HBx基因缺失型突变体对肝细胞QSG7701细胞增殖和凋亡的影响

目的研究HBx-d382和HBx-d431缺失型突变体对永生化QSG7701肝细胞生物学行为的影响。方法采用HE染色法,观察转染细胞形态学变化,通过MTT、软琼脂克隆形成实验、流式细胞仪及裸鼠成瘤实验研究稳定转染细胞的生物学特性。结果与转染空质粒pcDNA3相比,转染肝癌组织中HBx-d382和HBx-d431突变体及HepG2.2.15细胞株中HBx-2215基因的QSG7701细胞大小形态不一致、体积增大、核浆比例增大,生长速度更快,克隆形成率高（P〈0.05）。与转染空质粒pcDNA3S期百分比（29.4%）和凋亡率（13.1%）比较,pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-2215组细胞S期百分比比例增高,分别为32.8%和35.0%,pcDNA3/HBx-d431组凋亡率下降（4.5%）。结论 HBx-d382和HBx-d431缺失型突变体能促进QSG7701细胞增殖和恶性转化。     

miR-133a-3p 通过抑制氧化还原因子1 抑制肝癌细胞恶性生物学行为

目的:通过多种实验途径探讨miR-133a-3p通过调节氧化还原因子1(Ref-1)对肝癌细胞恶性生物学行为的影响。方法:收集2017年2月～2018年12月来本院就诊的肝癌手术患者的癌组织和癌旁相邻正常组织标本,用qRT-PCR检测miR-133a-3p在癌组织和癌旁相邻正常组织中以及在肝癌细胞系HepG2、Huh-7、SK-Hep1、SMMC-7721和肝正常细胞Hep-3B中的表达;构建miR-133a-3p-mimics(miR-mimics组、miR-NC转染质粒组和正常对照组(Control),qRT-PCR检测转染前后miR-133a-3p在HepG2中的表达;CCK-8和克隆形成实验检测HepG2细胞转染前后增殖能力变化;细胞划痕和Transwell实验分别检测转染前后HepG2细胞的迁移和侵袭能力变化;RNA转录组测序检测HepG2细胞转染前后转录组RNA表达差异并作通路富集分析;qRT-PCR检测筛选RNA-seq中RNA表达差异较大的基因;qRT-PCR和Western blot检测Ref-1在HepG2细胞转染前后中的表达。免疫组化和qRT-PCR分别检测Ref-1在肝癌组织和肝癌细胞系中表达;最后HepG2细胞同时转染了miR-mimics和Ref-1 miR-inhibitors,进行联合干预,随后CCK-8、细胞划痕和Transwell分别检测了联合干预后细胞增殖、迁移和侵袭能力变化。结果:miR-133a-3p在肝癌患者癌组织中的表达显著低于癌旁组织,同时其在肝癌细胞HepG2中的表达最低;qRT-PCR结果表明miR-mimics可有效促进miR-133a-3p在HepG2中的表达;CCK-8和克隆形成实验结果显示miR-133a-3p过表达后可以显著抑制HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为;RNA-seq结果显示HepG2转染前后Ref-1的表达差异最大;qRT-PCR和Western blot结果显示HepG2转染成功后,Ref-1表达随miR-133a-3p的过表达而降低。免疫组化和qRT-PCR结果显示Ref-1在肝癌组织和肝癌细胞系中的表达均显著高于阴性对照组;联合干预后HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学抑制作用更加强烈。结论:miR-133a-3p可能通过抑制Ref-1表达从而抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为。     

野生型p53基因在人肝癌细胞的表达及诱导其凋亡

目的:探讨外源性野生型p53基因(wt-p53)对人源性肝癌细胞系生物学的影响。方法:用脂质体转染法将真核表达质粒p53-pcDNA3转染人源性肝癌细胞系HepG2中,用G418筛选细胞;用生物素标记p53的cDNA探针,通过RNA原位杂交方法,检测p53-pcDNA3在细胞中的表达;用流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡指数。结果:G418筛选出了阳性转染细胞;RNA原位杂交显示HepG2的胞质成棕黄色,证明了p53的表达;FCM检测表明,转染p53-pcDNA3的HepG2细胞,其增殖能力下降,细胞凋亡指数由转染前的10.03%上升为54.17%。结论:外源性wt-p53可通过脂质体转染法在HepG2细胞中成功表达,并诱导其发生凋亡,有较好的临床应用前景。     

人着色性干皮病基因D对HepG2细胞Mdm2和Mdm4表达的影响

 目的：探讨人剪切修复基因着色性干皮病基因D（xeroderma pigmentosum D, XPD）对肝癌细胞鼠双微体2（murine double minute 2，Mdm2）和鼠双微体4（murine double minute 4，Mdm4）表达的影响。方法：用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2转染进入人肝癌细胞株HepG2，实验分为3组：（1）空白对照组；（2）pEGFP-N2组；（3）pEGFP-N2/XPD组。用MTT法观察细胞的增殖活力；用流式细胞术检测细胞周期和凋亡率；用RT-PCR和Western blotting检测XPD、Mdm2、Mdm4和P53表达量的变化。结果：MTT结果显示，重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染抑制了肝癌细胞的增殖活力；流式细胞术结果显示，重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染引起了G 1期细胞增加，S期减少，凋亡率增加。RT-PCR和Western blotting检测发现，重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染使得XPD表达增高，同时使得Mdm2和Mdm4表达降低，P53表达增高。结论：XPD能下调肝癌细胞中Mdm2和Mdm4的表达，上调P53表达，并能抑制肝癌细胞增殖及诱导其凋亡。     

乙型肝炎病毒X蛋白对肝癌细胞生长的影响

目的探讨乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis Bvirus Xprotein，HBx）对肝癌细胞恶性程度的影响。方法构建携带HBV。基因真核表达载体pcDNA用Bx，以脂质体介导转染HepG2肝癌细胞，建立可稳定表达HBx的肝癌细胞系HepG2-HBx细胞，同时设空载体pcDNA，转染细胞HepG2-pcDNA，及未转染HepG2细胞为对照组。PCR法扩增Neo基因检测插入的质粒DNA片段．免疫荧光检测HBx的表达。通过生长曲线测定、平板克隆形成实验、MTr比色实验、Hoechst33342核形态学染色观察及流式细胞仪测定．了解稳定转染细胞的生物学行为变化。结果与对照组相比，转染pcDNA√IBx的HepG2-HBx细胞生长速度加快．其倍增时间缩短（28h对32．5h或34h，P〈0．05），克隆形成率增加[（10．12±0．23）％对（5．33±O．19）％或（5．19±0．28）％，P〈0．05]，细胞周期分析显示由GdG，期-S期的进程明显加快。细胞凋亡检测显示HepG2-HB。细胞可抵抗放线菌素D（ActD）诱导的凋亡作用。结论HBx可提高肝癌细胞的增殖活性，并增强肝癌细胞的抗凋亡能力．增加了肝癌细胞的恶性表型。     

Gαs在肝癌中的表达情况及其高表达对肝癌细胞HepG2的影响

目的:探讨Gαs过表达对人类肝癌细胞HepG2生长、增殖的影响,及Gαs在人类肝癌中的表达情况,寻求有效的治疗靶点.方法:利用QpCR技术检测人类肝癌组织中Gαs基因水平的表达情况;利用Western blot检测人肝癌细胞HepG2及正常肝细胞HL-7702中Gαs蛋白水平的表达;利用脂质体法将Gαs质粒转染HepG2细胞;用MTT检测HepG2细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞周期变化.结果:QPCR 结果显示在基因肝癌组织中Gαs表达高于癌旁组织;Western blot结果显示肝癌细胞中Gαs在蛋白水平表达高于肝正常细胞;Gαs质粒转染HepG2细胞后,Gαs表达增高,细胞增殖加快.结论:Gαs基因表达水平在肝癌组织中高于周围癌旁组织;Gαs的高表达可能与肝癌的发生发展相关联,其高表达促进HepG2细胞的生长与增殖.     

miR-212-5p在肝癌组织中的表达及对HepG2细胞增殖、侵袭及迁移的影响

目的 探讨miR-212-5p在肝癌组织中的表达及对HepG2细胞增殖、侵袭及迁移的影响。方法应用qRT-PCR法检测96例肝癌组织及癌旁组织中miR-212-5p表达水平,同时设HepG2细胞组、miR-212-5pmimics组与miR-212-5pinhibitor组。培养72h后,采用MTT法检测细胞活力;流式细胞仪检测细胞凋亡水平;Transwell实验和划痕实验检测细胞侵袭与迁移水平;qRT-PCR法检测细胞miR-212-5p表达水平。结果 肝癌组织中miR-212-5p表达水平升高,肿瘤最大径≥2cm、TNM分期越高、浸润深度越深、病理级别越低、有淋巴结转移、有复发的肝癌患者miR-212-5p高表达率更高（P<0.05）。miR-212-5p模拟物能增强HepG2细胞增殖、侵袭及迁移能力,抑制HepG2细胞凋亡（P<0.05）;miR-212-5p抑制剂能抑制HepG2细胞活力、增殖、侵袭及迁移能力,促进HepG2细胞凋亡（P<0.05）。结论 miR-212-5p在肝癌组织中高表达,miR-212-5p可促进HepG2细胞增殖、侵袭及迁移能力,抑制...     

核转录因子HMBOX1对肝癌细胞生物学特征的影响

目的:比较肝癌细胞系与肝细胞系中HMBOX1的表达水平,探讨其在肝癌发生、发展中的作用。方法:RT-PCR检测HMBOX1在多种肝癌细胞系和正常肝细胞系中的表达。利用分子生物学方法构建pEGFP:HMBOX1融合表达载体,采用脂质体方法转染HepG2肝癌细胞系,MTT方法及流式细胞技术评价转染后细胞增殖和细胞周期的变化。基因芯片技术分析表达载体转染HepG2后肿瘤相关信号通路的变化。结果:PCR结果显示肝癌细胞系HMBOX1 mRNA表达水平明显低于正常肝细胞系;pEGFP:HMBOX1融合表达载体转染HepG2后,细胞的增殖能力和周期未出现显著变化;基因芯片的结果提示转染表达载体的HepG2细胞,肿瘤和免疫信号通路相关基因的表达发生显著变化。结论:HMBOX1在多种肝癌细胞系表达下调,可能参与了多条与肿瘤和免疫相关信号通路的调节,为进一步阐明肝癌的发生机制提供了新的实验依据。     

Wnt2在肝细胞肝癌中的表达及对HepG2细胞增殖的影响

 目的 探讨Wnt2在原发性肝细胞肝癌(HCC)中的表达及转染靶向Wnt2的siRNA对人肝癌HepG2细胞的抑制效果。方法 实时荧光定量PCR法和免疫组化法检测Wnt2在肝癌组织,癌旁组织及正常肝组织的表达差异;使用siRNA沉默人肝癌HepG2细胞Wnt2的表达后,检测Wnt2基因和蛋白的表达变化,并检测细胞的增殖和周期变化。结果 1）在上述组织中,Wnt2在癌内表达最高,癌旁次之,正常肝最低。2）使用siRNA沉默人肝癌HePG2细胞Wnt2后,Wnt2基因和蛋白表达下调,细胞增殖受抑制,其生长主要停滞在G0/G1期,而S期细胞所占比例下降。结论 肝细胞肝癌中存在Wnt2的高表达;siRNA可抑制HepG2细胞Wnt2的表达,并抑制HepG2生长,Wnt2基因可能是调控肝癌基因表达的新的靶基因。     

反义RNA阻断Hep G2细胞FasL的表达及功能研究

应用分子克隆技术将人FasLcDNA片段反向插入逆转录病毒载体pLXSN ,构建重组质粒pL (hFasL AS )SN ,转染包装细胞PA317后获得FasL反义RNA重组逆转录病毒表达载体假病毒上清 ,经NIH3T3细胞检测其感染滴度后转染肝癌细胞株HepG2细胞并筛选建系 ,命名为HepG2 hFasL AS。半定量RT PCR检测显示HepG2 FasL AS细胞FasL的mRNA明显少于正常HepG2细胞 ;FACS检测显示HepG2 FasL AS细胞FasL的表达与HepG2细胞相比显著下降 ;同时 ,HepG2 FasL AS细胞导致HL 6 0细胞凋亡能力有所下降。表明人FasL反义RNA重组逆转录病毒表达载体能抑制转染细胞FasL的表达并下调其致凋亡功能     

The RhoA-ROCK-PTEN pathway as a molecular switch for anchorage dependent cell behavior

The proliferation of anchorage-dependent cells of mesenchymal origin requires the attachment of the cells to substrates. Thus, cells that are poorly attached to substrates exhibit retarded cell cycle progression or apoptotic death. A major disadvantage of most polymers used in tissue engineering is their hydrophobicity; hydrophobic surfaces do not allow cells to attach firmly and, therefore, do not allow normal proliferation rates. In this study, we investigated the molecular mechanism underlying the reduced proliferation rate of cells that are poorly attached to substrates. There was an inverse relationship between the activity of the small GTPase RhoA (RhoA) and the cell proliferation rate. RhoA activity correlated inversely with the strength of cell adhesion to the substrates. The high RhoA activity in the cells poorly attached to substrates caused an increase in the activity of Rho-associated kinase (ROCK), a well-known effector of RhoA that upregulated the activity of phosphatase and tensin homolog (PTEN). The resulting activated PTEN downregulated Akt activity, which is essential for cell proliferation. Thus, the cells that were poorly attached to substrates showed low levels of cell proliferation because the RhoA-ROCK-PTEN pathway was hyperactive. In addition, RhoA activity seemed to be related to focal adhesion kinase (FAK) activity. Weak FAK activity in these poorly attached cells failed to downregulate the high RhoA activity that restrained cell proliferation. Interestingly, reducing the expression of any component of the RhoA-ROCK-PTEN pathway rescued the proliferation rate without physico-chemical surface modifications. Based on these results, we suggest that the RhoA-ROCK-PTEN pathway acts as a molecular switch to control cell proliferation and determine anchorage dependence. In cells that are poorly attached to substrates, its inhibition is sufficient to restore cell proliferation without the need for physico-chemical modification of the material surface.     

力学应变对体外培养动物细胞的影响

介绍了生物力学领域中细胞生长、增殖与分泌方面的实验研究进展.着重介绍了基底加载实验中不同环境对细胞分裂与增殖的作用;力学载荷对细胞黏附及生长的影响;力学应变对体外培养成骨细胞增殖与分泌的影响;流体环境对细胞生长增殖的作用.     

可对细胞施加双向应变的体外培养系统

为考察体外培养细胞在动应变作用下的响应，参考Winston等人的方法，我们制作了一套细胞体外培养系统，培养皿用有机玻璃作成，培养皿底为硅橡胶膜，下面有一封闭压力腔，通过对硅橡胶管和挤压轮间隙的调整，压力腔内的液压使硅橡胶膜产生设计应变，其应变范围可从0～4％调整，改变步进电机的转动方式，加载频率可从0．1～5Hz变化。     

E-cadherin表达缺失在白血病细胞行为中的作用

目的:确定上皮-钙黏蛋白(E-cadherin)表达缺失在白血病细胞行为中的作用,最终阐明E-cadherin介导的骨髓微环境与造血细胞相互作用改变在白血病发生中的作用。 方法:细胞黏附实验测定 HL-60细胞经5-氮杂脱氧胞苷（5-Aza-CdR）诱导E-cadherin表达后细胞黏附能力的改变,MTT法测定细胞增殖能力,细胞迁移实验确定细胞的迁移能力。结果:HL-60细胞经5-Aza-CdR诱导E-cadherin表达后,其对E-cadherin-Fc的黏附能力增加,细胞在E-cadherin-Fc上的增殖能力下降,细胞黏附导致细胞迁移能力下降。结论:白血病细胞中由于E-cadherin表达丧失,引起细胞黏附降低,增殖能力增强,细胞迁移活跃,表明E-cadherin表达缺失与白血病细胞行为的获得有关。     

蛇六谷提取物抑制K562细胞增殖并诱导分化的作用

目的:探讨蛇六谷提取物(TuAKe)抑制人慢性髓系白血病K562细胞增殖和诱导分化的作用机制。方法:不同浓度的TuAKe处理K562细胞,MTT比色法和半固体集落形成实验检测K562细胞的增殖能力;瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态;流式细胞术检测分化相关抗原CD11b、CD14和CD42b的阳性表达率;Western blot法检测细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白E1(cyclin E1)和红系分化核转录因子GATA-1的蛋白表达水平。结果:TuAKe能够抑制K562细胞增殖,改变细胞形态,抑制K562细胞进入S期,并阻滞在G_2/M期,提高分化相关抗原CD11b、CD14和CD42b阳性表达率,上调GATA-1蛋白表达,同时下调CDK2和cyclin E1蛋白表达(P0.05)。结论:TuAKe可能通过调控细胞周期抑制K562细胞增殖,同时诱导K562细胞多向分化。     

Targeting cells in motion: Migrating toward improved therapies

The development of clinical therapeutics that interfere with the migration of leukocytes has revolutionized the treatment of multiple sclerosis and holds great promise for the treatment of a wide range of inflammatory diseases. As the molecules essential for the multi‐step adhesion cascade that mediates cellular migration have been elucidated, the number of potential targets available to modulate leukocyte trafficking has increased exponentially. In this Viewpoint, we briefly review our current understanding of these mole‐cular targets and how these targets vary by tissue and leukocyte subset with emphasis on T cells. We then describe the two currently approved therapeutics that target cell migration, natalizumab and fingolimod, and discuss how an improved understanding of their function could pave the way for the development of safer and more efficacious therapies for inflammatory and autoimmune diseases.     

自体甲状腺组织与干细胞移植治疗甲状腺功能减退症的研究进展

不可逆性甲减患者需要终身服用甲状腺激素，对患者的日常工作和生活造成了很大的不便。随着近年来对自体甲状腺组织与干细胞移植研究的进展，有望解决甲减病人终身服药这一问题。自体甲状腺组织移植的动物实验以及人体试验均表明：甲状腺移植物不但能够存活，而且能够发挥作用。最新的胚胎干细胞（Embryonic stemcell，ESC）研究证明，ESC可以分化为甲状腺滤泡细胞。     

Self-loading and cell culture in one layer microfluidic devices

We report on a simple method for self loading and culture of mammalian cells in microfluidic multi-chambers for high throughput screening. The device was obtained by using one layer soft lithography with polydimethylsiloxane (PDMS) and thermal bonding on a glass slide. Self loading of cell suspension could be possible after degassing of the PDMS device for 30 min. Both cell loading efficiency and cell proliferation behaviors have been analyzed with triangle chambers of different sizes, all connected to the main flow channels with small entrances. We found that the number of cells loaded into the micro-chamber increased with the side length of the triangle, showing well size dependence and that self loading at a single cell level was possible for small chambers. For large chambers, the cell area density after loading and proliferation is however quite heterogeneous. For demonstration, HeLa cell growth behavior has been followed for 11 days until the total area of the largest chambers was fully filled.