荧光定量聚合酶链反应检测沙眼衣原体

沙眼是一种由沙眼衣原体引起的常见病,多发病。目前由于抗生素的应用,临床表现多不典型,易漏诊误诊。荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)融汇了PCR高灵敏性,DNA杂交技术高特异件和光谱技术高精确定量三大技术,能简便、微量、快速、高特异、高敏感、定量、无污染地检测沙眼衣原体。我们用FQ-PCR对20例结膜炎患者进行了检测,结果报道如下。     

大鼠视神经损伤后视网膜CNTF及CNTFRα mRNA的表达

目的研究视神经损伤后睫状神经营养因子及其受体在大鼠视网膜中的表达变化。方法采用钳夹法制作大鼠视神经损伤模型。分别于伤后1、3、7、14、28d取眼球,以正常大鼠视网膜为对照,提取视网膜组织RNA,运用RT-PCR检测视神经损伤后CNTF和CNTFRαmRNA的表达变化。结果在正常视网膜中存在CNTF和CNTFRαmRNA的表达,视神经损伤后CNTF和CNTFRαmRNA表达量逐渐增加,第7d达到最高,第14d下降,具有统计学意义(P<0.01)。28dCNTF表达仍高于正常组(P<0.01)。结论视神经损伤刺激了视网膜细胞表达CNTF和CNTFRα增加,可能是视网膜神经元自我保护的一种反应。     

实时荧光聚合酶链反应定量检测LASIK术后兔角膜纤维连接蛋白1的表达

目的　定量检测纤维连接蛋白 1(fibronectin 1,FN1)在LASIK术后不同时段角膜中的表达水平 ,探讨FN1与LASIK术后早期伤口愈合的关系。方法　 2 0只新西兰白兔 ,左眼按近视 4D行LASIK术 ,右眼作对照组。分别于术后 4、4 8h ,1、2周取角膜 ,荧光半定量PCR方法检测中央手术区及周边非手术区角膜FN1mRNA的表达。结果　LASIK术后 4h左眼手术区FN1的mRNA表达水平比右眼相应对照区明显升高 ,4 8h降低至对照组水平 ,其后随时间的延长无明显改变。结论　实时荧光定量PCR定量检测FN1在角膜中的表达结果提示 ,FN1参与LASIK术后角膜瓣与基质床的粘附过程     

SYBR Green I荧光定量PCR检测大鼠外伤性视神经损伤后P53、bax和caspase 3基因表达

目的 应用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR法检测外伤性视神经损伤后P53、bax和caspase 3基因mRNA表达的变化.方法 应用液压颅脑损伤仪建立大鼠外伤性视神经损伤动物模型,伤后1、3、5、7、9、14、28d处死,以Trizol法提取新鲜视网膜组织的总RNA,以Oligo (dt) 18 为引物逆转录合成cDNA 并进行扩增,以T/A克隆法将纯化的目的 片断与T/A克隆载体(pTZ57R/T)连接成重组质粒并转化入E.coli DH5α.采用碱裂解法提取重组质粒,经蓝白斑筛选、酶切、测序鉴定后,根据标准品建立标准曲线,由软件自动计算出待测样本中靶基因mRNA的含量,并以靶基因和内参GAPDH mRNA含量的比值作为评价靶基因表达水平的指标.结果 由pTZ57R/T与目的 基因所构建的标准曲线的线性关系良好、灵敏度高、特异性强、准确可靠.P53和bax均在视神经损伤后3d mRNA表达明显增加,5d时达到高峰,7d后开始下降;伤后5d caspase 3 mRNA表达明显增加,9d时达到高峰,14d后开始下降.三者表达水平与对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 促凋亡基因P53、bax和caspase 3在视神经损伤后视网膜神经节细胞(RGCs)的凋亡发生中起到重要作用.     

荧光定量反转录-聚合酶链反应检测鼻咽癌患者外周血肿瘤细胞微转移的研究

目的 探讨荧光定量反转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测外周血CK14 mRNA、表皮生长因子受体(EGFR)mRNA的表达在鼻咽癌患者外周血肿瘤细胞微转移诊断中的价值.方法 采用FQ-RT-PCR方法检测87例入组鼻咽癌患者外周血CK14 mRNA、EGFR mRNA的表达,并分析其与肿瘤TNM分期、临床分期、组织分化程度的关系.结果 87例鼻咽癌患者外周血中,CK14 mRNA、EGFR mRNA阳性表达率分别为64.4%( 56/87)、58.6% (51/87),两者联合检测的阳性表达率为71.3% (62/87);CK14 mRNA、EGFR mRNA的表达水平与T分期、N分期、临床分期、组织分化程度有关(P＜0.05),分期越晚,外周血中CK14 mRNA、EGFR mRNA 的表达水平越高,低分化鳞癌患者外周血中CK14 mRNA、EGFR mRNA的表达水平高于高中分化鳞癌患者.结论 FQ-RT-PCR方法检测鼻咽癌患者外周血CK14 mRNA、EGFR mRNA的表达,能够较准确反映外周血肿瘤细胞微转移的情况,在诊断鼻咽癌患者外周血肿瘤细胞微转移方面有一定的可行性;鼻咽癌患者外周血肿瘤细胞微转移与肿瘤的恶性程度和病情进展有关.(中国眼耳鼻喉科杂志,2011,11:219-223)     

实时荧光定量PCR检测大鼠视网膜中TGF-β受体Ⅰ和受体Ⅱ的基因表达

本研究通过实时荧光定量PCR（RTQ-PCR）技术定量分析转化生长因子β受体Ⅰ，（TβR-Ⅰ）和受体Ⅱ（TβR-Ⅱ）基因在正常成年大鼠视网膜中的表达，探讨TGF-β及其受体在维持正常视网膜稳态和视网膜增生性病变中的作用机制。     

荧光定量聚合酶链反应和超高倍显微诊断系统镜检检测沙眼衣原体

目的 :发现新的检测沙眼衣原体的方法。方法 :利用荧光定量聚合酶链反应和超高倍显微诊断系统镜检检测 15例结膜炎患者的沙眼衣原体。结果 :两者皆阳性 5例 ;荧光定量聚合酶链反应阳性 ,超高倍显微诊断系统镜检阴性 1例 ;荧光定量聚合酶链反应阴性 ,超高倍显微诊断系统镜检阳性 2例 ,两者皆阴性 7例。卡方检验两个检测方法的阳性率无显著性差异。结论 :实验证明两个方法均能很好的检测沙眼衣原体。超高倍显微诊断系统镜检较快速直观 ,荧光定量聚合酶链反应能定量 ,并能评估疗效指导治疗。     

实时荧光聚合酶链反应定量检测大鼠视网膜中 转化生长因子β1和β2的表达

转化生长因子β(TGF-β)是一种具有控制增生和分化等生物过程的自分泌或旁分泌生长因子。TGF-β及其受体、细胞内下游信号转导分子的突变在糖尿病视网膜病变的发生、发展中扮演了非常重要的角色。研究TGF-β的不同成员在视网膜中的表达，有助于深入了解它们的来源和作用机制。我们以实时荧光定量聚合酶链反应(QRT-PCR)检测TGF-β1和TGF-β2在大鼠视网膜中的表达，为研究TGF-β在视网膜病变中的作用机制提供依据。     

大鼠视神经损伤后视网膜小胶质细胞表达的初步观察

目的 研究大鼠视神经损伤后视网膜中小胶质细胞的表达情况.方法 实验研究.选取30只成年雌性健康SD大鼠,按照随机数字表法分为实验组和对照组各15只,分别用于细胞计数、免疫组织化学及免疫印迹实验.实验组在眼球后约1.5 ～2.0 mm处行右眼视神经鞘内切断术,术后5d于视神经断端处用荧光金逆行标记视网膜节细胞,手术后7d处死取材.对照组小鼠右眼行视神经切断术并标记,2d后处死取材.视网膜做铺片用于计数.用免疫组织化学法于视网膜切片上行小胶质细胞的表面标记物Iba-1染色,观察小胶质细胞的形态及数量,同时应用免疫印迹法检测视网膜内Iba-1蛋白含量的变化.两组间比较采用非配对student t-检验进行统计学分析.结果 对照组视网膜中有少量小胶质(Iba-1阳性)细胞表达,并呈非活化状态.视神经切断7d后小胶质细胞明显增多且呈半活化状态,免疫印迹结果显示损伤后Iba-1蛋白表达量明显增加到对照组的2.3倍(t=7.669,P=0.001).视视神经切断7d后节细胞数量为(1182±64)个/mm2,明显减少至对照组的51％(t=23.850,P＜0.01).结论 大鼠视神经损伤后小胶质细胞表达增多且呈部分激活状态,可能是视网膜受损后自我保护的表现之一.     

反义寡核苷酸抑制大鼠损伤视神经 Nogo-A mRNA的表达

目的:观察反义寡核苷酸对损伤视神经Nogo-A的影响.方法:实验分为对照组、随机序列组、和2,5,10μmol/L 3种Nogo-A反义寡核苷酸浓度组.大鼠视神经钳夹伤后,采用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR),半定量分析反义寡核苷酸对损伤视神经Nogo-A mRNA表达量的变化.结果:反义寡核苜酸均显著降低Nogo-A mRNA的表达(P＜0.01),随机序列对Nogo-AmRNA的表达无影响(P＞0.05).结论:反义寡核苷酸对视神经损伤后Nogo-A mRNA表达有抑制作用.     

地塞米松对兔视神经钳夹伤后视网膜神经节细胞存活及Nogo-A表达的影响

目的观察地塞米松对家兔视神经钳夹伤后视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)存活的影响及损伤视神经、视网膜Nogo-A表达的变化。方法采用兔球后视神经钳夹伤模型,健康成年家兔分为正常对照组、损伤组、治疗组。分别于损伤后3d、7d、14d处死动物,观察单位面积RGC存活数量及损伤后Nogo-A在视神经、视网膜的表达变化。结果视神经损伤后,治疗组RGC的存活数高于损伤组及对照组(P<0.01)。对照组、损伤组损伤后3d、7d、14d视神经、视网膜Nogo-A表达增强,至损伤后7d达高峰;治疗组视神经、视网膜表达亦增强,各时间点均弱于损伤组、对照组,差异有显著统计学意义(P<0·01)。结论视神经损伤后,地塞米松能够增加RGC的存活数量,能够下调No-go-A的表达,这可能是地塞米松治疗作用机制之一。     

晶状体损伤对视神经损伤后再生影响的研究

目的观察单纯视神经损伤及视神经损伤联合晶状体损伤后视神经中Nogo-A mRNA及Nogo-A的表达,探讨晶状体损伤促进视神经损伤后再生的机制。方法 66只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组(A组,6只)、单纯视神经损伤组(B组,30只)和视神经损伤联合晶状体损伤组(C组,30只)。分别于造模后7d、14d、21d处死大鼠2只(A组)、10只(B组)、10只(C组),光镜下观察视神经的病理变化,免疫组织化学染色检测Nogo-A表达情况,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、半定量分析不同组视神经Nogo-A mRNA的表达。结果大鼠正常视神经中表达Nogo-A mRNA及Nogo-A,但表达量较低;损伤视神经后7d Nogo-A mRNA的表达量显著升高,至伤后21d B组及C组均维持较高的水平。B组损伤后7d Nogo-A表达阳性的细胞数开始增多(136.80±3.94),与A组比较差异有统计学意义(P<0.05),并保持高表达;C组损伤后21d Nogo-A的表达较B组低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论视神经损伤后髓鞘相关抑制因子Nogo-A表达增高,晶状体损伤促进视神经再生的机制可能与Nogo-A有关。     

Nogo-66受体mRNA在成年大鼠视神经中的 表达及意义

目的观察Nogo-66受体（NgR）mRNA在成年大鼠视神经的表达并探讨其意义。方法取8只成年大鼠视神经及坐骨神经，将拟杂交的组织切片分为3组：视神经实验组、坐骨神经对照组、视神经阴性对照组。采用原位杂交技术观察NgR mRNA在视神经和坐骨神经中的表达。结果大鼠视神经切片中NgR mRNA均表达阳性，阳性信号沿视神经长轴排列；所有大鼠坐骨神经切片中NgR mRNA的表达均为阴性。结论在成年大鼠视神经中NgR mRNA广泛表达，而坐骨神经中不表达，提示NgR 阳性表达及分布与视神经再生能力低下密切相关。(中华眼底病杂志,2005,21:246-248)     

大鼠视神经夹伤后CNTF CNTFR及OMgpmRNA表达的研究

目的 观察大鼠视神经夹伤后对闪光视觉诱发电位(F-VEP)的影响及睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)、睫状神经营养因子受体(ciliary neurotrophic factor recepter,CNTFR)、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(oligodendrocyte myelin glycoprotein,OMgp)在视网膜中的表达变化.方法 采用夹持视神经方法建立大鼠视神经不完全损伤模型,在夹伤后1、3、7、14和28d剥离视网膜,提取总RNA用半定量逆转录聚合酶反应(rt-PCR)方法测定视网膜中CNTF,CNTFR,OMgp mRNA的表达,同时观测术后1、7、14和28dF-VEP波形改变.结果 大鼠视神经损伤后视网膜中CNTF,CNTFR,OMgp mRNA有所增加,正常大鼠视网膜中CNTF,CNTFR,OMgp少量表达.视神经损伤后F-VEP潜伏期延长,波幅降低,波形低而宽,14d后有所恢复.结论 大鼠视神经损伤后,CNTF,CNTFR,OMgp表达均增加,而CNTFR的增加可为外源性CNTF治疗视神经损伤提供依据.F-VEP的振幅,潜时伤后变化与时间相关,伤后14d变化最明显,以后有恢复迹象.     

神经营养因子影响视神经夹伤后视网膜GAP-43mRNA表达变化

目的：观察大鼠视神经夹伤后视网膜上GAP-43基因的变化,观察玻璃体腔内注射睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor,CNTF）和腺病毒介导脑源性神经营养因子（adenovirally delivered brain-derived neurotrophic factor,Ad-BDNF）对视网膜上GAP-43mRNA的影响.方法：成年SD大鼠球后2mm处作视神经夹伤模型,经巩膜玻璃体腔内注射微量神经营养因子（neurotraphic factors,NFs）,应用原位杂交法观察视网膜的GAP-43mRNA的变化.结果：正常SD大鼠视网膜上仅在节细胞层检测到少数细胞存在GAP-43mRNA杂交信号,对照组和CNTF治疗组视神经夹伤后1wk内可观察到视网膜神经节层中存在较强的GAP-43mRNA杂交信号,伤后2wk时已减弱至伤前,Ad-BDNF治疗组在视神经夹伤后4wk内在视网膜上均能观察到GAP-43mRNA的杂交信号,其中在夹伤后1～2wk时杂交信号相对较强.结论：视神经夹伤能上调视网膜上GAP-43mRNA表达,玻璃体腔内注射Ad-BDNF在伤后4wk内均能上调视网膜上GAP-43mRNA表达.     

单链构象多态性分析检测Leber遗传性视神经病变

目的筛查Leber遗传性视神经病变（Leber hereditary optic neuropathy，LHON）患者的线粒体DNA碱基突变，研究LHON的临床发病特点及分子生物学改变。方法对3个疑似LHON家系进行调查，知情同意后，抽取了30个母系成员的血样，对照组32个血样均来自无视力障碍的正常人。采用聚合酶链反应扩增结合单链构象多态性分析对3个家系的30个母系成员的线粒体DNA（mtDNA）进行了11个位点的突变筛查。结果3个家系的母系成员共41人（男23人，女19人），发病20例，发病率48．78％，男女比例3：1，平均发病年龄28．73岁。3个家系患者发病年龄随传代数的增加而减小．呈现遗传早发现象。含11778、11696两个位点的片段1，实验组30例检测结果全部为异常，对照组32例单链构象多态性检测结果全部正常。含14459、14482、14484、14498位点的片段2实验组30例中仅有1例检测结果为异常，对照组32例SSCP检测结果全部正常。含3394、3460两个位点的片段3和含4136、4160、4216三个位点的片段4，实验组和对照组的所有样本均未发现异常。结论LHON患者发病年龄随传代数的增加而提前，具有遗传早发现象；综合国内的文献资料和我们的研究结果，我国LHON患者以携带11778点突变占绝大多数；所检测3个家系母系成员有共同的突变位点，但只有部分发病，其中已发病者可确诊为LHON患者，未发病的母系成员为该病的携带者。     

复方樟柳碱注射液治疗视神经挫伤的疗效

目的：探讨复方樟柳碱注射液治疗视神经挫伤的临床疗效。 方法：回顾分析2009-01/2011-05于沧州市人民医院住院治疗的视神经挫伤患者72例72眼。其中36例36眼应用复方樟柳碱注射液行颞浅动脉旁皮下注射为治疗组,36例36眼应用传统药物治疗为对照组。 结果：治疗28d后,治疗组的视力、眼底及视野恢复情况均明显优于对照组。 结论：复方樟柳碱注射液治疗视神经挫伤是一种有效易行的手段。     

OPA1 expression in the human retina and optic nerve

Mutations in the optic atrophy type 1 (OPA1) gene give rise to human autosomal dominant optic atrophy. The purpose of this study is to investigate OPA1 protein expression in the human retina and optic nerve. A rabbit polyclonal antiserum was generated using a fusion protein covering amino acids 647 to 808 of the human OPA1 protein as the immunogenic antigen. Western blot and immunofluorescence staining were performed to examine OPA1 expression in the human retina and optic nerve. In human retina, we found that OPA1 expression was clearly present in retinal ganglion cells and photoreceptors. OPA1 immunoreactivity was also present in the nerve fiber layer, inner plexiform layer and outer plexiform layer. However, OPA1 protein was not detected in the choline acetyltransferase-positive, calretinin-positive, and calbindin-positive amacrine cells, nor in the calbindin-positive horizontal cells. In the human optic nerve, expression of OPA1 was present in the axonal tract that was labeled with neurofilament specific antibody. In conclusion, expression of OPA1 gene is present in the mitochondria-rich regions of the retina and optic nerve. This suggests that OPA1 protein might be involved in the functioning of the mitochondria that are present in both inner and outer retinal neurons.