C6胶质瘤细胞对体外共培养大鼠神经干细胞增殖影响的初步研究

目的探索与C6胶质瘤细胞体外共培养后大鼠神经干细胞（Neural Stem Cells NSCs）的增殖变化。方法分别培养神经干细胞、星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞。利用共培养池（cell culturetranswell inserts）建立两种细胞的体外共培养模型。应用相差显微镜及电镜观察各组共培养后NSCs的形态变化;共培养后NSCs MTT法作生长曲线。结果原代培养后获得神经干细胞及星形胶质细胞;与C6胶质瘤细胞共培养7天后的NSCs增殖较对照组快,电镜观察可见核质比增高,细胞器较发达。结论 C6胶质瘤细胞对体外共培养的大鼠NSCs的增殖有一定促进作用。     

siRNA靶向抑制PDGFRB对人恶性脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用

目的应用微小RNA干涉从mRNA靶向抑制PDGFRB基因/产物对人恶性神经胶质瘤细胞T98G、U87MG增殖作用的影响。方法脂质体转染法转染PDGFRB特异性siRNA;以传统半定量RT-PCR法及实时定量PCR观察应用特异性siRNA阻断PDGFRB的表达变化;采用MTT法检测恶性脑胶质瘤细胞的体外增殖。结果siRNA(PDGFRB-HSS107758和PDGFRB-B12)可明显抑制PDGFRB的表达(抑制率70%);PDGFRB特异性siRNA可抑制恶性胶质瘤细胞的体外增殖,对U87MG细胞增殖抑制作用显著(P<0.05)。结论PDGFRB特异性siRNA可以抑制恶性脑胶质瘤细胞的体外增殖。     

辣椒素及二氢辣椒素对神经胶质瘤C6细胞和骨肉瘤ROS17/2.8细胞的抑制作用

目的 探讨辣椒素及二氢辣椒素对大鼠神经胶质瘤C6细胞、骨肉瘤ROS 17/2.8细胞的抑制作用,C6细胞凋亡率及细胞内氧自由基（ROS）的影响.方法 CCK-8法检测辣椒素及二氢辣椒素（50、100、150、200 μmol/L）对大鼠神经胶质瘤C6细胞的抑制作用;Annexin V-FITC、PI双染检测辣椒素及二氢辣椒素对C6细胞凋亡率的影响;DCFH-DA检测C6细胞内ROS水平.结果 辣椒素及二氢辣椒素显著抑制C6细胞、ROS 17/2.8细胞的增殖,且与时间和药物浓度呈正相关.辣椒素处理C6细胞12 h后,早期凋亡率明显增加,ROS水平显著提高.结论 辣椒素及二氢辣椒素对大鼠神经胶质瘤C6细胞、骨肉瘤ROS 17/2.8细胞具有显著抑制作用,其抑制C6细胞增殖机制与促进肿瘤细胞凋亡,增加ROS的产生密切相关,辣椒素及二氢辣椒素有望成为新型抗肿瘤药物.     

P16功能性短肽对C6和U251细胞增殖的抑制作用

目的：探讨P16功能性短肽对体外培养的小鼠脑胶质瘤C6细胞和人神经胶质瘤U251细胞增殖的抑制作用。方法：以不同剂量的P16功能性短肽(12.5、25.0、50.0和100.0 mg·L^-1）分别作用于小鼠脑胶质瘤C6细胞和人神经胶质瘤U251细胞24、48和72 h,同时设不加药的阴性对照组,应用MTT比色法检测细胞增殖抑制率。结果：12.5、25.0、50.0和100.0 mg·L^-1的P16功能性短肽均可抑制C6和U251细胞的增殖,其细胞增殖抑制率高于阴性对照组(P<0.01);随着剂量的增加及作用时间的延长,C6和U251细胞增殖抑制率增加。结论：P16功能性短肽能抑制小鼠脑胶质瘤C6细胞和人神经胶质瘤U251细胞的生长。     

生存素反义寡核苷酸诱导脑胶质瘤C6细胞凋亡的实验研究

n蛋白表达有明显的抑制作用(P＜0.01);以脂质体单独转染后,C6细胞凋亡水平无明显变化(P＞0.05),以SODN转染后则较多细胞发生了凋亡(与空白对照组比较,P＜0.05),而Survivin ASODN转染后C6细胞凋亡数显著增多(与其他各组比较,P＜0.01).结论 Survivin ASODN能靶向抑制Survivin蛋白的表达,从而解除其对凋亡的抑制作用,诱导胶质瘤细胞凋亡的发生,最终抑制胶质瘤细胞的生长.     

丙戊酸钠增强大鼠胶质瘤C6细胞放射敏感性的体外实验

目的 观察丙戊酸钠(VPA)对C6胶质瘤细胞系的体外放射增敏性,为治疗胶质瘤提供实验依据.方法 体外常规培养C6胶质瘤细胞,采用不同浓度(0、0.25、0.5、1、2、4 mmol/L)的VPA,作用于C6胶质瘤细胞不同时间(24、48、72 h)后,MTT法检测C6胶质瘤细胞增殖抑制率,选择合适的作用浓度和作用时间;0.5 mmol/L VPA作用C6胶质瘤细胞后,分别给予不同剂量(0、2、4、6、8Gy)的X射线,克隆形成实验观察其对C6胶质瘤细胞的放射增敏作用;流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测不同浓度VPA对C6胶质瘤细胞凋亡率的影响;实验分为对照组、药物组、照射组及联合组,实时定量PCR法检测各组凋亡基因Bcl-2及Bax mRNA的表达.结果 VPA对大鼠胶质瘤C6胶质瘤细胞具有增殖抑制作用,且呈浓度、时间依赖性,不同浓度、时间之间比较,差异有统计学意义(P＜0.05);VPA在0.5 mmol/L浓度时,对C6胶质瘤细胞毒性较低,且可增加X射线对C6胶质瘤细胞的杀伤作用,放射增敏比为1.30;VPA能够诱导C6胶质瘤细胞凋亡,并且凋亡率随浓度的增高而升高,各浓度之间比较差异有统计学意义(P＜0.05);VPA对C6胶质瘤细胞的凋亡作用,在转录水平可下调Bcl-2表达,同时上调Bax的表达.结论 VPA对大鼠胶质瘤C6胶质瘤细胞具有增殖抑制作用,且呈浓度、时间依赖性.低浓度的VPA对C6胶质瘤细胞毒性较低,但可增加X射线对C6胶质瘤细胞的杀伤作用,其放射增敏机制与直接抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、调节凋亡相关基因的表达有关.     

CD/5-FC自杀基因治疗系统体外杀伤恶性人脑胶质瘤细胞作用的研究

目的：探讨胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶（CD/5-FC）自杀基因治疗系统对恶性人脑胶质瘤细胞的杀伤作用。方法：采用Lipofectamine2000脂质体介导法将CD基因转染U251恶性人脑胶质瘤细胞,G418筛选获得抗性克隆（取名为U251/CD细胞）,使用不同浓度的5-FC作用于U251/CD细胞,MTT法测定活性细胞比率。采用高效液相色谱法（HPLC）检测5-FC培养液内5-FU的浓度。结果：U251细胞获得了质粒的成功转染。基因转染使G418抗性细胞（U251/CD细胞）对5-FC高度敏感。未转染的U251细胞对5-FC不敏感,IC50 约为6 500 μmol/L,而转染基因后 IC50 约为10 μmol/L。并且加入不同浓度的5-FC后,U251/CD细胞培养液内均能检测到5-FU。结论：5-FC对CD基因修饰U251细胞具有杀伤作用;为胶质瘤基因治疗的在体研究提供依据。     

骨髓间充质干细胞在C6脑胶质瘤细胞微环境中瘤性转化的生物学分析

目的：探讨骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs）在 C6 脑胶质瘤细胞微环境中是否发生了生物学特性的改变。方法：全骨髓贴壁筛选法分离培养 SD 大鼠 BMSCs,免疫荧光（immunofluorescence,IF）法检测BMSCs表面标志分子CD90+、CD105+、CD45-;活细胞荧光染料 CM-Dil标记 BMSCs（CM-Dil+BMSCs）,流式细胞术（flow cytome－try,FCM）检测标记效率,台盼蓝染色法连续监测 BMSCs 死亡率;CM-Dil+BMSCs与C6脑胶质瘤细胞直接接触共培养为直接共培养组,BMSCs与 C6 脑胶质瘤细胞非接触共培养为间接共培养组,阳性对照组为C6脑胶质瘤细胞单独培养,阴性对照组为 BMSCs单独培养,培养 7 d 后,IF法检测各组酸性胶质纤维蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）、CD90、CD105表达情况;FCM分选实验组CM-dil+BMSCs 和 C6 脑胶质瘤细胞,实时荧光定量聚合酶链反应（real time quantitative polymerase chain re－action,RT-qPCR）检测各组GFAP、PTEN、Bcl-xl、CyclinD1、CD90、CD105基因的表达。结果：①培养至第3代的BMSCs 90%以上表达CD90、CD105且不表达CD45;②IF结果显示直接共培养组、间接共培养组BMSCs细胞表达GFAP水平较阴性对照组 BMSCs均增高。③RT-qPCR 结果显示直接共培养组、间接共培养组BMSCs 细胞GFAP、PTEN、Bcl-xl、CyclinD1基因表达水平较阴性对照组BMSCs明显增高（P＜0.05）,且直接共培养组与间接共培养组比较无明显差异（P ＞0.05）;同时,直接共培养组、间接共培养组BMSCs的CD90、CD105基因表达水平较阴性对照组BMSCs显著降低（P＜0.05）。结论：BMSCs 在C6脑胶质瘤细胞微环境中存在潜在瘤性转化的倾向。     

PDGF-B链基因TFO抑制C6胶质瘤细胞PDGF-B链基因表达及细胞生长

目的：观察PDGF—B链基因三链形成寡核苷酸(triplex—forming oligonucleotide，TFO)对C6胶质瘤细胞PDGF—B链基因表达和细胞生长的作用。探索PDGF-B链基因TFO作为抗肿瘤治疗新药的可能性。方法：应用MTT法观察PDGF—B链基因TFO对C6胶质瘤细胞生长的抑制作用；应用流式细胞技术观察PDGF-B链基因TFO对C6胶质瘤细胞PDGF-B链基因表达的影响。结果：PDGF—B链基因TFO对C6胶质瘤细胞PDGF-B链基因的表达和细胞生长有明显抑制作用，而且抑制作用存在浓度依赖性。结论：PDGF-B链基因TFO能够抑制C6胶质瘤细胞PDGF-B链基因的表达和细胞生长，有望成为抑制PDGF—B原癌基因表达的一种全新药物。     

重组腺相关病毒载体介导血管抑素基因治疗大鼠脑胶质瘤的实验研究

目的制备大鼠脑胶质瘤模型,注射腺相关病毒血管抑素基因重组载体(AAV-AS),观察对脑胶质瘤的治疗效果。方法皮下接种C6脑胶质瘤细胞制备大鼠胶质瘤模型,皮下注射AAV-AS,24天后取材,观察瘤重、肿瘤坏死率和血管计数,RTP-CR法检测AS转录。结果AAVAS治疗组肿瘤体积明显缩小,坏死明显,血管计数减少,RT-PCR法检测到AS转录。结论AAV-AS在大鼠体内可以表达,通过抑制血管生成而抑制肿瘤生长,促进肿瘤坏死。     

Study on the migration of nerve stem cell in vitro Induced by glioma cells

Objective： Previous studies have shown that glioma cells induced the migration of nerve stem cells （NSCs） in vivo. This study was exploring whether this situation could happen in vitro. Methods： Supematant from 05 glioma cell lines or astrocytes cultured in serum-free medium growing in logarithmic phase were separately placed in lower chambers and NSCs were placed in the upper chambers of Trans-well culture system. After 36 h co-incubation, these NSCs spheres occurred on the middle membrane were counted. Results： Results demonstrated that the supematant from 05 glioma cell culture, not from the astrocytes, enhanced the migration of NSCs （ P 〈0.01）. Conclusion： Some components in 05 glioma cell culture can attract the migration of NSCs.     

C6胶质瘤细胞培养上清诱导神经干细胞迁移的初步研究

目的:观察体外培养的胶质瘤细胞在体外能否引起神经干细胞的迁移,从而为研究胶质瘤细胞中存在促进神经干细胞迁移的物质打下基础。方法:分别培养神经干细胞、星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞。以星形胶质细胞为对照,做细胞迁移实验,观察其结果;将C6胶质瘤细胞、星形胶质细胞的无血清培养上清分别浓缩,并行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,观察其结果。结果:(1)C6胶质瘤细胞的培养上清引起神经干细胞迁移的数目明显多于星形胶质细胞的培养上清和新鲜无血清培养基(P<0.01);(2)将无血清培养的等浓度的C6胶质瘤细胞、星形胶质细胞的上清浓缩蛋白电泳,可见二者蛋白条带存在明显差异。结论:(1)从新生大鼠大脑皮层组织可以培养出神经干细胞和星形胶质细胞。(2)C6胶质瘤细胞无血清培养的上清中存在着能够诱导神经干细胞迁移的物质。     

胞嘧啶脱氨酶基因修饰神经干细胞及其表达的离体实验研究

目的 探讨胞嘧啶脱氨酶(cytimidine deaminase，CD)基因修饰神经干细胞及其基因表达。方法 通过构建真核表达质粒pCMVCD，限制性内切酶消化鉴定后，采用Lipofectamine 2000脂质体介导法转染新生大鼠室管膜下区神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)，G418筛选阳性克隆，加入不同浓度的5-氟胞嘧啶(5-Flourocytosine，5-FC)，MTT比色法测定NSCs的生存率。结果 本实验成功地培养并鉴定了神经干细胞，并将CD基因成功地转染了神经干细胞，G418阳性NSCs对低浓度5-FC高度敏感。结论 CD基因修饰神经干细胞的离体实验研究为干细胞治疗研究提供依据。     

人胶质瘤自杀基因细胞系的建立及其在胶质瘤治疗研究中的应用

目的 构建CD基因工程化人脑胶质瘤细胞并在此基础上进行胶质瘤治疗研究。方法 通过In-fusion基因克隆的方法,构建携带CD基因慢病毒载体;通过293T细胞体外包装获得慢病毒,并测定病毒效价;通过慢病毒体外感染细胞获得CD基因工程化人脑胶质瘤细胞;通过流式分选获得基因稳定表达细胞;通过CCK-8评价加入5-FC前药和(或)HSV-1后细胞存活率。结果 成功构建pLVX-CD-IRES-ZsGreen1慢病毒载体并体外包装获得相应慢病毒;慢病毒感染人脑胶质瘤U87细胞后获得携带CD基因的阳性细胞,并通过体外培养30天后流式分选获得稳定阳性细胞;加入前药5-FC和(或)HSV-1后对携带CD基因的U87细胞杀伤作用明显(P<0.01),其中5-FC联合HSV-1对胶质瘤细胞作用更加高效(P<0.01)。结论 成功获得携带CD基因的人脑胶质瘤细胞;前药5-FC联合HSV-1对胶质瘤细胞具有更加高效的杀伤疗效。     

双向电泳技术分析大鼠星形细胞和C6细胞的蛋白差异

目的：建立大鼠星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的双向电泳（2-DE）技术体系,寻找星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的蛋白表达差异。方法：提取大鼠星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞中的总蛋白,进行第一向等电聚焦（IEF）和第二向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离总蛋白,GS-800获得凝胶图像,并测量不同凝胶间蛋白斑点在IEF和SDS-PAGE方向上的位置偏差,使用PDQuest7.3软件对凝胶图像进行分析,找出星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的差异表达蛋白。结果：星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的蛋白表达谱上,分别检测到523±16和550±20个蛋白点,平均匹配点数为452±18和472±21,匹配率达86.4%和85.8%,不同凝胶间蛋白质点在IEF方向的偏差为（0.67±0.48）mm,在SDS-PAGE方向上的偏差为（0.73±0.56）mm,对比分析了星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的2-DE图谱,发现有24个点发生了明显的表达变化（P〈0.01）,在星形胶质细胞中高表达的点有8个,在C6胶质瘤细胞中高表达的点有14个,星形胶质细胞中没有发现表达的点有2个。结论：建立了大鼠星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的双向电泳技术体系,发现两者的双向电泳图谱存在明显差异,C6胶质瘤细胞中表达上调以及星形胶质细胞中没有发现表达的蛋白可能与肿瘤的发生,神经干细胞的迁移有关,表达下调的蛋白可能与抑制肿瘤的发生有关。     

Pharmacokinetics and the bystander effect in CD：：UPRT/5-FC bi-gene therapy of glioma

Background Cytosine deaminase （CD） converts 5-fluorocytosine （5-FC） to 5-fluorouracil （5-FU） in CD/5-FC gene therapy, 5-FU will be mostly converted into nontoxic 13-alanine without uracil phosphoribosyltransferase （UPRT）. UPRT catalyzes the conversion of 5-FU to 5-fluorouridine monophosphate, which directly kills CD：：UPRT-expressing cells and surrounding cells via the bystander effect. But the pharmacokinetics and the bystander effect of CD：：UPRT/5-FC has not been verified in vivo and in vitro. Before the CD：：UPRT/5-FC bi-gene therapy system is used in clinical trial, it is essential to monitor the transgene expression and function in vivo. Thus, we developed a preclinical tumor model to investigate the feasibility of using ^19F-magnetic resonance spectroscopy （^19F-MRS） and optical imaging to measure non-invasive CD and UPRT expression and its bystander effect. Methods C6 and C6-CD：：UPRT cells were cultured with 5-FC. The medium, cells and their mixture were analyzed by ^19F-MRS. Rats with intracranial xenografted encephalic C6-CD：：UPRT glioma were injected intraperitoneally with 5-FC and their ^19F-MRS spectra recorded. Then the pharmacokinetics of 5-FC was proved. Mixtures of C6 and C6-CD：：UPRT cells at different ratios were cultured with 5-FC and the cytotoxic efficacy and survival rate of cells recorded. To determine the mechanism of the bystander effect, the culture media from cell comprising 25% and 75% C6-CD：：UPRT cells were examined by ^19F-MRS. A comparative study of mean was performed using analysis of variance （ANOVA）. Results ^19F-MRS on samples from C6-CD：：UPRT cells cultured with 5-FC showed three broad resonance signals corresponding to 5-FC, 5-FU and fluorinated nucleotides （F-Nuctd）. For the C6 mixture, only the 5-FC peak was detected. In vivo serial ^19F-MRS spectra showed a strong 5-FC peak and a weak 5-FU peak at 20 minutes after 5-FC injection. The 5-FU concentration reached a maximum at about 50 minutes. The F-Nuctd signal appeared after about 1 hour, reached a maximum at around 160 minutes, and was detectable for several hours. At a 10% ratio of C6-CD：：UPRT cells, the survival rate was （79.55±0.88）% （P 〈0.01）. As the C6-CD：：UPRT ratio increased, the survival rate of the cells decreased. ^19F-MRS showed that the signals for 5-FU and F-Nuctd in the culture medium increased as the ratio of C6-CD：：UPRT in the mixture increased. Conclusions ^19F-MRS studies indicated that C6-CD：：UPRT cells could effectively express CD and UPRT enzymes. The CD：：UPRT/5-FC system showed an obvious bystander effect. This study demonstrated that CD：：UPRT/5-FC gene therapy is suitable for 5-FC to F-Nuctd metabolism; and ^19F-MRS can monitor transferred CD：：UPRT gene expression and catalysis of substrates noninvasively, dynamically and quantitatively.     

Effects of Photodynamic Therapy on the Ultrastructure of Glioma Cells

Objective To study the change in ultrastructure of C6 glioma cells after photodynamic therapy(PDT),to compare morphological differences in necrosis and apoptosis before and after PDT treatment,and to evaluate the effect of photodynamic therapy on the blood brain tumor barrier(BTB)of C6 glioma.Methods The model was produced by transplanting C6 glioma cells cultured in vitro using Peterson method into the caudate nuclei of Wister rats.The experiment group received PDT for two weeks after the operation.The sub-cellular structure,blood-brain-barrier(BBB)and BTB in both groups were observed under electron microscope.Results Apoptosis in different phases and necrosis could be observed in some C6 glioma cells.Swelling occurred on the ultrastructure of cellular organs such as mitochondria and endoplasmic reticulum in most of the cells.Damage to the BTB,reduction of the number of cellular organs in endothelial cells of the capillary blood vessels,stretch of the tight junction,and enlargement of the gaps between endothelial cells were also seen in the experiment group.Meanwhile,limited impact on the normal sub-cellular structures and BBB was observed.Conclusion PDT could induce apoptosis and necrosis of C6 glioma cells due to the damage to the ultrastructure of mitochondria and endoplasmic reticulum.The weakened function of C6 glioma BTB initiated by PDT makes it possible to perform a combined therapy of PDT and chemotherapy for glioma.