Max二聚化蛋白1（Mad1）真核表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的：构建Max二聚化蛋白1 (Max dimerization protein 1,Mad1) 的真核表达载体,研究Mad1对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法：利用DNA重组技术将Mad1基因克隆至pEGFP-N1载体,构建成pEGFP-N1-Mad1重组真核表达载体。经酶切和测序鉴定后,采用脂质体转染技术将重组质粒瞬时转染人胃癌AGS细胞, RT-PCR及Western blot检测Mad1基因和蛋白的表达。荧光显微镜观察Mad1在AGS细胞内的定位情况。CCK-8和Transwell实验研究Mad1对胃癌AGS细胞增殖和迁移能力的影响。结果：成功构建携带Mad1基因的真核表达载体pEGFP-N1-Mad1。将重组质粒瞬时转染AGS细胞后,RT-PCR和Western blot检测到Mad1 基因和蛋白的表达。Mad1基因表达产物定位于AGS细胞核中。CCK-8和Transwell实验结果显示,转染Mad1的AGS细胞与转染空载体的AGS细胞、及正常AGS细胞相比,细胞增殖活力和迁移能力明显降低。 结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Mad1,研究表明Mad1可以抑制胃癌AGS细胞的增殖和迁移。     

抑制核小体结合蛋白1基因对人前列腺癌细胞LNCaP增殖的作用

目的利用RNA干扰（RNAi）技术,探讨核小体结合蛋白1（NSBP1）基因对人激素依赖前列腺癌细胞系LNCaP增殖的作用。方法设计并合成针对NSBP1的4种小分子干扰RNA（siRNA）（包含1种阴性对照）,构建能抑制NSBP1 mRNA表达的重组pSilencer 2．1-U6 neo质粒,转染LNCaP细胞。应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、Western印迹实验检测不同质粒对NSBP1表达的抑制效率,选取抑制效率最高的质粒转染LNCaP细胞,用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定细胞增殖活性,用流式细胞光度术检测细胞周期的变化。结果筛选出抑制效率最高的质粒pSilencer-81（mRNA水平抑制80％,蛋白水平抑制85％）,与阴性对照pSilencer-Neg质粒分别转染LNCaP细胞。转染60h后,经过84h、108h,一直到132h,LNCaP／81细胞A值（代表细胞活性）低于LNCaP／Neg细胞A值,差异均有统计学意义（t=4．501,4．282,5．229,4．759,均P〈0．05）。抑制率随时间延长而增加,在84h有所降低,在108h达最大值30．2％。转染60h后,经过84h,一直到108h,LNCaP／81细胞的G2M＋S期细胞百分率较LNCaP／Neg细胞的降低,差异均有统计学意义（t=3．705,3．887,8．220,均P〈0．05）。结论针对NSBP1的siRNA通过抑制前列腺癌LNCaP细胞中NSBP1基因的表达,能明显抑制细胞的增殖,NSBP1可能参与前列腺癌细胞生长增殖过程。     

硒结合蛋白1作为肿瘤标志物的研究进展

硒结合蛋白1（SBP1）共价结合于硒参与多种细胞内硒的转运。然而硒是一种重要的微量元素,与肿瘤的发生有密切联系,是一种新型抗肿瘤物质。近年来随着对SBP1研究的深入,发现其不但可作为预后指导个性化治疗策略的一种新型生物标志物,而且有望成为肿瘤治疗的新靶点并提高肿瘤细胞的化疗敏感性,作为一种新型抗肿瘤治疗策略应用于临床。该文旨在探讨SBP1的抗肿瘤机制及其作为潜在肿瘤标志物的研究进展,以期指导临床肿瘤个性化治疗,提高患者的预后效果。     

透明质酸结合蛋白诱发肿瘤细胞凋亡的实验研究

目的探讨人脑透明质酸结合蛋白(hbHABP)对人肿瘤细胞凋亡的影响。方法将hbHABP全长cDNA转染到人乳腺癌细胞(MDA435)和前列腺癌细胞(TSU)中,采用Western blot检测细胞caspase-3、CD95表达的变化,并采用酶联免疫吸附试验试剂盒测定细胞裂解液中Bcl-2、Cip／WAFI的含量。再将转hbHABP基因的MDA435细胞种植到鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)上,使MDA435肿瘤细胞在体内环境中生长成瘤,取肿瘤块作病理切片,采用caspase-3抗体作免疫组织化学染色。结果MDA435和TSU细胞转染hbHABP基因后,caspase-3和CD95表达均增高;MDA435-hbHABP细胞裂解液中Bcl-2含量下降,TSU-hbHABP的Bcl-2无明显变化。TSU-hbHABP细胞Cipl／wAFl的含量升高,MDA435-hbHABP无变化。免疫组织化学结果显示,MDA435-hbHABP肿瘤组织内caspase-3表达均增高。结论hbHABP可能诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制肿瘤生长。     

食管癌中高表达的钙结合蛋白1基因的序列分析及意义

目的:筛选食管癌中差异表达的基因,为进一步了解食管癌发生的分子机制奠定基础.方法: 利用荧光差异显示技术(DD-PCR)获得差异片段,对这些片段进行克隆和序列分析.通过在GenBank中同源性检索,查找差异片段相对应的同源基因.利用定量PCR检测验证该基因表达的差异性,并对该基因的结构进行预测和分析.结果:通过DD-PCR得到差异片段中的一个片段对应于人类钙结合蛋白1基因(Cabin1).荧光定量PCR技术检测结果表明钙结合蛋白1基因在食管癌组织中的表达量高于其对应的癌旁组织,在食管癌细胞株TE1中的表达量高于其他被测试的5种肿瘤细胞株.生物软件分析表明:该基因的读码框长6 663bp,编码2 220个氨基酸,至少有4种剪切方式.结论:Cabin1在食管癌组织及食管癌细胞中异常表达,可能在食管癌发生过程中起着重要的作用.     

阻断Kupffer细胞IRE1-XBP1通路对大鼠肝移植排斥反应的影响

目的 探讨阻断Kupffer细胞IRE-XBP1通路对大鼠原位肝移植排斥反应的作用.方法 术前用GdCl3处理或未处理建立大鼠原位肝移植急性排斥反应模型,未处理大鼠随机数字法分为XBP1-shRNA组(A组),Scrambled-shRNA组(B组),PBS组(C组);处理大鼠随机分为GdCl3+XBP1-shRNA组(D组),GdCl3+Scrambled-shRNA组(E组),GdCl3+PBS组(F组).未处理组术后检测血清ALT、AST、IFN-γ、IL-10、IL-17的表达水平;RT-PCR检测T-bet、RORγt、IFN-γ、IL-17及IL-10mRNA水平;Western blot检测CD86、CD206、IFN-γ、IL-17及IL-10蛋白表达水平,HE染色观察肝组织结构,根据Banff方案进行RAI评分,各组剩余大鼠观察术后生存率.处理组术后检测IFN-γ、IL-17及IL-10 mRNA以及蛋白表达水平,HE染色观察肝组织结构.结果 在未处理组中,与B、C组比较,A组各时间点肝功能指标ALT、AST明显下降(P＜0.05),A组血清表达IFN-γ、IL-10明显受到抑制(P＜0.05),IL-10的表达水平则呈明显上升趋势(P＜0.05),与RT-PCR和Western blot结果趋势相符合,另外A组CD86蛋白表明显下降(P＜0.05),而表达CD206上升(P＜0.05),T-bet/RORγt mRNA相对表达量也明显下降(P＜0.05),B、C组上述指标与A组对比则呈相反趋势,而且B、C组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05);A组RAI评分(3.83 ±0.14),明显低于B、C组RAI评分(9.13±0.20)、(8.95±0.26) (P ＜0.05),并且A组大鼠的生存时间明显高于B、C组大鼠(P＜0.05).在处理组中,D、E和F组肝脏局部IFN-γ、IL-17、IL-10 mRNA和蛋白表达情况以及病理组织AcR程度比较无统计学上的差异(P＞0.05).结论 阻断IRE1-XBP1通路促进了KCs的M1型极化,引起Th1/Th17向Th2/Treg的免疫偏移,在一定程度上减轻了移植肝脏急性排斥反应的程度.     

透明质酸结合蛋白对肿瘤细胞表达 cyclin E及p27kip1的影响

目的：研究透明质酸结合蛋白（HABP）对人乳腺癌、前列腺癌细胞和牛血管内皮细胞cyclinE及p27^kip1表达的影响。方法：将人脑透明质酸结合蛋白（hbHABP）全长cDNA转染到人乳腺癌细胞（MDA435）和前列腺癌细胞（TSU）中，研究细胞周期蛋白cyclinE及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物p27^kip1表达的变化。再将这些转基因细胞的培养上清液（CM）加入牛主动脉血管内皮细胞（ABAE）的培养上清液中，观察CM对ABAE的p27^kip1表达的影响。结果：MDA435和TSU细胞转染hbHABP基因后，cyclinE的表达水平均明显低于对照组细胞，而p27^kip1的表达水平均升高。ABAE细胞受CM作用后，p27^kip1的表达水平也高于对照组细胞。结论：hbHABP可能具有下调肿瘤细胞周期蛋白cyclinE和上调细胞周期蛋白依赖性激酶 抑制物p27^kip1的作用，从而抑制肿瘤细胞的生长；同时，hbHABP促进血管内皮细胞p27^kip1的表达，可以抑制肿瘤新生血管的形成。     

核糖体结合蛋白在甲状腺癌中的表达及其与临床病理特征的关系

目的:探讨核糖体结合蛋白1(RRBP1)在甲状腺癌组织中的表达及其表达与临床病理特征的关系。方法:采用免疫组织化学方法检测RRBP1在86例甲状腺癌和15例癌旁正常组织中的表达,并分析其表达与临床病理特征的关系。结果:RRBP1在甲状腺癌及癌旁正常组织中表达的阳性率分别为77.9%和20.0%,差异有统计学意义(P<0.01)。甲状腺癌组织中RRBP1表达在肿瘤直径≥2 cm、TNM分期Ⅲ~Ⅳ期及淋巴结转移患者中的表达均明显高于肿瘤直径< 2 cm、TNM分期Ⅰ~Ⅱ期及无淋巴结转移患者(P<0.05),而在患者不同年龄、性别、吸烟史及肿瘤好发部位间的表达阳性率差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:RRBP1可作为甲状腺癌发生相关的新型分子标志物,其表达与患者的临床病理特征相关。     

肝脏脂肪酸结合蛋白抗氧化作用研究进展

肝脏脂肪酸结合蛋白属于脂肪酸结合蛋白家族,蛋白结构中包含7个甲硫氨酸和一个半胱氨酸,对多不饱和脂肪酸和脂质过氧化代谢产物有很高的亲和力,参与调节脂肪酸在细胞内氧化和高活性代谢产物的清除,是机体内有效的抗氧化剂.肝脏脂肪酸结合蛋白作为内源性抗氧化剂在缺氧性疾病中发挥了重要作用.     

一个新的高保守自身免疫反应相关分子IRF-4结合蛋白多克隆抗体制备

目的 获得一个新的高保守自身免疫反应相关分子IRF-4结合蛋白(IRF-4-binding protein,IBP)的高效价特异性多克隆抗体.方法 通过生物信息学分析选择IBP特异片段(1228～1893 bp),目的 片段cDNA插入pET32a和pGEX-KG原核表达载体,分别转化B1221感受态细菌,IPTG诱导表达后组合应用阴离子交换层析、His、GST亲和层析技术获得免疫原(pET32a/IBP融合蛋白)及检测原(pGEX-KG/IBP融合蛋白).HPLC鉴定纯度.利用改良快速免疫法获得兔抗IBP多克隆抗血清,井经蛋白A柱纯化,非特异性扰体吸收.间接ELISA检测抗体滴度、Western blot和免疫组化实验检测抗体特异性.结果 表达并纯化的pET32a/IBP融合蛋白纯度达92%,pGEX-KG/IBP融合蛋门纯度达87%.IBP多克隆抗体滴度达1:51 200,能特异地和内源性IBP结合.结论 成功表达并纯化了 IBP融合蛋白,制备了高滴度、高特异性的抗IBP多克隆抗体.     

人肝脏F蛋白放射免疫分析方法的建立及其临床意义

目的建立人血清肝脏F蛋白的放射免疫分析方法(RIA),初步探讨其在肝脏疾病中的临床意义。方法通过低温超速离心、层析分离等电聚焦方法,纯化人肝脏F蛋白并保留了原有的免疫活性;用常规方法免疫兔子,得到多克隆抗体;纯化的F蛋白用Iodogen法125I标记;建立放免药盒。测定116例正常人和167例不同疾病患者的血清F蛋白浓度。结果抗血清亲和常数Ka值为1.33×1010L/mol,F蛋白的标记率为34.8%,放化纯度为92.0%,比活度为3548GBq/g,标准曲线ED50为(22.39±4.15)μg/L,非特异性结合率(NSB)<5.0%,灵敏度为1.26μg/L;批内CV为4.1%,批间CV为8.5%;回收率为(98.77±2.87)%,工作范围为0～80μg/L,正常人血清中F蛋白水平浓度为(14.52±4.15)μg/L,肝细胞损伤时血清F蛋白水平显著升高(P<0.01)。阳性检出率原发性肝癌85.4%、急性肝炎89.2%、酒精性肝炎79.6%、肝硬化64.5%。结论该方法可测范围广、灵敏度高、特异性强、重复性好、非特异性结合率低。当肝细胞损伤时,血清F蛋白浓度明显升高,因此,RIA测定血清F蛋白极有可能成为一种反映肝细胞损伤程度的灵敏的和特异的新指标。     

胰岛素样生长因子结合蛋白7基因在胃癌细胞中的表达及甲基化调控

目的 研究胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP7）mRNA在胃癌细胞中的表达及其甲基化调控。方法 分别培养胃癌细胞株高分化MKN-28、中分化SGC-7901和AGS、低分化MKN-45以及胃黏膜正常上皮细胞（GES-1）。提取细胞RNA,采用RT-PCR法检测IGFBP7 mRNA在各细胞株中的表达。提取细胞基因组DNA,甲基化修饰后采用甲基特异性PCR（MSP）分析其CpG岛甲基化状态。采用不同浓度去甲基化药物5'-杂氮-2'-脱氧胞嘧啶（5-aza-dc）处理细胞株后,经Real-time PCR定量药物处理前后各细胞株IGFBP7 mRNA的相对表达量。结果 各肿瘤细胞株中IGFBP7 mRNA表达较GES-1降低或消失。MSP检测IGFBP7 mRNA表达降低和消失的细胞株均有CpG岛不同程度的甲基化。不同浓度5-aza-dc处理细胞后,IGFBP7 mRNA的表达量呈剂量依赖性增高。结论 IGFBP7 mRNA在胃癌细胞株中低表达或不表达,其表达下调与其CpG岛甲基化有关。5-aza-dc可使IGFBP7 mRNA表达降低的胃癌细胞株重新表达IGFBP7 mRNA,提示IGFBP7基因CpG岛甲基化可能是IGFBP7在胃癌细胞系中表达缺失的分子机制。     

RIP1在肝癌组织中的表达意义及其对细胞侵袭、迁移的影响

探讨受体相互作用蛋白激酶-1(RIP1)在肝癌组织及癌旁组织中的表达情况,并探索其对肝癌细胞侵袭和迁移的分子调控机制。收集肝癌和癌旁组织,免疫组化检测RIP1蛋白的表达,筛选高表达RIP1的肝癌细胞系。对肝癌细胞系进行RIP1沉默处理并设置阴性对照。采用western blot及RT-PCR法检测RIP1的表达量;Tranwell观察细胞侵袭能力;细胞划痕观察细胞迁移能力。结果显示, 48例肝癌组织中,22例存在RIP1蛋白阳性表达,阳性率为45.83%,其中,强阳性患者为15例,中等及弱阳性7例,该研究中有6例复发患者。RIP1在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P＜0.05),高表达RIP1患者的总生存率和无复发生存率显著低于低表达RIP1的患者(均P＜0.05)。抑制RIP1基因后其相对表达量、细胞侵袭、迁移能力均下降(P＜0.05)。RIP1在肝癌中存在高表达,可能参与肝癌细胞侵袭与迁移过程。     

转录因子碳水化合物反应元件结合蛋白对肝脏糖脂代谢的调节作用

肝脏是体内糖脂代谢的重要器官,转录因子碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)是调节肝脏糖酵解及脂肪合成的重要转录因子。ChREBP与Max样蛋白X以异二聚体的形式调控葡萄糖利用及转化为脂肪过程中大量基因的表达。在ob/ob小鼠肝细胞特异性敲除ChREBP基因后能明显改善其脂肪肝及胰岛素抵抗。阐明ChREBP对糖脂代谢的调控机制及其生物学功能,可进一步解释葡萄糖诱导脂肪形成的过程,并有望为脂肪肝等代谢性疾病的干预治疗提供新的思路。本文对ChREBP的结构特征、调控机制、生物学功能及其与疾病的关系等最新进展进行综述。     

CCAAT/增强子结合蛋白α抑制人肝癌细胞内的肝刺激因子表达

目的 探讨CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα)对人肝癌细胞内肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)表达的影响及其在表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)抑制HSS表达过程中的作用.方法 采用凝胶迁移电泳实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)研究C/EBPα与HSS启动子的体外相互作用,real-time PCR和Western blotting的方法测定hHSS mRNA和蛋白质表达情况.结果 EMSA实验证实C/EBPα可以与hHSS启动子-343/-330区域内的C/EBPα结合位点结合,对hHSS表达具有负性调节作用,C/EBPα siRNA转染入HepG2细胞后,hHSS mRNA和蛋白质表达均升高.但C/EBPα表达下降并不影响EGF对hHSS表达,而EGF不改变C/EBPα的活性和表达.结论 C/EBPα可通过C/EBP位点抑制hHSS的表达,但不参与EGF对hHSS的转录调节过程.     

胰岛素样生长因子结合蛋白7基因在胃癌细胞中的表达及甲基化调控

目的 研究胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)mRNA在胃癌细胞中的表达及其甲基化调控.方法 分别培养胃癌细胞株高分化MKN-28、中分化SGC-7901和AGS、低分化MKN- 45以及胃黏膜正常上皮细胞(GES-1).提取细胞RNA,采用RT-PCR法检测IGFBP7 mRNA在各细胞株中的表达.提取细胞基因组DNA,甲基化修饰后采用甲基特异性PCR(MSP)分析其CpG岛甲基化状态.采用不同浓度去甲基化药物5'-杂氮-2'-脱氧胞嘧啶(5-aza-dc)处理细胞株后,经Real-time PCR定量药物处理前后各细胞株IGFBP7 mRNA的相对表达量.结果 各肿瘤细胞株中IGFBP7 mRNA表达较GES-1降低或消失.MSP检测IGFBP7 mRNA表达降低和消失的细胞株均有CpG岛不同程度的甲基化.不同浓度5-aza-dc处理细胞后,IGFBP7 mRNA的表达量呈剂量依赖性增高.结论 IGFBP7 mRNA在胃癌细胞株中低表达或不表达,其表达下调与其CpG岛甲基化有关.5-aza-dc可使IGFBP7 mRNA表达降低的胃癌细胞株重新表达IGFBP7 mRNA,提示IGFBP7基因CpG岛甲基化可能是IGFBP7在胃癌细胞系中表达缺失的分子机制.     

灵芝对肝癌干细胞糖代谢和标志物蛋白的影响

目的:探讨灵芝对人肝癌干细胞糖代谢及标志物CD133蛋白的影响。方法:培养人肝癌SMMC7721细胞并用灵芝L08处理,用MTT法测定细胞的成活率,用试剂盒法测定己糖激酶活性,用Western Blot法测定CD133蛋白的水平。结果:灵芝L08处理人肝癌SMMC7721细胞后,细胞的成活率及己糖激酶活性都有所降低。同时,肝癌干细胞的CD133蛋白水平也降低。结论:灵芝L08能抑制人肝癌细胞的增殖、细胞中己糖激酶的活性和CD133蛋白水平。     

SATB1和COX-2在胃癌中的表达及其临床意义

目的探讨特异AT序列结合蛋白1（SATB1）及环氧化酶-2（COX-2）在胃癌组织中的表达及其临床意义。方法采用免疫组化方法检测30例胃癌组织及30例癌旁组织中SATB1、COX-2的表达。结果SATB1、COX-2在胃癌组织中的阳性表达率为66．67％和46．67％,癌旁组织中的阳性表达率为0和10％,2种蛋白在癌组织中的阳性表达显著高于癌旁组织（P〈0．05）;胃癌组织中SATB1、COX-2的表达与肿瘤浸润深度、TNM分期及是否淋巴结转移有关（P〈0．05）,2种蛋白的表达均与患者性别、年龄、肿瘤分化程度无关（P〉0．05）。胃癌组织中SATB1与COX-2的表达呈正相关（r=0．52,P〈0．05）。结论SATB1和COX-2基因的表达与胃癌的发生和转移有关,二者具有协同作用。联合检测SATB1和COX-2蛋白的表达,有利于评估胃癌的生物学行为。     

重组腺病毒ADV-TK基因的构建及其对肝癌细胞的杀伤作用

目的 探讨含胸苷激酶(TK)自杀基因的重组腺病毒(ADV-TK)对肝癌细胞的杀伤作用.方法 采用细胞内同源重组法构建出携带TK基因的ADV-TK,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定,将ADV-TK感染人肝癌细胞株SMMC-7721,MTT法检测受感染的SMMC-7721细胞被不同浓度GCV作用后的细胞存活率情况.结果 构建的重组腺病毒中带有TK基因,用相同滴度的重组腺病毒和不同浓度的GCV作用于肝癌细胞株SMMC-7721后.MTT法检测到细胞的存活率随着GCV浓度的增加而不断降低.结论 本实验构建的携带TK基因的复制缺陷型腺病毒对肝癌细胞具有明显的杀伤作用.     

钙离子结合蛋白S100A16对胃癌细胞生物学行为的影响

目的：探讨钙结合蛋白S100A16在胃癌组织和细胞中的表达,及其对胃癌细胞SGC?7901增殖、迁移、侵袭能力的影响。方法：应用免疫组织化学染色法检测S100A16在胃癌和相应癌旁组织中的差异表达。应用Western blot检测正常胃上皮细胞GES?1以及胃癌细胞MGC?803和SGC?7901中S100A16的表达水平。将S100A16高表达质粒和干扰质粒分别转染至人胃癌细胞株SGC?7901中,用Western blot检测各组细胞中S100A16的表达。采用磺酰罗丹明B（sulforhodamine B,SRB）比色法和克隆形成实验检测细胞的增殖能力。采用划痕实验检测细胞迁移能力,采用Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果：在胃癌组织及胃癌细胞中,S100A16的表达量明显高于相应癌旁组织及正常胃上皮细胞。SRB染色和克隆形成实验显示,过表达S100A16会增加SGC?7901细胞的增殖能力,敲低S100A16后增殖能力降低。划痕实验Transwell实验显示,过表达S100A16会增加SGC?7901细胞的迁移和侵袭能力,敲低S100A16则会降低。免疫共沉淀实验显示在胃癌细胞SGC?7901中,S100A16与YBX?1存在结合。结论：胃癌组织及细胞中S100A16的表达明显上调,S100A16在胃癌中的异常表达可能是由于与YBX?1的相互结合,进而促进胃癌细胞增殖、迁移、侵袭从而影响胃癌的发生发展。