腺病毒介导ｐ１６基因表达对胃癌细胞化疗敏感性的增强作用*

目的　研究ｐ１６基因对胃癌细胞化疗敏感性的作用。方法　构建携带ｐ１６基因的腺病毒感染胃癌细胞株ＳＧＣ-７９０１;Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定癌细胞ｐ１６的表达;ＭＴＴ法检测顺铂（ＤＤＰ）对癌细胞存活率的影响;动物体内实验验证ｐ１６与ＤＤＰ对癌细胞生长抑制的协同作用。结果　腺病毒感染胃癌细胞后表达ｐ１６使癌细胞对ＤＤＰ更为敏感,其中ｐ１６阳性组的细胞在ＤＤＰ浓度达到１.５ｍｇ／Ｌ时,细胞存活率降至２０％以下,而同期ｐ１６阴性组的细胞在相同ＤＤＰ浓度时存活率仅下降至６０％左右。ｐ１６腺病毒联合ＤＤＰ对裸鼠移植瘤的生长抑制明显强于单独应用ｐ１６腺病毒或ＤＤＰ。结论　胃癌细胞获得外源性ｐ１６表达对ＤＤＰ的敏感性提高,ｐ１６基因治疗联合化疗将有可能提高抗肿瘤效果。     

腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶自杀基因联合IL-2基因疗法的肿瘤治疗作用及免疫机理分析

目的以腺病毒作为载体，将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因与小鼠ＩＬ－２基因联合转移，研究其体内抗肿瘤作用及免疫机理。方法小鼠皮下接种黑色素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞后３天，肿瘤局部注射表达ＩＬ－２的重组腺病毒ＡｄＩＬ－２和表达ＣＤ的重组腺病毒ＡｄＣＤ，然后连续１０天给予５－氟胞嘧啶（５－Ｆｃ）３００ｍｇ／ｋｇ进行治疗。结果联合治疗组荷瘤小鼠皮下肿瘤结节的生长明显受到抑制，小鼠存活期明显长于ＡｄＩＬ－２、ＡｄＣＤ／５－Ｆｃ、ＡｄｌａｃＺ／５－Ｆｃ或ＰＢＳ组。经联合治疗后，小鼠脾细胞的ＮＫ活性和ＣＴＬ杀伤活性明显增强；肿瘤瘤体内ＣＤ４、ＣＤ８细胞浸润增加；肿瘤细胞表达Ｈ－２Ｋｂ和Ｂ７－１分子明显增加。结论联合应用自杀基因和ＩＬ－２基因治疗，一方面可以明显抑制荷瘤小鼠肿瘤生长，另一方面可以提高机体对肿瘤细胞免疫应答，增加机体的抗肿瘤作用，是肿瘤基因治疗中一条行之有效的途径。     

放射诱导辣根过氧化物酶/吲哚乙酸自杀基因表达对肺癌细胞系的生物效应研究

目的 检测放射诱导的肿瘤特异性嵌合启动子介导的辣根过氧化物酶/吲哚乙酸自杀基因系统对肺癌细胞A549、SPC-A1的生物效应.方法 构建含有6个CArG元件的人端粒酶逆转录酶基因嵌合启动子调控的辣根过氧化物酶表达的质粒载体,及单个端粒酶逆转录酶启动子质粒和对照质粒,分别为pE6-hTERT-HRP、phTERT-HRP、pControl-HRP、pControl-luc.分别用细胞计数法、Annexin V-FITC染色检测此嵌合启动子质粒系统对肺癌细胞A549、SPC-A1和正常人胚肺细胞(hEL)的生长抑制及凋亡效应.利用成克隆分析法检测此系统对肺癌细胞A549、SPC-A1放射敏感性的影响.结果 在6 Gy放射线诱导下质粒pE6-hTERT-HRP、phTERT-HRP、pControl-HRP、pControl-luc介导的自杀基因系统对A549细胞的平均生长抑制率分别为72.92%、40.60%、51.00%、25.19%(F=67.31,P<0.01),对SPC-A1细胞的平均抑制率分别为64.63%、30.02%、48.23%、23.16%(F=64.94,P<0.01),而对正常hEL细胞则分别为20.81%、18.05%、44.20%、18.32%(F=52.19,P<0.01).同样四种质粒对A549细胞的平均早期凋亡率分别为36.63%、22.30%、24.33%、12.53%(F=50.99,P<0.01),对SPC-A1细胞的平均早期凋亡率分别为33.73%、17.37%、22.43%、11.20%(F=20.76,P<0.01),而对正常hEL细胞则分别为13.53%、12.5%、21.93%、12.16%(F=15.08,P<0.01).同样四种质粒对A549细胞放射增敏比分别为3.45、2.29、3.05、1.21,对SPC-A1细胞的放射增敏比则分别为2.68、2.15、2.28、1.15.结论 放射诱导的肿瘤特异性嵌合启动子介导的辣根过氧化物酶/吲哚乙酸自杀基因系统对肺癌细胞A549、SPC-A1具有特异杀伤作用,具有很好的应用前景.     

A study on the treatment of gastric cancer by CD gene combined with 5-FC in vitro and in vivo

Objective: To study the killing effect of suicide gene CD on mouse gastric cancer. Methods: CD gene was transduced with the retroviral vector. The killing effect and bystander effect of CD gene on mouse gastric cancer cell line MFC were observed. The mouse gastric cancer model was used for in vivo study. The CD gene containing virus was injected into the tumors. The volumes of the tumors in every group were measured in time. Results: Significant killing effect and bystander effect were observed by CD gene in vitro, 70–80% cell death resulting from 20% of CD gene transduction. In vivo, CD/5-Fc caused tumor to diminution. Conclusion: CD/5-Fc system has significant killing effect on mouse gastric cancer Foundation item: This work was supported by the Scientific and Research Foundation of the Ministry of Public health of China(No. 98-1-312) and Shanghai Natural Scientific Foundation (No. 98ZB14028). Biography: GUO Shan-yu(1966–), doctor of medicine, attending physician, Shanghai Ninth People’s Hospital, majors in biological therapy of gastrointestinal cancer.     

重组腺病毒介导KDRP-CD/TK基因对大肠癌细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨腺病毒介导KDR启动子驱动的融合基因体系对人大肠癌细胞LOVO的增殖活性及凋亡的影响。方法以重组腺病毒AdEasy-KDR-CDglyTK体外感染表达KDR的LOVO细胞株和对照组不表达KDR的LS174T细胞株,观察该体系对LOVO细胞的杀伤效应;并以流式细胞仪检测细胞周期的变化,电镜观察细胞的病变。结果重组腺病毒对LOVO细胞及LS174T细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的递增而增加,当MOI为200时,所有细胞株均达约100％感染。以MOI为100的重组体分别感染各细胞株表现出对前药的不同敏感性：表达KDR的LOVO细胞对前药的具有较高的敏感性,与前者相比,不表达KDR的LS174T细胞对前药不敏感（P均〈0．001）。融合基因的疗效优于任一单自杀基因（P均〈0．001）。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应。流式细胞术检测表明该体系抑制LOVO细胞DNA的合成,表现为S期阻止。同时,电镜下可见LOVO有凋亡和坏死改变。结论KDR基因启动子可调控融合基因体系选择性杀伤人大肠癌LOVO细胞,其机制与细胞周期阻滞、凋亡及坏死有关。     

野生型p16基因对胃癌细胞生长的抑制作用

目的　探讨p16基因对胃癌细胞生长的抑制作用 ,为胃癌发生的分子基础和基因治疗提供理论依据。方法　采用亚克隆技术将p16克隆入真核表达载体pCI中 ,用Lipofectamine ,将p16基因转染入胃癌细胞株 ,观察p16基因的表达对胃癌细胞株生长的影响。结果　p16基因克隆入真核表达载体 ,转染胃癌细胞后 ,可抑制胃癌细胞的生长。经Dotblot和Westernblot杂交证实 ,在mRNA和蛋白质水平均有外源性p16基因的表达。结论　野生型p16基因导入p16基因功能缺失的细胞 ,能恢复其抑制癌细胞生长的功能。     

肺腺癌组织特异性自杀基因治疗实验研究

目的 探讨肺腺癌组织特异性自杀基因治疗的安全性及有效性。方法 采用病毒感染法，将癌胚抗原(CEA)基因启动子所驱动的CD基因的组织特异性逆转录病毒载体(G1CEACDNa)，导入分泌CEA的肺腺癌细胞系A549细胞．研究裸鼠体内抑瘤效果；应用重组逆转录病毒裸鼠体内治疗A549肿瘤，观察G1CEACDNa／5-氟胞嘧啶(5-FC)对A549细胞致瘤裸鼠的治疗作用及毒副反应。结果 (1)将转基因的A549细胞和未转基因的A549细胞接种至裸鼠皮下．两者成瘤性无明显差异；(2)在转基因细胞致瘤裸鼠实验中，5-FC对转CEA启动子调控自杀基因的肿瘤生长具有明显的抑制作用；(3)将G1CEACDNa重组逆转录病毒上清直接注射到裸鼠成瘤部位．然后腹腔内注射5-FC同样获得明显的抑瘤效果；(4)与直接注射5-FU相比，组织特异性自杀基因治疗对骨髓的抑制明显降低。结论 组织特异性自杀基因治疗可能成为肿瘤治疗个体化的重要方法之一。     

Efficacy of suicide gene therapy in hypoxic rat 9L glioma cells

Viral vector mediated suicide gene therapy (SGT) involving thymidine kinase (TK) or cytosine deaminase (CD) have considerable promise in the treatment of malignant brain tumors. An unresolved issue is to what extent tumor hypoxia influences the outcome of SGT since brain tumors characterized by regions of hypoxia have potentially reduced cellular metabolism and SGT's cytotoxicity is manifest through cellular metabolism. We studied in vitro and in vivo, the effect of hypoxia on the cytotoxicity of SGT in rat 9L glioma cells. Neither acute nor chronic hypoxia affected the cell killing of SGT by TK or CD. In vivo confirmation that SGT efficacy was not adversely affected by tumor hypoxia using the hypoxic cell marker pimonidazole was shown by the absence of a change in tumor hypoxia by SGT. These studies support the use of SGT utilizing either TK or CD gene strategies even when tumors are characterized by a hypoxic microenvironment.     

腺病毒介导的p27kip1cDNA对胃癌细胞增殖的影响

目的　研究 p2 7基因对人胃癌细胞SGC 790 1的抗增殖作用。方法　构建重组体腺病毒Ad p2 7kip1并转染SGC 790 1细胞 ,绘制细胞生长曲线 ,克隆形成实验 ,免疫组化检测PCNA的表达情况。 结果　成功构建Ad p2 7kip1 ,病毒滴度为 1 .2 4× 1 0 12 pfu/ml,在MOI≥ 5 0时 ,即可达到 1 0 0 %的转导效率。在SGC 790 1细胞中表达 ,能抑制其生长和集落形成 ,Ad p2 7kip1和对照组PCNA标记指数分别为 3 5 .2 %及78.6% (P <0 .0 1 )。结论　p2 7可有效抑制胃癌细胞的增殖活性 ,这为采用 p2 7kip1cDNA基因治疗胃癌奠定了基础。     

腺病毒介导的p27kip1cDNA对胃癌细胞增殖的影响

 目的　研究 p2 7基因对人胃癌细胞SGC 790 1的抗增殖作用。方法　构建重组体腺病毒Ad p2 7kip1并转染SGC 790 1细胞 ,绘制细胞生长曲线 ,克隆形成实验 ,免疫组化检测PCNA的表达情况。 结果　成功构建Ad p2 7kip1 ,病毒滴度为 1 .2 4× 1 0 12 pfu/ml,在MOI≥ 5 0时 ,即可达到 1 0 0 %的转导效率。在SGC 790 1细胞中表达 ,能抑制其生长和集落形成 ,Ad p2 7kip1和对照组PCNA标记指数分别为 3 5 .2 %及78.6% (P <0 .0 1 )。结论　p2 7可有效抑制胃癌细胞的增殖活性 ,这为采用 p2 7kip1cDNA基因治疗胃癌奠定了基础。     

RETROVIRAL-MEDIATED SUICIDE GENE THERAPY OF EXPERIMENTAL GLIOMA

Ｍａｌｉｇｎａｎｔｇｌｉｏｍａ，ｔｈｅｍｏｓｔｃｏｍｍｏｎｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌｔｕｍｏｒ，ｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｌｅｔｈａｌｃａｎｃｅｒｓｉｎｈｕｍａｎ．Ｔｈｅｍｅｄｉａｎｓｕｒｖｉｖａｌｔｉｍｅａｆｔｅｒｄｉａｇｎｏｓｉｓｉｓｌｅｓｔｈａ...     

Survivin基因反义寡核苷酸增强胃癌细胞对顺铂的敏感性研究

目的探讨survivin基因的反义寡核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)对胃癌细胞系(SGC7901)下调化疗药物的耐药性的研究.方法采用survivin基因反义ODN及其对照序列(空白对照和错配ODN)通过脂质体途径分别转染SGC7901细胞.经转染的各组SGC7901细胞分别采用蛋白印迹法观察survivin基因的表达、通过MTT法检测顺铂对癌细胞的毒性作用以及流式细胞仪(FCM)观察顺铂(CDDP)诱导各组SGC7901细胞的凋亡.结果经转染反义ODN之胃癌细胞出现survivin蛋白表达明显下降,反义ODN伴CDDP联合作用的细胞抑制率达49.9±2.1%,而单独应用CDDP或错配ODN联合CDDP的细胞抑制率分别为30.7±2.9%及34.8±3.4%,两者间呈明显差异(P＜0.01).细胞流式仪分析显示对照组、survivin反义ODN组、survivin错配ODN组的细胞凋亡率分别为8.1±0.9%、15.2±0.7%、8.5±0.8%,反义ODN组细胞凋亡率明显高于对照组、错配ODN组(P＜0.01).结论Survivin基因反义ODN能增强胃癌细胞株SGC7901对顺铂的敏感性,为临床提供一种增强化疗敏感性研究的途径.     

Novel therapy for advanced gastric cancer

Gastric cancer (GC) is a common lethal malignancy. Gastroesophageal junction and gastric cardia tumors are the fastest rising malignancies due to increasing prevalence of obesity and acid reflex in the United States. Traditional chemotherapy remains the main treatment with trastuzumab targeting human epidermal growth factor receptor 2 positive disease. The median overall survival (OS) is less than one year for advanced GC patients; thus, there is an urgent unmet need to develop novel therapy for GC. Although multiple targeted agents were studied, only the vascular endothelial growth factor receptor inhibitor ramucirumab was approved recently by the United States Food and Drug Administration because of its 1.4 mo OS benefit (5.2 mo vs 3.8 mo, P = 0.047) as a single agent; 2.2 mo improvement of survival (9.6 mo vs 7.4 mo, P = 0.017) when combined with paclitaxel in previously treated advanced GC patients. It is the first single agent approved for previously treated GC and the second biologic agent after trastuzumab. Even with limited success, targeted therapy may be improved by developing new biomarkers. Immune therapy is changing the paradigm of cancer treatment and is presently under active investigation for GC in clinical trials. More evidence supports GC stem cells existence and early stage studies are looking for its potential therapeutic possibilities.     

pGL3-hTERT-tk/GCV对胃癌细胞的促凋亡作用

目的:探讨重组质粒pGL3hTERTtk/GCV对胃癌细胞的促调亡作用。方法：以基因工程方法构建重组质粒pGL3hTERTtk和相应的荧光报告质粒pGL3hTERTtkLuc+;脂质体LipofectamineTM2000瞬时转染胃癌细胞系SGC7901并用GCV干预,荧光显微镜观察细胞形态变化和转染效率,TUNEL标记和流式细胞术观察转染后胃癌细胞的凋亡;以上实验均以正常肝细胞L02为对照。结果：经鉴定,重组质粒pGL3hTERTtk中tk片段的长度为1 100 bp。荧光素酶标记的阳性、阴性对照及治疗报告质粒pGL3hTERTtkLuc+均能有效转染高表达端粒酶活性的胃癌细胞SGC7901,转染效率为(8.2±114)%。重组质粒转染胃癌细胞后与GCV共育4 d,细胞的凋亡率为(60.0±1.56)%;被pGL3hTERTtk转染的肿瘤细胞细胞周期发生了变化,处于细胞周期早期的细胞大量凋亡,早期凋亡率为（47.1±1.35）%。〖HT5W〗结论：〖HT5"SS〗pGL3hTERTtk/GCV对胃癌细胞有强烈的杀伤作用,但不影响正常细胞的生长,有潜在临床应用前景。     

肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体的构建及其活性表达

目的：克隆AFP启动子和p16基因全长cDNA,构建在肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体,研究p16基因表达对肝癌细胞的影响。方法：采用分子生物学技术手段,克隆AFP启动子和p16基因全长cDNA,将其插入腺病毒载体质粒中,并在293细胞中重组出携带p16基因的腺病毒AdAFP-p16。Western Blot检测p16基因在肝癌细胞中的特异性表达。细胞病变效应（CPE）观察p16基因表达对肝癌细胞生长的抑制作用。结果：AdAFP-p16能够介导p16基因在肝癌细胞中特异性表达,而对正常细胞中p16的表达没有影响;p16基因表达能够特异性抑制肝癌细胞的生长。结论：采用AFP启动子可以实现p16基因的肝癌细胞中定向而特异性表达,提高基因表达产物在肿瘤局部的浓度,有利于提高治疗效果。     

ADENOVIRUS-MEDIATED WILD-TYPE P53 EXPRESSION SUPPRESSES GROWTH OF LUNG ADENOCARCINOMA CELLS

ＷｉｌｄｔｙｐｅＰ５３ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｓｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｔｕｍｏｒｃｅｌｓ，ａｎｄｉｓｔｈｅｒｅｆｏｒｅｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄａｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｏｒｇｅｎｅ．１ＭｕｔａｔｉｏｎｓｏｆＰ５３ｇｅｎｅａｒｅｒｅｐｏｒｔｅ...     

生存蛋白Survivin在人胃癌组织中的表达

目的 :探讨生存蛋白Survivin在胃癌组织中的表达 ,进一步研究化疗前后Sur vivinmRNA表达的差异。方法 :用RT PCR法研究体外培养的胃癌细胞株及人胃癌组织化疗前后SurvivinmRNA表达的变化 ,采用Western blot检测Survivin蛋白的表达。结果 :体外培养的胃癌细胞株化疗药物处理前SurvivinmRNA的表达率为 2 5 % ,接受化疗的细胞株表达率为 70 % ;术前接受化疗的胃癌患者SurvivinmRNA表达率为 60 % ,术前未接受化疗的表达率为 3 5 % ,差异显着。正常胃黏膜细胞未检测到SurvivinmRNA表达。Western blot检测Survivin蛋白的表达具有相同的结果。结论 :Survivin在胃癌细胞中高表达并且接受化疗后Survivin表达率增高 ,提示Survivin表达可能与肿瘤化疗耐受有关     

多聚乙烯基亚胺介导的卵巢特异性启动子调控下的自杀基因抑制卵巢癌细胞生长的体外研究

背景与目的目前基因治疗领域的关键技术问题是如何提高基因载体的转导效率和靶向性。近年来以一种新的多聚阳离子化合物—多聚乙烯基亚胺(polyethylenimine,PEI)作为载体为基因转移提供了一条有效的新思路。本研究应用PEI介导卵巢特异性启动子OSP-1调控下的自杀基因HSV-tk体外处理人卵巢癌细胞SKOV3,观察其抗瘤效应和靶向性。方法(1)将pGL3-Luc质粒分别介导多聚乙烯基亚胺PEI、脂质体DOTAP和裸DNA转染人卵巢癌细胞SKOV3,检测荧光素酶表达RLU(relativeluciferaseunit);(2)利用PEI将卵巢特异性启动子调控下的真核表达质粒pOSP1-HSVtk导入人卵巢癌细胞SKOV3、人肝癌细胞SMMC7721,应用MTT法测定更昔洛韦(ganciclovir,GCV)对两种肿瘤细胞的毒性;高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)检测GCV在SKOV3的细胞内代谢;流式细胞仪和末端脱氧核苷酸转移酶原位标记(TdT-mediateddUTPnickendlabeling,TUNEL)检测肿瘤细胞的凋亡。结果(1)PEI组的荧光素酶表达活性最高(187.35±6.48),与另两组相比(45.74±5.98,0.03±0.00),有显著性差异(P<0.01);(2)GCV对SKOV3细胞呈现明显的细胞毒性,对SMMC7721细胞没有产生细胞毒性;HPLC检测显示随着作用时间的延长,细胞内GCV水平逐渐下降;流式细胞仪显示转染pOSP1-HSVtk质粒的SKOV3细胞经GCV作用24、48、72h后,凋亡率分别为(8.42±0.76)%、(18.50±1.78)%、(34.80±3.46)%,呈明显的增高趋势;TUNEL检测SKOV3细胞可见大量凋亡细胞。结论多聚乙烯基亚胺介导卵巢特异性启动子调控下的自杀基因对卵巢癌有特异的体外杀伤作用,有助于提高基因治疗的有效性和靶向性。