TaqMan MGB Real-time RT-PCR 检测西尼罗病毒方法的建立

目的建立一种灵敏、特异、高效的西尼罗病毒（West Nilevirus，WNV）感染诊断和流行病学调查的实验室检测方法。方法用C6／36细胞培养WNV并用Vero细胞蚀斑法滴定病毒浓度；根据wNVC蛋白基因组保守序列，设计一套特异性引物和TaqManMGB探针，用细胞培养病毒液进行方法的条件优化；用不同病毒评价方法的特异性，用系列浓度病毒稀释液和染毒蚊子评价方法的灵敏性。结果建立的TaqManMGBReal-timeRT-PCR方法可检出低于0．01PFU的WNVRNA，并可检出只含3只染毒蚊的标本；用该方法检测4种血清型登革病毒标准毒株、日本脑炎病毒、麻疹病毒、基孔肯亚病毒均为阴性。结论新建TaqManMGBReal-timeRT—PCR方法具有极高的特异性和灵敏性，是实验室早期诊断WNV感染和调查媒介携带WNV情况的理想方法。     

应用含内参的多重实时荧光RT-PCR方法快速检测登革病毒和基孔肯雅病毒

目的 建立一种登革病毒、基孔肯雅病毒并含人类基因内参检测的多重实时荧光RT-PCR方法,能在同一反应管内同时检测目前发现的所有来源的登革病毒或基孔肯雅病毒。方法 针对登革病毒3′端非编码区和基孔肯雅病毒结构蛋白E2-6K-E1区以及人体各类组织细胞中均能稳定表达的RNAse P基因,设计了3套特异性引物和探针,建立了1套能同时检测登革病毒、基孔肯雅病毒及含有人类基因检测内参的多重实时荧光RT-PCR方法,对其灵敏性和特异性进行了验证,并对临床发热病人标本进行了应用评估。结果 该方法对检测体外转录合成的登革病毒和基孔肯雅病毒RNA的灵敏性可达最低每个反应10～100拷贝,对检测登革1型病毒和基孔肯雅病毒的灵敏性分别可达最低每个反应0.1 TCID₅₀/mL和1 TCID₅₀/mL。用20株登革病毒、4株基孔肯雅病毒和日本脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、盖塔病毒、辛德毕斯病毒各1株进行检测,方法的特异性均为100%。方法应用于189份发热病人血清标本检测,可准确地鉴定出其中登革病毒或基孔肯雅病毒核酸阳性的标本,且所有血清标本均能被内参引物和探针有效地扩增和杂交。结论 本研究建立了一种高灵敏性、高特异性且含人类基因内参检测的登革病毒和基孔肯雅病毒多重实时荧光RT-PCR检测方法,可作为登革热或基孔肯雅热病人早期快速鉴别诊断的有效工具,也可用于蚊媒携带登革病毒或基孔肯雅病毒的高通量快速筛查。     

浙江省猪血清中乙脑病毒的分离鉴定及抗体的测定

目的对浙江嘉兴地区采集的猪血清进行乙型脑炎病毒分离鉴定以及了解该地区猪感染乙型脑炎病毒的状况。方法在浙江省嘉兴地区采集猪血清标本,利用病毒分离方法检测猪血清是否携带乙脑病毒,利用间接免疫荧光法对猪血清进行抗体检测。应用荧光定量RT PCR方法对新分离病毒进行鉴定;设计特异性引物,利用RT PCR方法扩增新分离乙脑病毒PrM-E基因,并对新分离病毒进行基因分型和E基因的分析。结果共采集240份猪血清标本,抗体检测阳性率为61.6%。其中6月中旬50%以上的猪乙脑病毒抗体呈阳性。分离出3株病毒。经荧光定量RT PCR鉴定3株病毒均为乙脑病毒,基因分析表明3株病毒均属于基因I型乙脑病毒。对这2株乙脑病毒的E基因区段进行分析,它们之间核苷酸和氨基酸的同源性均为100%。与疫苗株SA14 14 2相比,核苷酸同源性在87.7%,氨基酸同源在97.0%以上。结论浙江省嘉兴地区猪群中存着乙脑病毒的隐性感染或曾经感染过,提示在该地区自然界中存在着乙脑病毒。     

Real-time RT-PCR检测西尼罗病毒一步法的建立

目的建立针对西尼罗病毒E基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于西尼罗病毒感染样本的快速准确检测和定量。方法针对西尼罗病毒的保守基因E设计引物和探针,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性。结果本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出西尼罗病毒,不与日本脑炎病毒及其他病毒产生交叉反应。该方法的最低检出浓度为3.6×102copies/μl,标准曲线的线性范围为3.6×102～3.6×107copies/μl。结论本研究建立的一步法real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于西尼罗病毒感染样本的检测。     

猪源性乙型脑炎病毒分离株全基因序列测定和分析

[摘要] 目的 了解猪源性乙型脑炎病毒（乙脑病毒）的基因特征。方法 对猪源性乙脑病毒株（JX61）进行全基因组序列测定和基因进化特性的分析。结果 猪源性乙脑病毒JX61株全基因组全长均为10964个核苷酸,含有一个开放阅读框架,编码3432个氨基酸。与GenBank中选择的41株乙脑病毒全基因序列比较发现,其核苷酸同源为83.6-99.3%,氨基酸总体同源性为94.9%-99.6%。通过全基因序列进行系统进化分析均显示该毒株属于基因I型乙脑病毒。结论 猪源性乙脑病毒JX61株属于基因I型,与国内分离株XJP613关系最为接近。提示猪体内的乙脑病毒基因型别有了新的变化,这也是浙江省在猪机体第一次分离基因I型乙脑病毒。     

基于逆转录-酶促重组等温扩增原理的西尼罗病毒基因检测方法的建立

目的 建立一种可用于检测西尼罗病毒特异性基因片段的逆转录-酶促重组等温扩增(RT-ERA)方法。方法 以西尼罗病毒NS5基因的高度保守序列作为靶序列，根据ERA反应原理设计、合成引物及荧光探针，建立荧光RT-ERA反应体系。分别以不同拷贝数(10~4、10~3、10~2、10、1拷贝/μl)的含120 bp靶基因片段的重组质粒及不同浓度(10、1、10^-1、10^-2、10^-3 ng/μl)西尼罗病毒RNA为模板进行荧光RT-ERA法扩增，评价该方法的敏感度；分别以森林脑炎病毒、基孔肯雅病毒、Ⅰ型登革病毒、西尼罗病毒、乙型脑炎病毒、黄热病毒和甲型流感病毒H2N1的RNA为模板进行荧光RT-ERA法检测，评价该方法的特异性。结果 建立的荧光RT-ERA法可在39℃、20 min内特异性扩增西尼罗病毒RNA。敏感度检测结果显示，以重组质粒为模板，荧光RT-ERA法最低可检出的质粒拷贝数为1拷贝/μl；以RNA为模板，荧光RT-ERA法最低可检测浓度为10^-3 ng/μl。特异性检测结果显示，以森林脑炎病毒...     

中国云浮口岸蚊媒病毒的首次调查

目的 掌握云浮国境口岸蚊类携带重要蚊媒病毒的现状,探讨提高口岸蚊媒病毒检测有效性的方法,为预防和控制口岸蚊媒传染病的发生提供科学依据。方法 于2011年5月~11月在云浮口岸捕捉活蚊,对蚊标本研磨液提取核酸后应用多重实时荧光RT-PCR技术快速筛查蚊类携带的登革热病毒、日本脑炎(乙脑)病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗热病毒和黄热病毒。对实时荧光RT-PCR检测核酸阳性的标本进行PCR扩增和序列分析。结果 在云浮共采集39 254只蚊虫,鉴定后分为460组。经实时荧光RT-PCR检测,14组蚊虫乙脑病毒核酸阳性,其余病毒(登革热病毒、乙脑病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗热病毒和黄热病毒)均为阴性。PCR扩增和序列分析显示云浮乙脑病毒属于基因Ⅰ型。所捕获的三带喙库蚊的最小感染率为0.937‰比中华按蚊的0.385‰稍高。结论 本研究首次在云浮口岸进行大规模系统的蚊媒病毒调查,云浮口岸的蚊虫很可能没有携带登革热病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗热病毒和黄热病毒,但有少数蚊虫携带乙脑病毒。此次调查检出的基因Ⅰ型乙脑病毒是广东省内的首次报道,为今后蚊媒病毒的媒介监测检测工作提供了有效方法。虽然蚊虫最小感染率的差别没有统计学意义,但是蚊媒病毒病的暴发和流行风险仍然存在。     

福建省2005-2008年临床乙脑病毒分离株的序列分析

目的分析2005-2008年福建乙脑病毒毒株的部分基因组序列,探索乙脑病毒临床分离株的变异和进化。方法临床标本(血清或脑脊液)接种BHK-21细胞,分离乙脑病毒,从培养液上清提取病毒RNA,RT-PCR扩增病毒基因组片段,并进行克隆、测序以及序列分析。结果共分离到5株乙脑病毒。对病毒C/prM区240bp和全长E基因的序列分析表明,近几年的这些临床分离株基因型仍然全部属于G3型。种系发生分析结果显示,新分离株与2002、2003年分离株存在较大同源性。虽然病毒E基因存在少量氨基酸改变,但总体上这些变异不足以影响病毒的致病性。结论近几年福建省的临床乙脑病毒分离株为G3型,新分离株亲缘关系比较接近2002、2003年毒株。     

逆转录-聚合酶链反应在乙型脑炎诊断中的建立

目的　运用逆转录 -半套式 -聚合酶链反应技术 (RT -semi-nested -PCR) ,建立一种新的早期快速检测乙型脑炎病毒的方法。方法　收集临床诊断的 37例乙脑和 15例非乙脑病人标本 (包括血清、脑脊液 )分别为 6 3份和 30份 ,同时用RT -semi-nested -PCR、IgM捕获法ELISA(MacELISA)进行检测。 结果　血清和脑脊液中可成功检测出JEVRNA ,经1 5 %凝胶电泳 ,出现特异性条带 ,符合预计值 4 0 0bp。结论　RT -semi-nested -PCR对检测JEV感染 ,从实验设计到实验条件 ,都是合理的 ,有较高的敏感性和特异性。可用于乙脑的早期诊断。     

滴金免疫法快速检测流行性乙型脑炎血清特异性IgM

目的建立滴金免疫法检测流行性乙型脑炎患者血清特异性IgM的方法。方法将乙脑病毒的特异性抗原点于硝酸纤维素薄膜上，用来捕获血清和脑普液标本中的特异性IgM抗体，通过胶体金标记的抗人μ链单克隆抗体结合物来直接显色，阳性者出现红色斑点。结果用本方法与2一流基乙醇耐性试验对比检测血清标本50份和脑脊液标本45份，两法的总符合率分别为98.0％和95.6％。结论本方法简便、快速，适于向基层推广，对乙脑的早期诊断有重要的临床意义。     

口蹄疫病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立

摘要：为了快速高效的检测所有血清型口蹄疫病毒（FMDV）,根据FMDV聚合酶3D基因序列比对结果,设计特异性引物和MGB探针,通过反应条件的优化,建立了一步法荧光定量RT-PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果表明,该方法能特异性检测A型、O型、Asia I型FMDV,而对猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病毒、猪细小病毒、猪狂犬病毒、猪乙型脑炎等病原检测结果均为阴性;检测质粒的敏感性可达83.4copies/μL,检测病毒RNA的敏感性可达7.1fg/μL,比多重RT-PCR敏感性高10倍;对4份样品进行5次批内和批间重复检测,检测结果变异系数均小于2%。该方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于口蹄疫临床样品诊断、流行病学调查和畜产品安全监测。     

Dengue virus infects human endothelial cells and induces IL-6 and IL-8 production

In this study dengue virus (DV) was found to infect primary endothelial cells derived from human umbilical cord veins (HUVEC) and alter their cytokine production. Dengue virus infection of HUVEC was confirmed by an increase in plaque-forming units in the culture supernatant and by immunofluorescence assay. HUVEC produced large amounts of interleukin (IL)-6 and IL-8 but not IL-1beta after DV infection. Both the replication of DV and the production of IL-6 and IL-8 by HUVEC after DV infection were inhibited by ribavirin, an antiviral synthetic guanosine analogue. Additionally, increased serum levels of IL-6 and IL-8 were observed in patients with dengue hemorrhagic fever but not dengue fever. Therefore, our results suggest that endothelial cells can be a target for DV infection, and that DV-induced IL-6 and IL-8 production by endothelial cells may contribute to the pathogenesis of dengue hemorrhagic fever.     

病人血清中登革病毒的分离与鉴定

目的应用细胞分离法从登革热病人急性期血清中分离登革热病毒并应用免疫荧光法证实病毒的血清型。C6/36细胞长成单层后接种急性期血清,以5~7天为一代,观察细胞病变;感染后的细胞使用型特异性抗体进行免疫荧光实验证实其血清型。在10份急性期病人血清中,有6份标本成功分离出登革热I型病毒,其结果和RT-PCR等实验方法的结果一致,分离率为60%。     

Dengue virus infection during post-epidemic period in Delhi, India

Dengue fever (DF) and dengue hemorrhagic fever (DHF) are major public health problems in India. During the period following an epidemic, a study was carried out using virological and serological tests for confirmation of suspected cases of dengue virus infection in fever cases presenting to the All India Institute of Medical Sciences. Serum samples of suspected DF/DHF cases were processed from January to December 1997. In 37 samples from patients with fever of less than 5-day duration, received on ice, virus isolation was attempted in C6/36 clone of Aedes albopictus cell line, followed by indirect fluorescent antibody staining with monoclonal antibodies to dengue viruses 1 to 4. One hundred and forty-three serum samples from patients with more than 5 days fever were tested for dengue specific IgM antibody by either MAC-ELISA or a rapid immunochromatographic assay. Dengue virus type 1 was demonstrated by culture in 8 (21.6%) of 37 serum samples and IgM antibody could be detected in 42 (29.4%) of the 143 serum samples by the serological methods. The peak of dengue virus infection was seen from September to November 1997.     

Detection of hepatitis B virus DNA by real-time PCR using TaqMan-MGB probe technology

AIM: To develop a real-time PCR for detecting hepatitis B virus (HBV) DNA based on TaqMan technology using a new MGB probe. METHODS: Plasmid containing the sequence of X gene (1414-1744 nt) was constructed as HBV-DNA standard for quantitative analysis. A TaqMan-MGB probe between primers for amplification was designed to detect PCR products. The interested sequence contained in the plasmid and in clinical specimens was quantitatively measured. RESULTS: The detection limit of the assay for HBV DNA was 1 genome equivalent per reaction. A linear standard curve was obtained between 100 and 109 DNA copies/reaction (r>0.990). None of the negative control samples showed false-positive reactions in duplicate. HBV DNA was detected in 100% (50/50) of HBV patients with HbeAg, and in 72. 0% (36/50) with HBsAg, HBeAb and HBcAb. The coefficient of variation for both intra- and inter-experimental variability demonstrated high reproducibility and accuracy. CONCLUSION: Real-time PCR based on TaqMan-MGB probe technology is an excellent method for detection of HBV DNA.     

Immunological evidence of Zika virus transmission in Thailand

Objective: To identify immunological evidence of Zika virus transmission in Thailand. Methods: To undertake a preliminary serosurvey of possible exposure to Zika virus, 21 serum samples from cohort of acute undifferentiated fever patients were examined for immunoreactivity to Zika, Dengue, Japanese encephalitis and Chikungunya envelope antigens by Western blot analysis. Results: Twenty of the 21 serum samples showed immunoreactivity to at least one of the antigens, with seven samples showing immunoreactivity to all antigens. Of particular note, two serum samples showed immunoreactivity only to Zika envelope antigen, with no immunoreactivity to other envelope antigens. Conclusions: This study presents the first evidence of Zika virus transmission in Thailand, although as yet the relationship between transmission and possible cases of Zika fever in Thailand requires further investigation.     

Respuesta autoinmune en niños con dengue. Reporte de casos

Dengue is an infectious disease caused by the dengue virus (DV), which can progress to dengue hemorrhagic fever and dengue shock syndrome. DV causes the production of auto-antibodies against human cells. A variety of factors have been associated with macrophage activation syndrome, including infections, drugs and autoimmune pathologies (systemic lupus erythematosus, systemic onset juvenile idiopathic arthritis). We present three cases of patients that clinically developed an autoimmune response related to a DV infection. Our country currently has endemic cases of dengue, with hyperimmune responses. Therefore, the physician should consider this possibility in the presence of unusual conditions.