人脐血和外周血内皮祖细胞的分离培养和鉴定

背景：国内外有关内皮祖细胞的分离培养和鉴定方面的文章很多,但是人脐血和外周血内皮祖细胞的鉴别方面文章不多。 目的：从人脐血和外周血中分离出内皮祖细胞,并对其进行培养和鉴定。 方法：选取密度梯度离心法从脐血和外周血中分离获得单个核细胞,按照1× 10⁶/cm²的浓度种植于预先铺有纤维连接蛋白的培养板中,用含血管内皮生长因子的M199培养基进行诱导培养。 结果与结论：人脐血和外周血中存在内皮祖细胞,浓度梯度离心联合贴壁筛选获得的单个核细胞在血管内皮生长因子的诱导培养下可分化成内皮祖细胞,内皮祖细胞表达CD34、CD133、CD105、KDR和CD31,能吞噬乙酰化低密度脂蛋白,结合荆豆凝集素1,它们可作为体外分选内皮祖细胞的标志。     

内皮祖细胞在血管生物学中的特征和作用

输入造血干细胞和体外扩增的内皮祖细胞可以促进缺血后组织内的血管新生,使损伤后的内皮出现内皮化。内皮祖细胞的来源和界定一直存在争议,内皮祖细胞可来源于骨髓,CD133/VEGFR2细胞代表一定数量的内皮祖细胞。然而,越来越多的证据提示这些骨髓来源的细胞(如髓样细胞,侧群细胞和间充质细胞)和非骨髓来源的细胞均可产生EC。内皮祖细胞的动员和其介导的血管新生受到精细的调节。他汀类药物,锻炼或一些抑制因子(如冠状动脉疾病的危险因子)可以调节祖细胞的水平,从而影响血管的修复能力。然而,内皮祖细胞的招募和功能的发挥是多步骤调节的结果,如粘附,信号转导事件包括粘附和迁移(如通过整合素家族)趋化因子(如通过SDF-1/CXCR4)最后分化成EC。本文讨论了调节内皮祖细胞介导的血管新生和血管内皮化的可能机制。     

血管内皮祖细胞的研究进展

在胚胎发育过程中，血管系统的建立始于两种方式：血管发生和血管新生。传统理论认为血管新生即是出生后血管发生的代名词。然而，近的来发现循环中存在骨髓来源的血管内皮祖细胞，并与出生后血管发生密切相关，具有重要的生理、病理意义。这不仅拓展了干细胞的研究，也为缺血性疾病和肿瘤的治疗提供了新策略。本文简述了血管内皮祖细胞的来源、细胞表面标志、生物学特性、生理病理意义及其临床应用前景。     

犬骨髓血管内皮祖细胞的分离和诱导分化

目的 :分离并诱导犬骨髓内皮祖细胞分化为内皮细胞。并探讨不同培养条件、血清浓度和接种密度对分化的影响。方法 :密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞 ,以不同密度分别接种于DMEM和EBM 2 +SingleQuots培养基中 ,在不同浓度胎牛血清条件下培养。随后鉴定细胞并比较各组分化率。结果 :接种密度较低时细胞无法成活 ,接种密度达 10 5/cm2 时细胞能表达内皮细胞标志并具有内皮细胞功能。 2 %和 2 0 %胎牛血清培养细胞 ,其分化率存在显著差异。结论 :犬骨髓能够分离出内皮祖细胞并能在体外分化为内皮细胞 ;接种密度过低对其分化不利 ;低浓度胎牛血清有利于细胞的分化。     

内皮祖细胞的动员、归巢和分化

内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞 ,在某些生理、病理状态下可随血流至相应组织 ,分化为内皮细胞 ,并进一步形成血管。内皮祖细胞不仅参与胚胎发育的血管发生 ,而且在成人机体的血管新生中起重要的作用。研究内皮祖细胞的生物学特性、动员、归巢及分化机制将为临床治疗缺血性疾病、创伤修复及抑制肿瘤生长提供理论依据。     

血管内皮祖细胞与糖尿病血管病变

内皮祖细胞(EPC)是能直接分化成血管内皮的前体细胞,参与胚胎期及成体的血管生长。糖尿病内皮祖细胞的数量及功能均有改变,使血管阻塞事件具有更高的发病率和致死率。已有实验证实EPC存在并参与了出生后新血管形成。在动物肢体缺血模型中,EPC移植能扩大缺血组织的侧枝血管生长,恢复血流,改善缺血,这为糖尿病血管病变提供了一种可行性治疗策略。     

内皮祖细胞与肿瘤血管新生

血管内皮祖细胞（EPCs）是内皮细胞的前体细胞,特异性表达CD34,CD133和VEGFR-2,具有向血管内皮细胞分化的潜能。EPCs主要位于骨髓和外周血。肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤血管新生。肿瘤细胞可合成和释放多种细胞因子,在不同因子的趋化作用下EPCs从骨髓动员至外周血循环,然后迁移和定居到肿瘤组织,经细胞因子诱导分化为成熟内皮细胞,参与肿瘤血管新生。VEGF/VEGFR-2信号途径在EPCs参与的肿瘤血管新生方面起重要作用。     

人脐血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

目的探索人脐静脉血内皮祖细胞的分离培养,为内皮祖细胞的临床应用提供实验方法。方法选择脐静脉血,应用密度梯度离心法,获取单个核细胞,接种于预先包埋了人纤维连接蛋白的培养板,用加入生长因子VEGF165和bFGF的内皮细胞专用培养基EGM-2MV培养细胞,3d后,洗掉非贴壁细胞,换培养液继续培养至7d,收集贴壁细胞进行细胞分析。激光共聚焦显微镜进行细胞功能学鉴定,流式细胞术测定祖细胞和内皮细胞系标志。MTT比色法检测细胞的生长状态。结果经过梯度密度离心和贴壁法选择的细胞能特异性吸附FITC标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL,祖细胞标志CD133及内皮细胞特异性抗原CD34、KDR检测,其阳性率分别为（27．05±2．94）％、（16．37±2．69）％和（56．67±7．29）％;体外培养的内皮祖细胞具有良好的细胞增殖活性。结论人脐静脉血中可以分离培养内皮祖细胞,为内皮祖细胞的进一步研究及临床应用奠定了基础。     

血管内皮祖细胞与缺血性心血管病的血管新生

1997年Ｔａｋａｙｕｋｉ等[1] 在Ｓｃｉｅｎｃｅ杂志发表论文报道血管内皮祖细胞 (ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ ,ＥＰＣ)分离成功 ,并可用于体内血管新生 (ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ)。当时提出的血管内皮祖细胞认为是假定的 (ｐｕｔａｔｉｖｅ)。但是 ,近年来随着干细胞研究的深入 ,血管内皮祖细胞的存在基本已经确认 ,而且它与血管新生间的关系日益受到重视[2 ,3 ] 。本文将讨论血管内皮祖细胞的特征 ,它与缺血性心血管疾病中血管新生的关系及其可能的应用前景。1　血管内皮祖细胞的特征　　血管内皮祖细胞是血…     

脂肪源性干细胞体外分离培养及向内皮祖细胞的诱导分化

背景：脂肪源性干细胞是目前组织工程种子细胞的研究热点,通常采用胶原酶消化脂肪组织来获得,但是存在着操作繁琐,花费高等不足。 目的：观察组织块培养法分离的脂肪源性干细胞的基本生物学特性及其向骨细胞、脂肪细胞及内皮祖细胞的诱导分化潜能。 方法：无菌条件下切取大鼠双侧腹股沟脂肪组织,组织块法分离培养脂肪源性干细胞,CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪分析干细胞表面标志表达。取第4代脂肪源性干细胞用成骨诱导液、成脂诱导液、内皮祖细胞诱导液培养两三周并进行鉴定。 结果与结论：组织块培养法得到的脂肪源性干细胞易扩增,传代后以长梭形细胞生长为主,呈漩涡状排列,克隆样生长;经多次传代仍能保持较强的增殖能力,细胞生长曲线呈抛物线形;细胞表面标志CD44、CD90、CD29呈阳性表达,CD45、CD31呈阴性表达。成脂诱导后细胞油红O染色阳性、成骨诱导后细胞茜素红染色阳性。诱导后的内皮祖细胞CD34及DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色阳性。以上结果显示组织块培养法能成功分离培养出脂肪源性干细胞,且获得的细胞纯度较高、易于增殖培养,能高表达干细胞表面抗原以及具有向骨细胞、脂肪细胞及内皮祖细胞多向分化的潜能,可以满足组织工程研究种子细胞的需求。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

人外周血内皮祖细胞的培养过程及分化

目的：研究人外剧血中内皮祖细胞（endothelial progenitor cell,EPC）的培养及分离,并探索EPC生物学特性及诱导分化条件：方法：健康成人肘静脉血,用密度梯度离心法得到单个核细胞,接种于纤维连接蛋白包被的6孔板进行培养（含有人血管内皮细胞生长因子）,观察细胞集落、梭形贴壁细胞的形成过程。应用激光共聚焦显微镜和流式细咆仪进行EPC的鉴定。结果：在细胞培养的第4天,人外周血来源的单个核细胞开始形成从中间向外剧放射的细胞集落;住第7天时形成典型的长梭形,首尾相连成条索状;培养第2周时,长悛形细胞渐消失,出现鹅卵石样的圆形椭圆形细胞;在第3周时,鹅卵石样细胞增殖旺盛。可以应用激光共聚焦显微镜成功鉴定EPC,并且VEGF和人纤维连接蛋白可以促进EPC的生长。结论：人外周血中的内皮祖细胞来源于单个核细胞,早期内皮祖细胞出现于细胞培养第4-7天,晚期内皮祖绌胞出现于细胞培养2-3周时。EPC任特定条件下可分化为内皮细胞,为EPC的进一步研究及临床应用奠定了基础。     

应用DiI标记犬脐血内皮祖细胞的实验研究

目的应用DiI标记犬脐血内皮祖细胞,为内皮祖细胞的研究提供细胞标记方法。方法取犬的脐带血,用添加有EGM-2MV的EBM-2在纤连蛋白包被的六孔板上培养。检测细胞表面抗CD31、CD34、vWF及FLK-1的表达。用DiI标记内皮祖细胞,用荧光显微镜观察内皮祖细胞的荧光情况。结果4~6d有细胞贴壁生长,7~14d可见贴壁细胞呈克隆型生长,呈典型的“铺路石”样外观。传代后,细胞生长良好。细胞表面抗体检测显示为:CD31(+),CD34(+),vW因子(+),FLK-1(+)。荧光显微镜下见内皮祖细胞的细胞浆内有红色荧光。阳性率(68.8±1.6)%。结论应用DiI标记犬脐血内皮祖细胞,方法简单,染色效果好,是内皮祖细胞示踪的好方法。     

培养内皮细胞的分化

体内细胞与体外培养细胞差异的关键在于细胞分化,内皮细胞的分化是检测内皮细胞差异的核心问题。内皮细胞在体内分布广泛,其分化表现出极大的异质性,体外培养血管内皮细胞的分化也表现极大的差异,本文介绍了内皮细胞的胚胎起源、内皮细胞的异质性及影响内皮细胞分化的贩研究进展,揭示内皮细胞分化的分子机理,将使人们可驾驭基分化,按人们要求使内皮细胞发生肯定的分化。     

人外周血内皮祖细胞移植促裸鼠缺血组织血管新生的初步研究

目的观察人外周血内皮祖细胞移植对下肢缺血裸鼠血管新生的影响。方法从人自愿者外周血中分离单个核细胞 ,置于EBM -2培养基内培养7d后 ,获得内皮祖细胞。将1×106个内皮祖细胞通过尾静脉注入下肢缺血裸鼠体内 (8只 ) ,对照组 (8只 )通过尾静脉注入等量的PBS。移植后第28d ,处死动物 ,进行组织学和生理学评估。结果内皮祖细胞组毛细血管密度较对照组明显增加[(136.4±40.5)/视野 ,(53.65±14.02)/视野 (P<0.01)] ;内皮祖细胞组的肢体致残率 (25 % )较对照组 (50 % )减少。结论体外扩增的内皮祖细胞移植能够促进缺血组织的血管新生 ,并能减少肢体的致残率。     

白藜芦醇对于外周血内皮祖细胞体外增殖分化的影响

目的:观察白藜芦醇对内皮祖细胞体外扩增分化过程中内皮系基因的表达及粘附、迁移功能的影响。方法:密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞,在向内皮祖细胞诱导分化的同时,加入不同浓度的白藜芦醇(1、5、15、60μM)干预7天,随后采用流式细胞术观察CD34、CD31、KDR基因的表达;用RT-PCR和ELISA方法检测干预后内皮型一氧化氮合成酶的表达;同时测定干预后细胞的粘附和迁移功能。结果:低浓度白藜芦醇(5μM)不同程度促进内皮祖细胞增殖分化中CD34、CD31、KDR的表达,上调eNOS的mRNA和蛋白水平表达,并促进内皮祖细胞粘附和迁移功能;而高浓度白藜芦醇(60μM)则不同程度下调CD34、CD31、KDR、eNOS的表达和抑制粘附、迁移功能。结论:低浓度白藜芦醇可促进外周血内皮祖细胞内皮系基因的表达,并且促进其粘附和迁移,而高浓度则产生相反的作用。     

外周血内皮祖细胞种植小径聚氨酯人工血管及流体切应力处理的实验研究

本研究收集健康成人骨髓单个核细胞,用血管内皮生长因子等加以诱导分化,通过荧光显微镜和荧光免疫标记等方法观察和鉴定诱导后的细胞。之后将诱导分化的内皮祖细胞种植到聚氨酯小径人工血管表面,予以15 dyn／cm2的流体切应力处理,并用扫描电镜观察。结果发现外周血单个核细胞诱导分化成为内皮祖细胞,ac- LDL及lectin抗体荧光标记阳性。扫描电镜下,未种植细胞的聚氨酯小径人工血管表面孔径大小比较适合内皮祖细胞爬行;静态种植细胞后,人工血管表面内皮祖细胞排列不整齐;切应力条件下种植细胞后,人工血管表面内皮祖细胞排列较为整齐。因此,在体外能将外周血单个核细胞诱导分化成为内皮祖细胞,内皮祖细胞是小径人工血管内皮化的理想种子细胞。流体切应力对小径聚氨酯人工血管表面内皮祖细胞的生长排列有着良好的机械塑形作用。     

细胞因子对脐血NK细胞分化及调节活性的作用

脐血来源丰富和GVHD发生率低等特点使脐血越来越多地用于造血干细胞移植,但因脐血淋巴细胞免疫活性较低,移植后GVL相对较弱,因而不利于长期生存。已有研究发现NK细胞可杀伤宿主抗原呈递细胞而减轻GVHD,也杀伤肿瘤细胞起GVL作用,因此,如何提高脐血NK细胞活性已成为脐血造血干细胞中热门课题。近年发现一些细胞因子具有促进NK细胞分化成熟及增强抗肿瘤作用,因此细胞因子有望用于临床,在脐血移植中起重要作用。     

Endothelial and Hematopoietic Progenitor Cells (EPCs and HPCs): Hand in Hand Fate Determining Partners for Cancer Cells

Tumor growth and metastasis need new vessel formation by angiogenesis provided by mature endothelial cells and postnatal vasculogenesis provided by endothelial progenitor cells (EPCs). Emerging data suggest a coordinated interaction between EPCs and hematopoietic progenitor cells (HPCs) in these processes. The complexity of the mechanisms governing the new vessel formation by postnatal vasculogenesis has increased by new evidence that not only bone marrow derived EPCs and HPCs seem to be involved in this process but also local progenitors residing within the vascular wall are mobilized and activated to new vessel formation by tumor cells. This review attempts to bring these systemic and local players of postnatal vasculogenesis together and to highlight their role in tumor growth and mestastasis.     

免疫磁珠分离脐血CD133阳性细胞的方法研究

目的探讨免疫磁珠分离脐血CD133阳性细胞的方法。方法6%羟乙基淀粉(HES)和Ficoll-Paque联合应用分离出脐血中单个核细胞,再用MACSCD133磁珠分离试剂盒分选其中的CD133+细胞。结果经MACS分离的脐血中CD133+细胞数平均为(6.3±2.9)×105/ml,占单个核细胞的(1.41±1.14)%,经流式细胞仪检测CD133+细胞纯度为75%￣85%。结论免疫磁珠法是分离脐血CD133阳性细胞的较好的方法。