siRNA抑制RASSF1A表达对Hela细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨RASSF1A基因的特异性小干扰RNA(siRNA)对宫颈癌Hela细胞系生长增殖及凋亡的影响。方法采用LipofectamineTM2000介导的脂质体法将特异性siRNA瞬时转染进Hela细胞,半定量RT-PCR检测转染前后RASSF1A mR-NA表达变化,免疫细胞化学法检测RASSF1A蛋白表达水平变化,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果 RT-PCR与免疫细胞化学检测结果显示,转染siRNA后RASSF1A基因的表达下降,细胞增殖加快,而细胞凋亡率则显著降低。结论靶向RASSF1A基因的siRNA可有效降低宫颈癌Hela细胞中该基因的表达,用于RASSF1A基因功能研究;RASSF1A基因表达下调促进细胞增殖,同时导致细胞凋亡减少。     

pSecTag-EGFP真核表达载体的构建及其转染鸡胚胎成纤维细胞的研究

目的 研究pSecTag真核表达载体转染鸡胚胎成纤维细胞的转染效率,选出该质粒转染鸡胚胎成纤维细胞的最佳转染条件,从而为研究目的 基因在鸡胚胎成纤维细胞中成功表达奠定基础.方法 用PCR方法克隆得到EGFP基因,通过酶切、连接、转化的方法构建了pSecTag-EGFP分泌型真核表达载体,设计优化试验,通过脂质体介导的方法转染鸡胚胎成纤维细胞,用Bradflord检测法检测正交优化不同组合细胞培养液中所表达分泌的增强绿色荧光蛋白的相对含量.结果 成功构建psecTag-EGFP分泌型真核表达载体,并选出该质粒转染鸡胚胎成纤维细胞的最佳转染条件,即脂质体加2μl、质粒加1.0μg.结论 脂质体介导的方法能有效转染鸡胚胎成纤维细胞.     

Lipofectamine^TM 2000介导pIRES2-EGFP-NT3转染小鼠耳蜗成纤维细胞的实验研究

目的检测真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3在阳离子脂质体介导下对新生小鼠耳蜗成纤维细胞的转染情况。方法培养新生小鼠耳蜗成纤维细胞，用阳离子脂质体Lipofectamine^TM 2000介导的方法，将含有目的基因NT3的真核表达质粒载体pIRES2-EGFP．NT3对其进行转染，转染后24h，通过Confocal显微镜观察新生小鼠耳蜗成纤维细胞的转染情况。结果通过阳离子脂质体Lipofectamine^TM 2000介导，真核表达质粒载体plRES2-EGFP-NT3能有效转染新生小鼠耳蜗成纤维细胞。结论含有目的基因NT3的真核表达质粒载体plRES2-EGFP-NT3在阳离子脂质体介导下对新生小鼠耳蜗成纤维细胞的有效转染为研究NT3基因转染对正常及致聋小鼠耳蜗效应的实验奠定了基础。     

脂质体介导E1A—TK基因转染人肺腺癌细胞A549体外研究

目的用脂质体转染真核表达质粒PcDNA3E1A-TK入人肺腺癌细胞A549,观察丙氧鸟苷(GCV)、X射线及二者联合对转染细胞的体外杀伤作用。方法用阳离子脂质体介导真核表达质粒PcDNA3E1A-TK转染人肺腺癌细胞A549,PCR、RT-PCR方法分别检测转染细胞中E1A-TK基因DNA整合、mRNA表达。MTT法测不同浓度GCV、不同剂量X射线及一定剂量X线照射后再给一定量GCV对转染细胞的生长抑制率。结果PCR、RT-PCR结果表明转染细胞有E1A-TK基因整合、mRNA表达。根据IC50,转染细胞对GCV、X射线的敏感性分别比亲代细胞提高111.3倍和2.9倍,在作用相同时间后,GCV+X线照射治疗对转染细胞的生长抑制作用比单纯GCV或X线治疗明显增强(P<0.01)。结论脂质体介导外源基因E1A-TK成功转入人肺腺癌A549细胞并获得表达;转染细胞获得了对GCV和X线的敏感性,GCV和X线对转染细胞有协同杀伤作用。     

脂质体介导的hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的实验研究

目的 观察脂质体介导的人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein-2,hBMP-2)基因转染兔骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)后mRNA及其蛋白的表达.方法 采用脂质体介导的真核细胞转染技术,将含hBMP-2编码序列的真核表达质粒转染兔BMSCs,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化及免疫印迹法(Western blot)等手段检测转染后hBMP-2 mRNA及其蛋白的表达.结果 通过脂质体介导的真核转染方法能成功将外源hBMP-2基因转入兔BMSCs,并经RT-PCR、免疫组化和蛋白印迹法证实,转染pcDNA3.1-hBMP-2 后的兔BMSCs内有大量hBMP-2 mRNA 的转录和蛋白的表达.结论 通过脂质体介导的真核转染方法可以将外源hBMP-2基因转染BMSCs,并使其获得较为稳定的表达.     

RT-PCR检测MUC1基因转染树突状细胞的表达

目的 向人外周血来源的树突状细胞(DCs)转染人MUC1质粒，使DCs特异性的表达和提呈MUCl。方法 应用脂质体将人MUCl质粒转染体外培养的外周血来源的DCs，RT-PCR检测转染人MUC1质粒DCs的表达。结果转染MUC1质粒的DCs，RT-PCR检测有一特异性扩增带。结论 用脂质体能成功地将人MUC1质粒转入DCs并表达。     

MTAl基因对宫颈癌细胞HeLa侵袭转移的影响

目的探索MTAl基因与宫颈癌细胞HeLa侵袭迁移能力的关系。方法以脂质体LipofectamineTM2000介导的方法将含有MTAl全长基因的质粒pEGFP—C1／MTAl转染HeLa细胞,应用Westernblotting检测转染效果,细胞黏附实验检测细胞黏附能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化,Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。结果MTAl质粒转染的宫颈癌HeLa细胞中,MTAl蛋白的表达、黏附能力、迁移及侵袭能力均明显高于转染空载体组及未转染组（P〈0．05）.结论MTAl基因与宫颈癌细胞的侵袭迁移能力有关,MTAl基因可能成为宫颈癌治疗的一个新的靶点。     

脂质体介导转化生长因子-β1基因修饰骨髓间充质干细胞成软骨分化

目的 脂质体介导TGF-β1目的基因转染骨髓间充质干细胞(MSC)，研究对MSC成软骨分化的特异性细胞外基质的影响。方法 以梯度离心结合换液法获得并纯化骨髓间充质干细胞(MSCs)，采用脂质体介导法将重组真核表达质粒pcDNA3-TGF-β1转染MSCs，Rr-PCR和Western blot鉴定后，对转染后骨髓间充质干细胞的Ⅱ型胶原(ColⅡ)、纤维连接蛋白(FIN)的表达行RT-PCR和Western blot检测。结果 获得纯度较高的成年中国小型猪骨髓间充质干细胞(MSCs)；脂质体为介导将全长人TGF-β1目的基因导入MSC，经RT-PCR和Western blot鉴定转染成功，转染后的MSC较未转染MSC成软骨分化特异性细胞外基质ColⅡ、FNmRNA和蛋白表达明显增强。结论以脂质体介导法可以将TGF-β1目的基因转染骨髓间充质干细胞，转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多。     

转染RECK基因对人骨肉瘤MG-63细胞MMP-2活化及侵袭能力的影响

目的 观察转染RECK基因对人骨肉瘤细胞MG-63的MMP-2活化及细胞侵袭力的影响.方法 以脂质体LipofectamineTM2000介导的方法将含RECK全长基因的真核重组表达质粒pcDNA3-RECK转染入MG-63细胞,RT-PCR、流式细胞术检测目的 基因的表达,明胶酶谱法、Matrigel侵袭实验分别检测MG-63细胞MMP-2活化比例及细胞侵袭力变化;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法和细胞生长曲线法观察转染质粒DNA对细胞的毒性作用.结果 转染后RECK基因在MG-63细胞Mrna和蛋白水平分别有稳定高表达;明胶酶谱显示重组质粒转染组MMP一2的活化比例均明显低于正常对照组、空载质粒转染组(均P<0.01),Matrigel侵袭实验显示重组质粒转染组穿透Matrigel的细胞数目均明显低于正常对照组、空载质粒转染组(均P<0.05);而MTT法测重组质粒转染组细胞生长曲线与正常对照组、空载质粒转染组无明显差异(均P>0.05).结论 RECK基因过表达可显著减少骨肉瘤细胞MG-63的MMP-2活化及其侵袭能力,RECK基因可能成为肿瘤治疗的新靶点.     

一氧化氮合酶基因转染小鼠内皮祖细胞的实验研究

目的 探讨利用脂质体介导内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因体外转染小鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPC)的可行性.方法 密度梯度离心法分离ICR小鼠骨髓来源单个核细胞培养制备小鼠EPC并鉴定;构建、扩增、提取并纯化pcDNA3.0/eNOS基因质粒;用EPC培养基配成2×105·mL-1细胞悬液,按0.6 mL/孔重新铺6孔板,待细胞生长至80％左右融合时,用脂质体LipofectamineTM 2000体外转染eNOS基因至EPC.转染48 h后,采用RT-PCR检测EPC中eNOS的表达,硝酸还原酶法检测EPC中一氧化氮(NO)的含量,荧光探针DCFH-DA活性氧检测氧自由基(ROS)的含量.结果 成功培养EPC,成功构建pcDNA3.0/eNOS基因载体.转染48 h后,EPC中eNOS表达量明增加(P＜0.01),NO含量明显升高(P＜0.01),ROS含量明显降低.结论 脂质体介导eNOS基因能够有效转染小鼠EPC,并能在EPC中有效表达.     

pcDPG基因治疗甲状旁腺功能减退症的实验研究

目的构建甲状旁腺激素(PTH)基因的重组真核表达质粒,评价体外转染后PTH基因的表达与生物学活性,同时观察其对甲状旁腺功能减退动物的基因治疗作用。方法(1)从人胚甲状旁腺组织中克隆PTH基因,拓扑法构建其重组真核表达质粒pcDNA3.1-PTH-GFP(pcDPG),并采用酶切、聚合酶链反应(PCR)及DNA测序鉴定;(2)用脂质体转染pcDPG入293细胞,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达并计算转染率,同时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)验证PTH基因的表达;(3)纯化转染细胞上清中PTH蛋白,进行生物学活性鉴定;(4)建立甲状旁腺功能减退症的家兔模型,将pcDPG质粒以肌肉注射进行分组治疗,监测血钙、磷和PTH值及存活时间,通过形态学观察各器官的病理变化。结果(1)酶切与PCR结果与预期相同,测序结果与文献中序列同源性为99.3%;(2)细胞转染后24h即可见GFP表达,随时间延长而表达增强,48h转染率达38.9%和62.5%,同时RT-PCR见PTH基因表达;(3)纯化的PTH蛋白可对抗甲状旁腺切除小鼠的抽搐症状;(4)模型兔术后第2d血钙(1.71mmol/L±0.09mmol/L,1.73mmol/L±0.03mmol/L,1.75mmol/L±0.03mmol/L,1.65mmol/L±0.04mmol/L)明显低于术前(2.82mmol/L±0.21mmol/L,P<0.05),术后第2d PTH值(5.03pg/ml±0.05pg/ml,5.04pg/ml±0.05pg/ml,5.03pg/ml±0.07pg/ml,5.29pg/ml±0.03pg/ml)也明显低于术前(11.63pg/ml±1.60pg/ml),但是术后第2d血磷增高(P<0.05),pcDPG质粒大、中剂量组治疗后48h血钙、磷与PTH值均恢复至正常。结论脂质体介导的质粒pcDPG体外转染率较高,能表达有活性的PTH蛋白,同时对甲状旁腺功能减退家兔有较好的疗效,从而为甲状旁腺功能减退症基因治疗的进一步研究奠定了基础。     

RNA干扰单独及联合p53基因对肺癌细胞增殖的抑制作用

目的观察RNA干扰技术单独及联合p53基因对肺癌细胞增殖的影响。方法用阳离子脂质体Lipofectamine2000分5组介导RNA干扰质粒和p53基因单独或共转染到非小细胞肺腺癌细胞系A549细胞．观察转染后第1、3、5、7天该细胞的增殖活力．采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）测定吸光度（A）．以检测细胞增殖活力。结果各组A均值分别为：空白对照组：1．406，脂质体组：1．238，RNA干扰质粒组：0．168，p53组：0．22，干扰质粒＋p53组：0．109，实验组与对照组比较差异显著（P〈0．05），以共转染干扰质粒＋p53组最强。结论RNA干扰技术可成为有效抑制非小细胞肺腺癌的治疗新方法，联合抑癌基因p53可增强其对肺癌细胞的抑制作用。     

Lipofectamine 2000和jetPRIME~（TM）对A549细胞转染效率及毒性的比较研究

目的评价及比较两种转染试剂Lipofectamine 2000和jetPRIMETM对A549细胞的转染效率及毒性。方法分别利用Lipofectamine 2000和jetPRIMETM将pEGFP-N1质粒转染A549细胞,转染24h后荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的表达,计算转染效率,四甲基偶氮唑盐比色法[3-（4.5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]检测两种转染试剂对A549细胞的毒性。结果质粒与Lipofectamine 2000比例（μg/μl）在1∶2至1∶3.5之间变化时,Lipofectamine 2000转染效率变化不明显,细胞毒性随着Li-pofectamine 2000用量增多而增大,质粒与Lipofectamine 2000比例（μg/μl）为1∶2.5时转染率最高,达（50.6±4.9）%,细胞存活率为（89.2±9.1）%;质粒与jetPRIMETM比例（μg/μl）在1∶1至1∶4之间变化时,jetPRIMETM转染效率变化明显,而细胞毒性变化不明显,质粒与jetPRIMETM比例（μg/μl）为1∶2时转染率最高,为（30.6±2.8）%,细胞存活率为（100.6±4.8）%;两者最大转染率及相应的细胞存活率均有统计学差异（P〈0.01,P〈0.05）。结论 Lipofectamine 2000转染A549细胞的效率高于jetPRIMETM,细胞毒性亦强于jetPRIMETM。     

人外周血单核细胞3种不同转染方法的比较

目的 采用3种不同方法转染原代人外周血单核细胞,以寻找一种简便、高效的单核细胞转染方法.方法 采用人淋巴细胞分离液从健康人外周血中分离出单个核细胞,锥虫蓝拒染法检测细胞存活率.单个核细胞在孔板内培养2 h后吸弃悬浮的淋巴细胞,获得贴壁的单核细胞.分别采用Lipofectamine 2000介导载体质粒(PEGF-N1)...     

人淋巴细胞趋化因子真核表达质粒的构建及体外转染的生物学活性测定

目的：构建人淋巴细胞趋化因子(HLptn)真核表达质粒，在膀胱肿瘤细胞株BIU-87中表达重组质粒，并检测趋化活性。方法：用RT-PCR法自活化的人外周血淋巴细胞扩增HLptn含编码区序列的cDNA，克隆至pGM-T Easy T载体，测序正确后，将目的片段插入pcDNA3．1( )载体，获得阳性克隆pcDNA3．1( )．HLptn；用脂质体介导其转染BIU-87细胞，用Western-blot检测转染后细胞中HLptn的表达；取转染后的上清液，采用Boyden小室法检测表达的HLptn趋化CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞的生物学活性。结果：克隆的cDNA序列与GenBank中U23772的序列编码区内第225位碱基不同，系同义突变，构建了真核重组表达载体pcDNA3．1( )-HLptn；转染的BIU-87细胞表达HLptn，其培养上清对CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞具有趋化活性。结论：成功构建的HLptn真核表达系统可在人膀胱肿瘤细胞株BIU-87中表达。     

HBV X基因转染L02细胞及其蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响

目的探讨脂质体和电穿孔法在HBV X基因转染L02细胞中的差别及X基因蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响。方法构建HBV X基因重组表达质粒,通过电穿孔和脂质体法转染人正常肝细胞L02细胞,以绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)表达水平评价转染效率,流式细胞技术检测L02细胞HBV X蛋白的表达水平。RT-PCR、流式细胞技术及western-blot分析L02细胞、转染空载体以及转染HBV X基因重组表达质粒的L02细胞CⅡTA和HLA-DR的表达差别。结果采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000的转染效率为(6.4±3.5)%,显著低于电穿孔法(41.46±5.8)%,P<0.01。脂质体法转染的L02细胞HBV X蛋白表达水平为(5.1±3.9)%,显著低于电穿孔方法(37.5±4.1)%表达,P<0.01。转染了HBV X基因重组表达质粒的L02细胞检测到CⅡTA和HLA-DR mRNA和蛋白表达,而L02细胞本身及转染空载体的L02细胞未检测到CⅡTA和HLA-DR的表达。结论 HBV X基因真核表达载体pHBx-IRES2-EGFP通过电穿孔法转染L02细胞较脂质体法有明显较高的转染效率和更高的目的基因的表达,HBV X基因诱导了L02细胞中CⅡTA和HLA-DR的表达。     

NDY1shRNA真核表达质粒构建及其在卵巢癌A2780细胞中的稳定表达

目的：构建NDY1 shRNA真核表达载体,并获得稳定表达shNDY1质粒的卵巢癌A2780细胞。方法根据Gen‐Bank数据库提供的NDY1基因核苷酸序列,设计并合成靶向干扰NDY1基因的小发夹RNA（shRNA）序列,插入表达载体获得重组质粒pGPU6／GFP／Neo‐shNDY1。重组质粒测序鉴定正确后,脂质体介导转染A2780细胞,经G418筛选及有限稀释法获得稳定转染细胞,采用实时定量聚合酶链反应法（RT‐qPCR）和蛋白免疫印迹法分别检测A2780稳定转染细胞NDY1 mRNA及蛋白表达。结果重组质粒测序正确,转染shNDY1后,A2780细胞mRNA及蛋白表达水平分别下降（72．89±4．83）％及（55．85±4．84）％,与对照组相比差异有统计学意义（ P＜0．05）。结论成功构建 pGPU6／GFP／Neo‐shNDY1真核表达质粒,并获得shNDY1稳定转染的卵巢癌A2780细胞,为细胞水平研究NDY1与卵巢癌的关系奠定实验基础。     

KDR siRNA对乳癌细胞凋亡和NES1与RUNX3基因甲基化影响

目的探讨体外水平利用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)敲减含激酶插入区受体(KDR)基因治疗乳癌的可行性和特异性。方法采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000TM作为转染试剂,将针对人KDR基因的siRNA转染人乳癌细胞株MCF-7敲减KDR基因的表达。通过Hoechst 33258染色观察MCF-7细胞的凋亡情况;采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测NES1基因和RUNX3基因甲基化状态和mRNA的转录水平。结果靶向KDR的siRNA转染MCF-7细胞后可诱导细胞凋亡,NES1基因和RUNX3基因甲基化程度降低,出现非甲基化条带,同时mRNA表达上调。结论KDR siRNA在体外能逆转MCF-7细胞的NES1基因和RUNX3基因甲基化,并诱导细胞凋亡。     

pcDNA3.1/hVEGF165的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的　克隆人血管内皮生长因子基因VEGF165片段,构建pcDNA3·1 /hVEGF165,观察其在COS 7细胞中的表达,为基因治疗缺血性心脏病奠定基础。方法　从胎儿心肌组织中提取总RNA,应用RT PCR方法获得hVEGF165基因,将其重组入T载体,PCR法鉴定并测序,双酶切后克隆入真核表达载体pcDNA3 1 /myc his B中,构建pcDNA3 1 /hVEGF165重组体。用脂质体介导将其转染COS 7细胞,WesternBlotting方法检测rhVEGF165的表达蛋白。结果　RT PCR方法从胎儿心肌组织获得正确的hVEGF165基因序列,成功构建pcDNA3·1 /hVEGF165且实现转染COS 7细胞的瞬时表达。结论　该实验构建的pcDNA3· 1 /hVEGF165转染真核细胞COS 7能够表达rhVEGF蛋白。     

NNMT真核表达载体的构建并转染SMMC7721肝癌细胞株

目的构建pcDNA3.1(-)/NNMT(尼克酰胺-N-甲基化酶)真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC7721中。方法采用PCR法从PGEX4T-1/NNMT重组质粒中克隆得到NNMTcDNA全长序列,并将扩增的cDNA片段与pMD19-T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC7721,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用RT-PCR检测转染前后该细胞株NNMT基因的mRNA表达水平。结果真核表达载体构建成功,经RT-PCR检测,重组质粒转染株的NNMT基因mRNA表达水平高于对照组,证实NNMT基因已经稳定转染到SMMC7721细胞中并得到表达。结论成功建立了人基因NNMT的稳定转染细胞株,为进一步研究NNMT的功能奠定了基础。