX加压筛选出稳定表达的细胞株。蛋白A纯化获得电泳纯融合蛋白。结果经RT-PCR,SDS-PAGE及Western印迹鉴定,CHO细胞上清中纯化的蛋白是CD28与Ⅰg的融合蛋白,并获得纯度较高的融合蛋白。结论成功建立CD28-Ig融合蛋白表达体系,并获得稳定表达融合蛋白的细胞株,为T细胞活化第二信号系统的基础研究奠定了基础。     

核小体Th表位和CTLA4Ig双基因共表达真核表达载体的构建

目的将核小体Th表位与CTLA4Ig融合基因融合，研究CTLA4Ig作为真核表达载体的可行性。方法用touchdown PCR法扩增CTLA4Ig基因，同时引入核小体Th表位（H2B14-28）。将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建pcDNA3．1（＋）-CTLA4Ig—H2B。将表达质粒转染COS-7细胞，Western blot检测转染细胞裂解上清中融合蛋白的表达。将构建表达CTLA4Ig—H2B的减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207喂饲BALB／c小鼠，取脾脏进行免疫组化鉴定重组蛋白在动物体内的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。在pcDNA3．1（＋）-CTLA4Ig—H2B质粒转染后48h细胞裂解上清中，检测到CTLA4Ig融合蛋白的表达，该蛋白能与抗人CTLA-4单抗特异结合。重组蛋白在BALB／c小鼠脾脏免疫细胞胞浆中有阳性表达。结论成功构建了能稳定表达核小体Th表位和CTLA4Ig融合基因的真核表达载体。