角膜缘干细胞培养上清液对血管内皮细胞增殖的影响

目的：观察角膜缘干细胞培养液对血管内皮细胞增殖的影响。

方法：分别培养角膜缘干细胞及球结膜上皮细胞,并通过免疫组化检测AE-5蛋白鉴别角膜缘干细胞。搜集两组培养细胞的上清液加入培养的人脐静脉血管内皮细胞中,并设立对照组。培养24h后通过MTT法检测细胞增殖情况并进行统计学分析。

结果：角膜缘干细胞AE-5染色呈阴性,而球结膜上皮细胞为阳性。加入角膜缘干细球结膜上皮细胞和对照组培养液的血管内皮细胞MTT值分别为2.097±0.079,1.981±0.034和1.990±0.044。三组间有显著性差异(F=9.169,P=0.000)。加入角膜缘干细胞培养上清液的血管内皮细胞增殖活性明显高于其他两组(P=0.005和P=0.007)。

结论：角膜缘干细胞培养液能够促进血管内皮细胞的增殖,这可能是角膜缘干细胞的特征。本研究从功能学角度为角膜缘干细胞理论提供更多的依据。     

模拟角膜缘干细胞微环境诱导人多潜能干细胞分化为角膜上皮细胞的研究

目的：探讨模拟角膜缘干细胞(LSCs)微环境诱导人多潜能干细胞(hiPSCs)分化为角膜上皮细胞的可行性。方法：体外建立hiPSCs细胞系，利用transwell体系将hiPSCs与角膜基质细胞共培养模拟角膜缘干细胞微环境，添加小分子骨形态发生蛋白4(BMP4)和特异性转化生长因子β抑制剂(SB431542)，诱导hiPSCs向角膜上皮细胞分化。采用免疫荧光染色、流式细胞方法检测角膜上皮细胞特异标志物 CK3和CK12，角膜上皮细胞前体CK15，角膜缘干细胞标志物ABCG5的表达。结果：hiPSCs体外培养增殖活跃，免疫荧光染色显示干细胞特异性标志物OCT4、SOX2、TRA-1-60、NANOG呈阳性。采用transwell体系将hiPSCs与角膜基质细胞共培养，免疫荧光染色结果显示角膜缘干细胞标志物ABCG5及角膜上皮细胞前体标志物CK15阳性，角膜上皮细胞标志物CK3及CK12阴性； 在共培养的基础上添加小分子BMP4和SB431542，免疫荧光染色及流式细胞检测结果显示角膜上皮细胞特异性标志物CK3阳性表达，且随分化时间延长表达比例增高。结论：模拟角膜缘干细胞微环境同时添加小分子SB431542及BMP4，可成功诱导体外培养的hiPSCs向角膜上皮细胞分化。     

羊膜为载体的人角膜缘上皮细胞移植治疗大鼠角膜碱烧伤的研究

目的研究人角膜缘上皮细胞的生物学特性,探讨体外培养的人角膜缘上皮细胞移植进行眼表重建的临床应用价值及前景。方法体外培养人角膜缘上皮细胞,通过免疫荧光染色法和逆转录聚合酶链反应（RT．PCR）法分析表型,Brdu掺入法检测慢周期（slow—cycling）细胞。建立大鼠角膜碱烧伤模型,随机分为单纯对照组、羊膜移植（AMT）组及羊膜为载体的角膜缘上皮细胞移植（LSAT）组,术后通过裂隙灯显微镜观察、角膜切片HE染色及免疫荧光染色等方法对各组大鼠眼表恢复情况进行评价。结果培养早期大多数角膜缘上皮细胞p63和K19染色阳性,仅少数细胞K3染色阳性;随培养时间的延长,K3阳性细胞增多,部分细胞同时表达p63和K3。RT—PCR示培养的角膜缘上皮细胞中p63和K12均有阳性表达,而角膜上皮细胞仅表达K12。Brdu掺入法检测到慢周期细胞。动物实验表明,LSAT可以显著减轻角膜病变,使角膜恢复完整性和透明性,眼表评分各项指标与AMT组和对照组比较差异均有统计学意义。LSAT组大鼠角膜切片染色示大部分上皮细胞抗人核和K3染色阳性。结论体外培养的人角膜缘上皮细胞中p63不仅表达于角膜缘干细胞,在短暂扩充细胞中也有一定量的表达;慢周期细胞的存在证实了培养的角膜缘上皮细胞中角膜缘干细胞的存在,p63和K19阳性、K3阴性的细胞为角膜缘干细胞;羊膜为载体的体外培养的人角膜缘上皮细胞移植可有效重建眼表,具有较高的临床应用价值与发展前景。     

以不同性质羊膜为载体培养人角膜缘干细胞的生物学特性

目的:观察并比较在完整羊膜和去上皮层羊膜这两种不同性质的载体羊膜上培养的人角膜缘干细胞的生物学特性。方法:采用组织块培养法,将角膜缘组织块种植于完整羊膜(I组)和去上皮层羊膜(D组)上进行培养,并对细胞的生长特点,超微结构以及免疫荧光染色结果进行观察。结果:在这两种性质的羊膜上人角膜缘干细胞均可生长形成单层,扫描电镜观察见细胞之间存在细胞连接。免疫荧光细胞化学染色结果显示,I组细胞BrdU标记阳性率高于D组(I组vsD组,P<0.05),而对AE5和缝隙连接蛋白(Cx43)表达的阳性率低于D组(I组vsD组,P<0.05),对增殖细胞核抗原(PCNA)阳性表达两组均较高。结论:人角膜缘干细胞均可在这两种性质的羊膜上生长,在去上皮羊膜上生长的干细胞有不同程度的分化,而完整羊膜能更好的维持干细胞特性。     

人角膜缘干细胞体外培养的增殖与分化研究

目的了解角膜缘干细胞体外培养的增殖分化规律。方法组织块法培养细胞,测定细胞克隆形成率（ＣＦＥ）,免疫荧光染色检测干细胞表达角质蛋白Ｋ３的状况。结果原代培养２１天左右细胞生长达到饱和,传第１代７～１０天形成单层,ＣＦＥ为９．５２％±４．９７％;传第２代７天,ＣＦＥ为４．２５％±２．１０％（Ｐ＜０．０１）。正常角膜缘基底细胞不表达角质蛋白Ｋ３;原代培养的干细胞亦不表达Ｋ３,传第１代细胞有部分表达。结论人角膜干细胞位于角膜缘基底部,培养的角膜缘干细胞早期具有较高的增殖力并保持干细胞的分化特性。     

来氟米特活性代谢物A771726抑制角膜新生血管的实验研究

目的 探讨来氟米特活性代谢物丙二酸次氮酰胺(A771726)对角膜新生血管的抑制作用及机制. 方法 (1)碱烧伤法制作大鼠角膜新生血管模型,40只SD大鼠随机分成A、B、C及D组,每组10只大鼠(10只眼).空白对照组(A组)生理盐水滴眼,B、C、D组伤后分别滴用0.5%、1.0%及2.0%的A771726滴眼液,均每日4次,共28 d.每日裂隙灯显微镜下观察角膜新生血管的生长情况,测量新生血管面积.(2)不同浓度A771726与体外培养的人脐静脉内皮细胞(ECV-304)共同孵育,以四唑盐比色法(MTT法)检测细胞的增生活性,激光共聚焦显微镜检测免疫荧光染色增生细胞核抗原(PCNA)的表达.结果 (1)C、D组大鼠角膜新生血管面积均显著小于空白对照A组(P＜0.01),而B组大鼠角膜新生血管面积与A组差异无统计学意义(P＞0.05).(2)40、80、160、320 μmol/L A771726与人脐静脉内皮细胞共同孵育36 h可抑制细胞增生,随浓度增加抑制作用增强,免疫荧光染色显示细胞核PCNA的表达有降低.结论 A771726能通过抑制血管内皮细胞增生阻止角膜新生血管生成.     

角膜缘组织定位培养和冷冻后培养的实验研究

目的验证角膜缘干细胞的组织学定位,探讨低温冷冻保存对其增殖活性的影响。方法取新鲜角膜缘上皮组织和相应部位浅层巩膜组织各10块进行体外细胞培养,对比观察细胞生长情况。取冷冻保存的角膜缘上皮组织14例,观察体外培养后细胞生长情况。通过免疫组化方法检测冷冻保存的角膜缘上皮细胞的增殖活性和培养后单层细胞K3角蛋白的表达。结果10例新鲜角膜缘上皮组织培养后,7例有上皮细胞生长,1周形成细胞单层;10例浅层巩膜组织培养后未见细胞生长。14例冷冻角膜缘上皮组织培养后,4例有上皮细胞生长,9d形成细胞单层。5例冷冻角巩膜环组织冰冻切片中,3例可见角膜缘上皮基底细胞PCNA表达阳性。培养细胞对K3角蛋白特异性的AE-5单克隆抗体免疫反应阳性。结论角膜缘干细胞定位于角膜缘上皮基底部,低温冷冻保存的角膜缘干细胞组织可以保持增殖活性,体外培养后生长分化成为角膜上皮。     

人角膜缘干细胞体外培养后生物学特性的变化

目的 探讨人角膜缘干细胞体外培养后细胞形态学，抗原性和增殖能力的变化。方法 消化培养法体外培养人角膜缘干细胞。获得细胞单层并观察细胞形态学变化。利用间接免疫荧光组化检测人角膜缘组织HLA-DR抗原在培养前，后的变化，检测培养后细胞增殖核抗原和角膜上皮64KD角蛋白的表达。结果 原代细胞在培养1周形成单层细胞形态以圆柱状细胞为主，培养前角膜缘上皮下少星HLA-DR抗原分布，培养后单层细胞DR抗原表达阴性；单层细胞中多量，散在分布的增殖细胞核抗原阳性细胞，并且部分细胞表达64KD角蛋白，结论 角膜缘干细胞体外培养后分化为角膜上皮，不表达HLA-DR抗原，介仍保持较强的分裂增殖能力，可能是临床移植治疗干细胞缺乏眼表疾病患者的一种有效手段。     

BrdU示踪的恒河猴血管内皮细胞移植替代角膜内皮细胞的免疫组化染色观察

目的观察BrdU示踪标记的恒河猴血管内皮细胞移植替代同种异体角膜内皮细胞后角膜内表面免疫组化染色,探索血管内皮细胞移植替代角膜内皮细胞的可行性。方法体外培养恒河猴视网膜脉络膜血管内皮细胞,培养增生至第2代后置于含BrdU(10μg·mL-1)的1640培养液中传代72h,通过离心沉淀法移植到撕除后弹力层的恒河猴角膜内表面,术后取角膜行HE染色及抗BrdU免疫组化染色,观察角膜后表面的细胞分布及有无后弹力膜样组织,并观察角膜后表面细胞能否被抗BrdU染色着染。结果 HE染色显示,实验组角膜内表面可见细胞层生长,细胞后方未见后弹力膜样物质,抗BrdU免疫组化染色阳性,示该细胞为培养的BrdU示踪的血管内皮细胞;对照组角膜组织HE染色显示,角膜内表面光滑,未见细胞样结构,BrdU染色呈阴性,未见棕黄色着色的细胞样组织。结论 BrdU可成功示踪标记体外培养的血管内皮细胞,恒河猴血管内皮细胞能够在撕除后弹力层的角膜内表面生长。     

角膜缘干细胞克隆化培养影响因素的研究

目的探讨丝裂霉素C处理Swiss3T3成纤维细胞作为饲细胞的条件,了解兔角膜缘干细胞克隆化培养的增殖状况。设计对照实验研究。研究对象兔角膜缘干细胞单纯培养组,兔角膜缘干细胞与Swiss3T3成纤维细胞作为饲细胞的混合培养组。方法采用DMEM/F12培养基进行细胞培养,观察4.0μg/ml丝裂霉素C作用不同时间后3T3细胞数量的变化。DispaseⅡ酶消化兔角膜缘上皮细胞,与饲细胞混合接种,观察干细胞克隆形成情况,比较各代、各组的细胞克隆形成率(CFE)。用EDTA去除饲细胞,间接免疫荧光染色检测角膜缘干细胞克隆团表达增殖细胞核抗原(PCNA)情况。主要指标细胞数/毫升,细胞克隆形成率。结果4.0μg/ml丝裂霉素C处理2.5小时的Swiss3T3细胞,培养期间(约12日)细胞数量无明显变化,可作为饲细胞。与饲细胞共同培养的兔角膜缘干细胞形成细胞克隆团,细胞的平均CFE比较:有饲细胞组角膜缘干细胞明显高于无饲细胞组(t=2.982,P<0.01)。兔角膜缘干细胞冻存复苏后平均CFE比较,有饲细胞组明显高于无饲细胞组(t=3.007,P<0.01)。兔角膜缘干细胞克隆团中细胞PCNA染色为阳性。结论角膜缘干细胞与作为饲细胞的Swiss3T3成纤维细胞共同培养形成细胞克隆,其中含有干细胞,且具有高增殖力。     

人角膜及角膜缘上皮细胞分化标记的检测

目的检测分化标记在人角膜及角膜缘上皮细胞的表达,以了解角膜及角膜缘细胞分化状态,旨在发现新的角膜上皮干细胞的阴性标记。方法获取人角膜及角膜缘组织,对冰冻切片及整个角膜组织行免疫荧光染色检测分化标记钙粘连素E、角蛋白3(CK3)、角蛋白12(CK12)、缝隙连接蛋白43、巢蛋白(nestin)和包壳蛋白(involucrin)的表达,经荧光显微镜及激光扫描共焦电镜观察,并行半定量RT-PCR以检测其相关分化标记基因的表达。结果分化标记CK3、CK12、缝隙连接蛋白43、巢蛋白和包壳蛋白在角膜和角膜缘上皮的表层细胞表达,角膜缘基底细胞不表达。激光扫描共焦电镜观察及RT-PCR结果显示角膜缘基底上皮细胞不表达细胞CK3、连接蛋白43和巢蛋白,而角膜上皮细胞则明显表达。结论角膜及角膜缘表层上皮较为成熟分化,而角膜缘基底细胞具有未分化细胞的特征,很可能是干细胞的部位。     

体外培养不同代角膜缘干细胞特性分析

目的比较不同代角膜缘干细胞的生物学特性,为角膜缘细胞移植在临床中的氉应用提供依据。方法组织块培养法体外培养角膜缘干细胞,光镜观察、HE染色和免疫荧光染色分析原代、第1代和第2代角膜缘细胞形态学特性;流式细胞技术定量检测原代、第1代和第2代角膜缘细胞ABCG2表达;MTT比色法测定体外培养原代、第1代和第2代角膜缘干细胞的增殖活性变化。结果倒置相差显微镜下可见原代细胞培养24h有单个细胞从组织块边缘迁出,48h细胞局部可见拉网样生长趋势,72h出现大片细胞,细胞呈现多边形或多角形,96h细胞几乎铺满整个培养板。随着传代次数的增加,细胞形态变得不规则,CK3单克隆抗体表达阳性率逐渐增强;p63单克隆抗体原代和第1代细胞间表达阳性率无明显差别,第2代细胞表达量明显减弱。流式细胞检测显示原代、第1代和第2代细胞ABCG2表达阳性率分别为13.41%、22.96%和4.43%。MTT结果显示随传代次数增加细胞增殖活性逐渐下降。结论原代和第1代角膜缘干细胞可以作为制备组织工程角膜上皮细胞膜片的较理想种子细胞。     

培养的同基因兔角膜缘干细胞移植治疗兔眼表烧伤

目的:探讨培养的同基因兔角膜缘细胞移植治疗眼表疾病的方法和疗效。方法:采用消化培养法,兔角膜缘组织进行体外培养,载体为冰冻保存人羊膜,培养的细胞形成单层后移植到已去除病变组织的碱烧伤兔眼球表面,6例兔三度碱烧伤眼进行了培养的同基因兔角膜缘干细胞移植,通过HE染色和免疫荧光染色法,观察眼表结构的愈合情况。结果:术后上皮化进程加快(2～3wk,P<0.05),2mo内均形成较稳定的眼表上皮结构,角膜轻度血管化和结膜化。结论:培养的同基因角膜缘干细胞移植术可作为治疗眼表烧伤、重建眼表的有效方法。     

角膜缘niche细胞与基质细胞维持角膜缘干细胞功能的对比研究

目的　比较角膜缘niche细胞（limbal niche cells，LNCs）与角膜缘基质细胞（limbal stromal cells，LSCs）在维持角膜缘干细胞功能上的不同特性。方法　将LNCs和LSCs分别从6个角膜缘组织分离，并在相同的条件下培养、传代。LNCs与LSCs经丝裂霉素C（mitomycin C,MMC）处理后分为LNCs组与LSCs组作为饲养细胞分别与角膜缘干细胞共培养，比较两组角膜缘干细胞克隆形成率（colony-forming efficiency,CFE）、上皮细胞复层化以及细胞标志物和部分基因的表达。结果　LNCs组角膜缘干细胞CFE（6.57±1.54）%高于LSCs组（1.43±0.47）%。 LNCs组细胞复层上皮数（4~5层）多于LSCs组（2~3层）。角膜缘干细胞克隆与免疫荧光染色及mRNA半定量分析结果显示，LNCs组比LSCs组表达了更多干细胞标志物ΔNp63，能更有效地维持角膜缘干细胞的细胞特性。逆转录PCR分析结果显示，LNCs组与LSCs组都分泌了一些维持角膜缘干细胞生长的生长因子，但LNCs组比LSCs组高表达上皮型钙黏蛋白（E-cadherin），低表达营养神经素3（NT3），能更好地支持角膜上皮增殖。结论　LNCs比LSCs能更好地支持角膜缘干细胞的生长及维持其干细胞特性。     

人角膜缘干细胞的原代培养和生物学鉴别

目的 探讨人角膜缘干细胞（stem cell,SC)体外培养方法并观察其生物学活性。方法 应用消化培养法对人角膜缘组织进行原代培养,记录其生长特性。待细胞生长至80％汇合时,分别采用针对64KD角蛋白的AE5、针对一组酸性角蛋白的AE1单克隆抗体,抗增殖细胞核抗原单克隆抗体（anti-proliferatin cell nuclear antigen,PCNA),针对50KD烯醇酶特异的单克隆抗体4G 10．3,通过间接免疫荧光细胞化学染色对培养细胞进行鉴别。结果 人角膜缘组织应用消化培养法在6－7d达到80％汇合状态,应用间接免疫细胞化学染色,AE1、AE5染色,胞浆染色呈阳性。PCNA染色、细胞核染色阳性,4G 10．3亦可见阳性结果。结论 应用消化培养法可成功地对人角膜缘组织进行原代培养,培养后细胞既可保持角膜上皮特性,又含有具有强增殖潜力的原始细胞,适合用于临床移植治疗眼表疾病。     

人角膜上皮干细胞的低钙培养及碱性成纤维细胞生长因子对其增殖的影响

目的 探讨如何获取较纯的人角膜上皮干细胞,以及碱性成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,bFGF)对人角膜缘上皮干细胞增殖的影响,为干细胞的移植奠定基础。方法 采用低钙培养法对人角膜缘体外培养,将培养的细胞行AE5免疫荧光染色,观察培养细胞的分化状态,并将其分别置于不同浓度的bFGF中,通过数码照相技术和计算机图像分析系统,检测角膜干细胞的增殖。结果 体外培养的细胞以角膜上皮干细胞为主;不同浓度的bFGF(1-100ng/ml)可促进体外培养的人角膜缘上皮干细胞的增殖（P＜0．001）,而各实验组间比较,差异无显著性（P＞0．05）。结论 将无钙培养液与低钙培养基组合,可获得较纯的、未分化的角膜干细胞;bFGF对人角膜上皮干细胞的增殖具有重要的促进作用。计算机图像分析系统适用定量检测呈膜状生长的上皮细胞增殖,是一种新颖、实用、准确的检测手段。     

肿瘤抑素Tum5对人脐静脉血管内皮细胞血管生成活性以及碱烧伤诱导大鼠角膜新生血管的抑制作用

目的　研究肿瘤抑素Tum5对人脐静脉血管内皮细胞血管生成活性以及碱烧伤诱导的大鼠角膜新生血管的抑制作用。方法　取对数生长期人脐静脉血管内皮细胞分为4组:正常对照组:无任何处理的人脐静脉血管内皮细胞;rAd-GFP组:人脐静脉血管内皮细胞经rAd-GFP感染并培养;rAd-Tum5组:人脐静脉血管内皮细胞经rAd-Tum5感染并培养;rAd-Tum5+VEGF组:人脐静脉血管内皮细胞经rAd-Tum5感染后经外源性VEGF处理。通过CCK-8活性检测试剂盒、Transwell实验、Matrigel实验分别检测细胞增殖率、迁移细胞数及管腔形成情况。取雄性健康清洁级SD大鼠64只采用随机数字表法将大鼠分为:正常对照组、碱烧伤组、碱烧伤+rAd-GFP组、碱烧伤+rAd-Tum5组,每组16只,除正常对照组外其余各组建立角膜碱烧伤模型。其中正常对照组无任何处理,碱烧伤组、碱烧伤+rAd-GFP组、碱烧伤+rAd-Tum5组于烧伤后分别经结膜下注射等量无菌生理盐水、rAd-GFP、rAd-Tum5病毒,记录碱烧伤后第1天、第7天、第14天角膜新生血管相对面积及浸润炎性细胞数。结果　CCK-8实验结果显示rAd-Tum5组较正常对照组、rAd-GFP组细胞增殖率降低（均为P<0.01）;而rAd-Tum5+VEGF组细胞增殖率较rAd-Tum5组显著升高（P=0.004）,rAd-Tum5+VEGF组与正常对照组和rAd-GFP组相比差异均无统计学意义（均为P>0.05）。Transwell实验结果显示rAd-Tum5组相对于正常对照组、rAd-GFP组每个视野细胞迁移数显著降低（均为P<0.01）;而rAd-Tum5+VEGF组相对于rAd-Tum5组显著升高（P=0.000）,但其迁移能力尚未恢复到正常水平,与正常对照组和rAd-GFP组相比差异均有统计学意义（均为P<0.05）。Matrigel实验结果显示rAd-Tum5组相对于正常对照组、rAd-GFP组每个视野细胞成管数显著降低（均为P<0.01）;而rAd-Tum5+VEGF组相对于rAd-Tum5组显著升高（P=0.001）。大鼠角膜碱烧伤后第1-14天,各组角膜新生血管密度及数量逐渐增高,但是碱烧伤+rAd-Tum5组第7天、第14天角膜新生血管相对面积均显著低于碱烧伤组和碱烧伤+rAd-GFP组,提示Tum5能降低角膜新生血管生长速率并减少新生血管密度,抑制大鼠碱烧伤诱导的新生血管的形成。碱烧伤后第7天、第14天,正常对照组角膜完整、细胞排列有序,无炎性细胞浸润;碱烧伤后第7天,碱烧伤组、碱烧伤+rAd-GFP组上皮结构紊乱,角膜水肿,炎性细胞浸润明显,而碱烧伤+rAd-Tum5组每个视野炎性细胞浸润数较碱烧伤组、碱烧伤+rAd-GFP组明显减少,差异均有统计学意义（均为P<0.01）。碱烧伤后第14天,碱烧伤组、碱烧伤+rAd-GFP组和碱烧伤+rAd-Tum5组每个视野炎性细胞浸润数较第7天显著下降,同时碱烧伤+rAd-Tum5组角膜上皮结构整齐,水肿消退,每个视野炎性细胞浸润数显著低于碱烧伤组以及碱烧伤+rAd-GFP组,差异均有统计学意义（均为P<0.01）。结论　Tum5可能经VEGF通路抑制人脐静脉血管内皮细胞血管生成活性;Tum5可显著抑制碱烧伤诱导的角膜新生血管生成及炎性细胞浸润。     

培养角膜缘干细胞羊膜移植治疗碱烧伤动物的实验研究

目的 观察培养生长于羊膜的角膜缘干细胞移植的治疗角膜缘碱烧伤伤的效果。方法 将兔角膜缘干细胞在的代培养后接种于羊膜,对新西兰大白兔角膜缘碱烧伤动物模型行角膜缘干细胞羊膜移植术,并对治疗后的角膜进行临床及病理学检查。结果 体外培养的兔角膜缘士细胞可在羊膜上继续增殖、分化为密集的角膜上皮细胞层;角膜缘干细胞移植术后兔角膜缘轻度充血、角膜上皮完整基质细胞浸润减轻、新生血管减少。组织病理学染色证实,角膜缘     

人角膜缘干细胞的体外培养及鉴定

目的探讨人自体角膜缘干细胞（LSCs）体外培养及鉴定的方法。方法将供体新鲜人角膜缘组织在制备的含20％胎牛血清DMEM／F12培养基的羊膜载体上应用组织块培养法进行体外培养,对培养获得的LSCs用苏木精-伊红染色在倒置显微镜下进行形态学观察,用免疫荧光技术鉴定培养的LSCs细胞。结果组织块静置2h后贴壁良好,3～4d细胞从组织块边缘荫出,7～10d细胞出现生长高峰,12～14d形成良好的细胞单层。细胞形态呈多边彤、圆形、卵圆形和梭形。第14天时行间接免疫荧光染色,可见大量细胞表达p63,呈细胞质的绿色荧光;少量细胞表达AE5,呈细胞质的绿色荧光和细胞核的红色荧光。结论组织块培养法体外培养的人LSCs具有与正常人LSCs相一致的生物学特性。     

角膜缘微环境细胞的研究进展

角膜缘微环境细胞（limbal niche cell,LNC）是近年来发现的一种来自于角膜缘干细胞微环境且具有血管内皮祖细胞和间充质干细胞特性的多能干细胞。LNC具有分化为血管内皮细胞、角膜上皮细胞、角膜基质细胞等多种细胞的潜能。体外实验发现,LNC在三维立体培养环境中可以维持角膜缘干细胞的特性;动物实验发现,LNC可以预防和治疗碱烧伤所致的角膜缘干细胞缺乏。LNC还可以促进角膜基质的无瘢痕修复,减少修复过程中的新生血管化,提示其可以重建角膜基质。因此,在角膜缘干细胞缺乏、角膜基质损伤等疾病的治疗中,LNC可能是一种理想的治疗细胞。