转染hVEGF165基因的骨髓间充质干细胞移植治疗兔心肌梗死

1 材料和方法 1.1 材料 健康纯种新西兰大白兔48只,雌雄不拘,体质量2.0～2.5 kg,兔龄4～5 mo,由岭南科研动物中心提供.低糖DMEM(Gibco产品);Percoll分离液(Pharmacia产品);VIII因子多克隆抗体及免疫组化检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);BrdU mAb BrdU检测试剂盒(Roche产品);AdTrackCMV-VEGF165真核表达质粒(由广东省人民医院中心实验室惠赠);LipofectamineTM 2000 reagent(GIBCOL).     

人VEGF基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：建立人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的方法。方法：采用密度梯度离心-贴壁培养法获Wistar大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,测定其生长曲线和表面标志CD34,CD44,CD45及SH3,检测其向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化潜能后;用脂质体介导法将pcDNA3.1-hVEGF165导入MSCs,观察转染后细胞形态和生长状况,通过RT-PCR,Western blot和ELISA鉴定VEGF在MSCs中的表达情况。结果：大鼠MSCs经检测为CD44和SH3阳性,CD45和CD34阴性,可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞;经RT-PCR,Western和ELISA检测证实阳离子脂质体能成功地将hVEGF。转染至大鼠MSCs,并获得有效的表达。结论：真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165在MSCs中获有效表达。     

超声辅助VEGF165转染骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞定向分化血管内皮细胞的可行性研究。方法：采用超声辅助电穿法，将VEGF165基因的质粒PEGFP—Cl转染至骨髓间充质干细胞，转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况。结果：超声辅助转染5h后可见细胞内有GFP表达，10h后可达高峰。结论：VEGF基因转染骨髓间充质干细胞后，骨髓间充质干细胞内有GFP表达，提示细胞转染成功，骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性。     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子（VEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体，利用贴壁法分离培养MSCs后，用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率，用免疫组化、Western—Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率，转染效率与病毒感染复制数（multipcyties of infection，MOI）具有量效关系。MOI为150倍时，转染效率〉95％，转染VEGF后，MSCs可有效表达VEGF，9d时达到表达高峰（1125pg／mL），13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs，MSCs是一种理想的基因载体细胞，其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

 【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体,利用贴壁法分离培养MSCs后,用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率,用免疫组化、Western-Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率,转染效率与病毒感染复制数(multiplicyties of infection,MOI)具有量效关系。MOI为150倍时,转染效率>95%,转染VEGF后,MSCs可有效表达VEGF,9d时达到表达高峰(1125pg/mL),13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs,MSCs是一种理想的基因载体细胞,其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞研究

目的分离培养大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal stemcells,BMSCs）并进行慢病毒载体介导的基因转染研究。方法利用密度梯度离心法分离、纯化、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞。以脂质体法进行慢病毒感染大鼠BMSCs。结果分离培养出大鼠BMSCs,并用携带绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的慢病毒成功感染大鼠BMSCs。结论获得大鼠BMSCs并进行慢病毒载体介导的基因修饰,为骨髓间充质干细胞基因治疗研究奠定了基础。     

c-met慢病毒载体的构建及稳定转染骨髓间充质干细胞

构建肝细胞生长因子受体(c-met)慢病毒载体,并稳定转染骨髓间充质干细胞(BMSCs).将c-met连接到慢病毒载体GV358上,重组获得慢病毒载体GV358-c-met.再将该重组体与病毒辅助质粒共转染293T细胞,包装生产慢病毒并测定其滴度为2×108 TU/ml.将此慢病毒转染BMSCs,经嘌呤霉素筛药后,荧光显微镜下检测荧光阳性率达100%,且Western blot证实该细胞株表达c-met蛋白.成功构建了c-met慢病毒载体,并建立了稳定表达c-met的BMSCs.     

人VEGF基因腺病毒表达载体修饰大鼠骨髓间充质干细胞

目的 探讨含人血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因腺病毒表达载体Ad-VEGF转染大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的可行性.方法 采用贴壁培养筛选法富集大鼠BM-MSCs.将HEK293细胞中扩增并经效价分析后的Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs,通过对细胞转染效率、生长和活力的观察分析,以确定理想的感染复数(MOI)值.结果 本实验经HEK293细胞扩增制备的Ad-VEGF的病毒效价达8×108 pfu/ml;当MOI值为50时,Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs效率可达最高值53％;而MOI值高于50时,Ad-VEGF转染对BM-MSCs活性抑制明显.结论 成功实现Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs,其最适MOI值为50.     

VEGF165基因转染兔骨髓间充质干细胞治疗兔激素性股骨头坏死的实验研究

目的以hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞移植治疗兔激素性股骨头坏死模型,通过影像学观察、病理学及免疫组织化学检查等方法评价疗效。方法使用马血清与醋酸泼尼松龙制备兔激素性股骨头缺血性坏死动物模型后分为4组,分别进行以下治疗：A组（不作任何处理）;B组（髓心减压＋自体骨移植）;C组（髓心减压＋骨髓间充质干细胞＋自体骨移植）;D组（髓心减压＋Ad-VEGF165转染骨髓间充质干细胞＋白体骨移植）。术后3周处死行病理学、免疫组织化学检查及Western Blot检测股骨头内VEGF的表达,比较各组间的差异。结果D组在软骨下血管、VEGF阳性面积百分比、股骨头内VEGF的相对浓度均高于其他各组;在VEGF平均灰度值、空骨陷窝率低于其他各组,且各组间差异有统计学意义。结论转染了Ad—VEGF165的骨髓间充质干细胞在宿主股骨头局部可以表达VEGF蛋白,且较单纯的骨髓间充质干细胞移植表达的强度更高,对激素性股骨头坏死进行早期治疗具有确切疗效。     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞的表达

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。     

hVEGF165在自体骨髓间充质干细胞移植治疗兔缺血后肢中的表达

目的 观察hVEGF165在自体骨髓间充质干细胞移植治疗兔缺血后肢中的表达.方法 体外培养兔骨髓问充质干细胞,通过腺病毒载体转染hVEGF165基因.移植后4周内,采用RT-PCR法鉴定hVEGF165在兔缺血后肢中的表达.结果 hVEG165成功转染骨髓间充质干细胞,移植后在兔缺血后肢中有效表达.结论 hVEGF165转染干细胞后能在体内有效表达.     

人血管内皮细胞生长因子165基因真核表达载体构建

目的获得人血管内皮生长因子（hVEGF165）cDNA,构建其真核表达载体。方法采用PCR技术,从HL60细胞中扩增出hVEGF165 cDNA,将其克隆至pcDNA3真核表达载体上,构建成为pCD-hVGEF165重组质粒。结果经酶切鉴定,克隆的基因片段为人hVGEF165 cDNA;建立了pCD-hVGEF165重组质粒。结论成功地克隆和表达出了人VEGF165基因,为大量制备重组质粒的研究奠定了基础。     

转染血管内皮细胞生长因子基因的同种异体骨髓间充质干细胞移植大鼠缺血心肌的实验研究

目的 腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因（AdVEGF165）转染同种异体大鼠骨髓间充质干细胞（BM-SCs），移植到大鼠缺血心肌后，观察其对心功能的影响。方法 体外培养同种异体大鼠BMSCs，用AdVEGF165转染同种异体大鼠BMSCs，采用ELISA法检测血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达和分泌。结扎Wistar大鼠冠状动脉前降支，4周后随机将其分为4组，组Ⅰ：移植转染后的BMSCs；组Ⅱ：移植单纯BMSCs；组Ⅲ：心肌内注射AdVEGF。（基因治疗）；组Ⅳ：心肌内注射DMEM（对照组）。4周后通过超声检查观察心脏射血分数（EF）变化，评价其对心功能的影响；免疫组织化学观察移植的BMSCs在局部存活、分化情况。结果 ELISA检测提示：转染后BMSCs的培养上清液中有大量VEGF表达，较未转染组差异有极显著性意义（P〈0．01）。超声检查结果提示：组IEF改善幅度较组Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ明显（均P〈0．01）。免疫组织化学检测提示：组Ⅰ、Ⅱ中大部分移植细胞能够在移植处存活并转化为心肌细胞。结论 转染AdVEGF165的同种异体BMSCs能有效修复大鼠心肌，并能改善其心功能。     

VEGF165-tPA双基因真核表达载体的构建和体外表达

目的构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)双基因的新型真核表达载体pIRES-VEGF165-tPA,并通过转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,验证载体的体外表达情况。方法将目的基因片段VEGF165和tPA插入到真核表达载体pIRES质粒中,体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,通过实时荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测mRNA和蛋白水平的表达。结果成功构建pIRES-VEGF165-tPA双基因真核表达载体,测序结果与预期相符;荧光计数显示体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞的转染效率约为(15.6±3.1)%;实时荧光定量RT-PCR和Western blot证实转染pIRES-VEGF165-tPA质粒组细胞在mRNA和蛋白水平的表达均高于各对照组(均P<0.01)。结论成功构建pIRES-VEGF165-tPA双基因真核表达载体,并且实现其在人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞中的表达,为进一步探索其在机械瓣膜抗凝方面的作用奠定了基础。     

构建携带人/鼠IFN-γ重组腺病毒体外转染人脐带间充质干细胞的实验研究

目的 构建人/鼠干扰素（IFN-γ）的重组腺病毒,体外转染人脐带间充质干细胞（human umbilical mesenchymal stem cells, HUMSCs）,为研究IFN-γ在预防和治疗移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)中的作用提供实验依据。方法 采用PCR法从含有人/鼠IFN-γ基因的质粒中扩增出目的基因片段IFN-γ,然后定向克隆到穿梭质粒载体pDC316中,构建pDC316-IFN-γ,经酶切、PCR及测序鉴定后,再将IFN-γ定向克隆至腺病毒骨架载体,从而构建携带IFN-γ的重组腺病毒载体,并转染人胚肾细胞系293细胞,进行重组腺病毒(Ad-IFN-γ)的包装、生产和纯化;用半数组织培养感染量（50% tissue culture infective dose, TCID50）法检测重组腺病毒滴度。将Ad-IFN-γ及空病毒（Ad-null,作为载体阴性对照）分别转染HUMSCs,在荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达,采用Western blot与ELISA法鉴定IFN-γ蛋白的表达。结果 成功构建了携带IFN-γ的重组腺病毒,鼠IFN-γ（Ad-mIFN-γ）的滴度为1.0×10¹⁰ IU/mL,人IFN-γ(Ad-hIFN-γ)的滴度为1.6×10¹⁰ IU/mL, Ad-GFP的滴度为1.0×10⁹IU/mL。Ad-IFN-γ转染HUMSCs后24 h开始观察到绿色荧光,72 h时该荧光表达更强;Western blot和ELISA法均证实HUMSCs表达IFN-γ蛋白。结论 成功构建了携带人/鼠IFN-γ基因的重组腺病毒载体,并证实其可有效转染HUMSCs。     

血管内皮生长因子基因在正常造血细胞中的表达

目的　探讨正常造血细胞中血管内皮生长因子 (VEGF)基因的表达水平。方法　TRIzol一步法提取正常外周血和非恶性骨髓标本单个核细胞及正常血小板的总RNA ;以 β2 -微球蛋白基因为内对照 ,逆转录聚合酶链反应 (RT -PCR)半定量分析VEGF基因的表达。结果　 2 2份外周血标本有 18份表达VEGF基因 ,表达率为81.8% ,其中 8份为中度表达 ;18份骨髓标本VEGF基因的表达率高达 94.4% (17/ 18) ,其中高度表达和中度表达分别为 5份与 6份 ;血小板有VEGF基因的低度表达。结论　正常造血细胞可表达VEGF基因 ,提示体内血管生成受到多种效应细胞的共同调节     

血管内皮生长因子在妊娠小鼠子宫GMG细胞中的表达

目的探讨颗粒子宫腺(GMG)细胞中血管内皮生长因子(VEGF)的表达。方法取妊娠13~15 d昆明种小鼠的子宫腺细胞区,经组织块培养提纯GMG细胞,应用免疫组织化学及Western blot法显示GMG细胞中VEGF。结果组织块培养时GMG细胞生长状况好,细胞纯度高,在GMG细胞及其培养液中均有VEGF表达。结论GMG细胞表达和分泌VEGF。     

骨髓间充质干细胞联合血管内皮生长因子移植治疗糖尿病兔下肢缺血的实验研究

目的 用包裹血管内皮生长因子(VEGF)的纳米球与骨髓间充质干细胞(BMSCs)共同多点肌内注射到糖尿病兔下肢缺血部位,以期使糖尿病兔下肢缺血症状改善,缺血部位形成新的血管。方法 通过密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化BMSCs。采用超声乳化-溶剂挥发法制备包载VEGF的PLGA纳米球,并检测其各指标。按100mg/kg耳缘静脉注射四氧嘧啶制备糖尿病兔模型,14天后空腹血糖>16mmol/L确定为糖尿病模型。成模的糖尿病兔双侧下肢股动脉结扎制作下肢缺血模型,并分4组在股动脉结扎离断区进行多点注射治疗。PBS组、BMSCs组、VEGF组和BMSCs+VEGF组,同时设正常对照组。主要观察指标:治疗后各组兔子活动情况、大体解剖情况及下肢缺血区血管形成情况。结果 制备的PLGA纳米粒基本呈球形,分散较好,平均粒径为438.97±15.60nm。载VEGF的PLGA纳米粒包封率为87.4%,载药量为43.7μg/g。24h释放率55.48%。共选用28只雌兔制作糖尿病模型,死亡14只,成模12只,2只血糖没达到糖尿病模型标准。死亡率为50%,模型成功率为42.86%,不敏感率7.14%。移植后1个月发现注射PBS组的1只兔子胫骨有一1.0cm×1.5cm的溃疡,行走时呈拖行,另2只呈跛行。注射VEGF组3只兔子均呈跛行。注射MSC组有2只跛行,1只行走正常。注射BMSCs+VEGF组2只行走正常,活动自如,仅1只略呈跛行。从大体解剖结果及切片结果都可以看出移植BMSCs组、VEGF组及BMSCs+VEGF组在结扎股动脉后,可形成侧支循环,使股动脉远端保持充盈,血供良好,尤其是移植BMSCs+VEGF组形成的侧支较多。而PBS治疗组股动脉远端未见充盈,只有回流的股静脉增粗。结论 用包裹VEGF的PLGA纳米球与BMSCs共同多点肌内注射到糖尿病兔下肢缺血部位,对糖尿病兔下肢缺血区血管有促进生成作用,能改善动物模型下肢缺血的症状。     

人骨髓间充质干细胞与血管内皮细胞的基因表达差异分析

目的探索人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的分子生物学机制及调控靶标。方法应用基因表达谱芯片技术,检测人骨髓间充质干细胞和脐静脉内皮细胞的基因表达差异。结果在检测的3946条基因中,人骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞非差异表达基因占84%。差异表达基因中,间充质干细胞高表达283条,低表达344条。这些基因可以划分为5个主要的功能群:①细胞骨架和运动蛋白基因;②细胞受体相关基因;③细胞信号和传递蛋白相关基因;④发育相关基因;⑤蛋白翻译、合成相关基因。结论人骨髓间充质干细胞有潜在的内皮分化能力,分化机制和分化调控与以上五类特异基因的表达有关。     

人血管内皮生长因子-C基因的体外重组和表达

目的体外重组人血管内皮生长因子-C(VEGF-C)基因,检验其在细胞中的表达。方法以RT-PCR法从人真皮成纤维细胞中克隆VEGF-C基因功能片断的cDNA,制备pcDNA3.1( )-VEGF-C质粒载体,通过Fugene 6介导转染人成纤维细胞及COS7细胞。RT-PCR及免疫组化法检测VEGF-C基因表达情况。结果从成纤维细胞中克隆得到1 053 bp的VEGF-C基因cDNA,碱基序列与已知的人VEGF-C基因cDNA完全一致。重组pcDNA3.1( )-VEGF-C质粒所携带的目的基因VEGF-C在细胞中有强表达。结论成功重组了一个pcDNA3.1( )-人VEGF-C质粒,为进一步研究淋巴水肿的基因治疗提供了物质基础。