组织工程心脏瓣膜构建中细胞种植的实验研究

目的 观察不同细胞种植在脱细胞猪主动脉瓣叶支架上的生长特点。方法 将猪主动脉瓣叶行脱细胞处理．并在其上分别种植新生牛主动脉内皮细胞(BAECs)、平滑肌细胞(SMCs)、SMCs和BAECs。结果 猪主动脉瓣叶中的细胞成分能完全去除，种植的BAECs在脱细胞瓣叶表面形成一连续的细胞层．SMCs形成多层连续的细胞层，复合种植细胞则形成多层连续的细胞层；BAECs表面形成一连续的细胞层，其间为多层分布的SMCs，同时内皮细胞分泌前列环素(PGI2)的能力明显增强。结论 不同种类的细胞在脱细胞瓣叶表面均生长良好，并呈现不同的生长方式，SMCs和BAECs复合种植有可能为今后组织工程瓣膜构建中有关细胞种植提供参考。     

人骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的研究

取心血管外科手术患者胸骨骨髓,Ficoll离心法获取单个核细胞,体外培养扩增后种植在猪去细胞主动脉瓣叶表面2周,观察细胞生长情况;免疫组化检测细胞分化结果;扫描电镜和透射电镜观察细胞种植情况.结果 经体外培养的入骨髓基质干细胞在去细胞猪主动脉瓣叶纤维网状支架表面形成一层基本连续的细胞层.认为去细胞猪主动脉瓣叶组织是良好的纤维支架,可用于构建组织工程心脏瓣膜;人骨髓基质干细胞种植在去细胞猪主动脉瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜是可行的.     

应用犬骨髓间充质干细胞体外构建组织工程心脏瓣膜的实验研究

目的:将犬骨髓间充质干细胞（BMSCs）分离、自然扩增后,体外与去细胞猪主动脉瓣复合构成组织工程瓣膜（TEHV）,观察其生长情况,以评价其作为组织工程心脏瓣膜种子细胞的可行性。方法:采用密度梯度离心及贴壁筛选法分离犬的BMSCs,培养扩增,用免疫组化的方法进行鉴定;采用本实验室方法构建的生物材料———去细胞猪主动脉瓣为支架,种植犬的BMSCs,静态培养710 d;进行组织学切片及扫描、透射电镜观察,并进行机械力学性能检测。结果:分离的BMSCs细胞免疫组化显示SH2、V im entin、α-SMA（+）,CD34、VIII因子、Lam in in（-）,生长扩增能力强,2周内经3代培养即可扩增到（5.57±0.34）×107细胞数量级;组织工程瓣组织学示活组织和细胞外基质（extracellu larm atrix,ECM）形成;扫描电镜见细胞贴附均匀,透射电镜可见分泌活性的肌纤维细胞样细胞（含actin/myosin纤维、胶原纤维、弹性蛋白）;机械力学性能得到保留。结论:使用本方法可以构建成功组织工程心脏瓣膜;BMSCs与去细胞猪主动脉瓣的相容性良好,可以作为种子细胞之一。     

T-1型脱细胞异体组织补片在口腔颌面外科的临床应用

各种原因引起的口腔黏膜缺损的修复，临床一般采取自体组织移植法，这种传统的方法在治疗口腔颌面部皮肤黏膜组织病损中发挥了一定的作用，但又有难以克服的弊病。近年来人工真皮的研究进展迅速，尤其是脱细胞异体真皮基质已经在烧伤和整形领域中皮肤移植的成功应用。脱细胞异体组织补片是应用组织工程学技术，将异体组织经过脱细胞处理后，去除引起异体组织间排斥反应的细胞成分，保留细胞外基质成分即细胞支架结构，以“细胞支架”的形式移植到受体部位，为细胞提供生长的场所和空间，诱导和调节细胞的生长、分化和代谢。我科在2003年以来使用了异体脱细胞真皮软组织修复材料修复口腔颌面部口腔黏膜缺损，并取得了较满意的效果。     

应用离心管技术以异体微粒软骨脱细胞基质为支架体外构建组织工程软骨

目的将软骨细胞与异体软骨微粒脱细胞基质相结合．构建组织工程软骨。方法分别利用氯化钾、胰蛋白酶和乙二胺四乙酸钠对绵羊关节软骨进行脱细胞，并制成直径0．100—0．154mm的微粒。先分离异体关节软骨细胞并进行体外扩增，再将异体软骨细胞与软骨微粒脱细胞基质混合培养，离心后应用离心管体外培养。结果本脱细胞方法可以使关节软骨细胞完全脱落，且软骨细胞紧紧围绕于异体软骨微粒脱细胞基质四周，生长和分泌功能良好。结论软骨细胞与异体软骨微粒脱细胞基质有良好的生物相容性．可于体外形成软骨样组织。     

制备犬胸主动脉脱细胞血管支架的新方法

目的 研究制备犬胸主动脉脱细胞血管支架的新方法,制备出理想的犬胸主动脉脱细胞基质,从而为构建组织工程血管提供支架材料.方法 在无菌条件下从成年比格犬体内取出胸主动脉血管段（28根）,随机分成4组：A组血管段设为正常对照组;B组血管段置于-70℃的冰箱和4℃冰箱内反复冻融2次;C组血管段在0.1％的SDS溶液中持续震荡1d;D组血管段经历反复冻融后置于1％ Triton X-100的PBS溶液和1μmol/L PMSF的混合液中常温下震荡2d,于0.01％的SDS溶液中持续震荡1d,最后加入核酸酶Dnase 0.2 mg/L和Rnase0.02 mg/L消化24h.四组血管段经历不同的过程后,全部从大体形态、光镜、电子显微镜观察、力学性能测试、免疫组化等角度进行检测并做统计学分析.结果 0.1％ SDS法虽能完全脱除细胞,但制备的脱细胞基质弹力纤维排列紊乱,部分发生断裂,且不能保持良好的形状和张力强度,管腔有不同程度的塌陷;反复冻融＋1％ Triton X-100＋PMSF＋0.01％ SDS法不仅能完全脱除细胞,保持基质纤维的正常排列结构,而且制备的脱细胞基质能保持良好的形状和力学性能,管腔无塌陷.结论 联合应用反复冻融、Triton X-100、PMSF和SDS的方法能够将犬胸主动脉的细胞成分除去,是一种制备脱细胞血管支架的有效方法.     

应用胶原膜构建组织工程心脏瓣膜的初步研究

目的 :探讨应用胶原膜构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法 :扫描电镜观察材料结构特点。材料兔皮下包埋实验 ,分别于 4,6 ,8,12周观察材料的生物相容性和降解率。培养犬主动脉瓣间质细胞、主动脉壁间质细胞和皮肤成纤维细胞 ,对照其生长曲线、平滑肌α肌动蛋白表达和扫描电镜特点。将犬主动脉壁间质细胞和内皮细胞种植于胶原膜上 ,观察其形态并测定细胞合成前列环素的功能。结果 :胶原膜呈网孔状结构 ,孔径 10 7μm。皮下包埋实验显示材料生物相容性好 ,体内降解时间为 12周。犬主动脉瓣间质细胞和主动脉壁间质细胞平滑肌α肌动蛋白均为部分阳性表达 ,细胞内有大量粗面内质网 ,生长曲线相似。种植实验示细胞在材料表面生长良好 ,并具有合成、分泌前列环素 （84.2 pg/ m L vs0 .4pg/ m L ,P<0 .0 5 ）的功能。结论 :以胶原膜为支架体外构建组织工程心脏瓣膜细胞不仅能在材料表面生长 ,还能合成、分泌血管活性物质 ,是具有“生理功能 "的组织工程心脏瓣膜。     

大鼠骨髓基质细胞与骨衍生支架材料联合培养实验

经Percoll密度梯度离心分离大鼠骨髓基质细胞（BMSCs），体外培养扩增，将BMSCs与生物骨衍生支架联合培养。倒置显微镜观察示联合培养第3天大鼠BMSCs在生物骨衍生支架表面生长，顺骨粒方向延伸。随培养时间延长，生物骨衍生支架表面的细胞数量增多，连接成片。扫描电镜观察示生物骨衍生支架表面粗糙，可见大小不等的微孔隙。细胞贴附于骨粒表面，可向裂隙或微孔内生长。     

人食管上皮细胞原代培养方法的研究

目的探讨适用于组织工程食管研究的食管上皮细胞培养方法.方法对比食管上皮细胞在无血清培养基K-SFM及含血清培养基DMEM中的生长情况.结果食管上皮细胞在无血清培养基K-SFM中生长快,细胞形态好,不易被成纤维细胞污染.结论应用无血清培养基K-SFM培养食管上皮细胞,方法简便,适合推广应用.     

骨髓基质干细胞和基因强化组织工程修复软骨的实验研究

由于目前应用的移植软骨细胞体外扩增能力较弱．且取材不便，易对供体部位造成损伤，限制了临床应用。因此．寻找能在体外控制性生长的种子细胞成为近年软骨组织工程研究的热点。本文就骨髓基质干细胞和基因强化组织工程在软骨修复中的研究进展概述如下。     

脐血基质细胞与骨髓基质细胞造血支持功能的比较

目的：探讨脐血基质细胞造血支持功能并与骨髓基质细胞进行相关比较.方法：选择脐带血10份，骨髓标本10份，采用体外培养的方法，观察了脐血基质细胞的体外生长特性，以及其对造血的支持功能，并与骨髓基质细胞进行了相关比较.结果：①脐血基质细胞的形态以圆形和椭圆形为主，脐血基质细胞贴壁时间晚于骨髓基质细胞.②骨髓基质细胞层上悬浮细胞产率在第1、2、3，周均高于脐血细胞层上细胞产率，且两者都高于无贴壁细胞层，均P＜0.05，差异有统计学意义.③骨髓基质细胞层和脐血基质细胞层上的粒单系祖细胞集落（CFU-GM）产率都高于无贴壁细胞层，脐血基质细胞层上的CFU-GM产率低于骨髓基质细胞层，均P＜0.05，差异有统计学意义.结论：脐血基质细胞有支持造血干/祖细胞生长的作用，但其造血支持功能不如骨髓基质细胞。     

犬骨髓间叶干细胞的分离培养和生物学特性

目的 建立犬骨髓间叶干细胞的体外分离、培养、扩增与鉴定方法，了解其生物学特性，为心肌梗死、心力衰竭及缓慢性心律失常的干细胞移植提供细胞材料。方法 抽取犬骨髓液10ml，以DMEM1：1稀释，用1.063g／ml percoll密度分离液，以600g离心力、30min分离骨髓单个核细胞；以LG-DMEM及10% FBS添加100U／ml青霉素，100μg／ml链霉素，25μg／ml两性霉素B培养骨髓干细胞；利用细胞贴壁筛选法分离、培养、扩增骨髓间叶干细胞；应用干细胞表面标志蛋白检测，诱导剂诱导分化间叶组织细胞等方法进行犬骨髓间叶干细胞的鉴定。结果 分离出的犬骨髓单个核细胞约占细胞总数的10^-4～10^-6，在LG-DMEM与选择性血清培养基上生长良好。犬骨髓间叶干细胞孵育24h即可见细胞贴壁生长，贴壁细胞约占接种单个核细胞总数的10^-6。犬骨髓间叶干细胞增殖分裂迅速，38～48h内增殖多个细胞，约72h即可增殖形成大的细胞克隆，7～1Od即可布满瓶底。细胞融合时类似成纤维细胞，呈纺锤状，细胞小而密集，螺旋梳状排列。连续培育10代以上，未见细胞形态、增殖特性发生改变。未见骨髓间叶干细胞自发分化其它类型细胞，仍维持原代培养细胞的增殖特性。犬骨髓间叶干细胞的表面标志SH2阳性，CD45则阴性。在化学诱导液的作用下，犬骨髓间叶干细胞能定向分化为心肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞等多种间叶组织类型细胞。结论 密度梯度分离法与贴壁筛选法能较好地进行犬骨髓间叶干细胞的体外分离、培养与扩增，犬骨髓间叶干细胞具备易于分离培养，巨大增殖潜力，独特细胞表型，多系分组能力等细胞生物学特性。为心肌梗死、心力衰竭与心律失常的细胞移植修复治疗提供了理想细胞材料。     

不同试剂脱除猪胸主动脉壁细胞的对比研究

目的:用不同方法去除猪胸主动脉壁细胞,并比较去细胞效果,为组织工程瓣膜或带瓣管道提供良好的实验材料。方法:采用十二烷基硫酸钠、胆脂酸钠、曲拉通（TritonX100）制备猪胸主动脉脱细胞基质。将实验分为十二烷基硫酸钠组、胆脂酸钠、曲拉通组和空白对照组。标本进行大体、光镜、电镜观察,力学性能的检测并做比较。结果:胆脂酸钠无法完全脱除主动脉壁内细胞,十二烷基硫酸钠和曲拉通都能完全脱除猪胸主动脉细胞,曲拉通较好地保持了胶原纤维和弹性纤维的原有排列和分布,并有较好的力学性能。后两者脱细胞时间无显著差别。结论:曲拉通可以成功用于制备大血管脱细胞基质,为组织工程瓣膜或带瓣管道的研究提供材料。     

小鼠骨髓基质细胞成内皮细胞分化及其缺血区存活能力研究

目的 探讨体外培养的骨髓基质细胞的部分生物学特性、成内皮细胞分化能力及在缺血区存活能力？方法 2005年1月至11月，第三军医大学新桥医院全军心血管内科中心分离5～6周龄的小鼠胫骨、股骨，预冷的DMEM／F12培养基冲洗出骨髓，密度梯度离心分离出骨髓单核细胞，接种后12～16d形成单层贴壁的成纤维样细胞：体外诱导分化鉴定分离的细胞：建立下肢缺血模型，荧光标记的体外扩增的骨髓基质细胞被移植入缺血组织，移植后1周，荧光显微镜及HE染色，检查荧光强弱分布与HE染色密度的时空关系。结果 体外传代培养的基质细胞诱导后分泌NO，移植1周在缺血区检测到大量荧光阳性细胞存活。结论在本实验条件下，体外培养的骨髓基质细胞生长稳定，传代后的细胞增殖较快，表现出较早期细胞特点，在体外能分化为血管内皮细胞，可望用作缺血性心脏病的细胞治疗的供体细胞。     

小鼠骨髓基质细胞的生物学特性及血管新生能力

目的 探讨体外培养的骨髓基质细胞的一些生物学特性及体内移植后在缺血区新血管生成中的作用。方法分离5—6周龄的小鼠胫骨、股骨，用预冷的DMEM／F12培养基冲洗出骨髓，经密度梯度离心分离出骨髓单个核细胞，接种后12～16d形成单层贴壁的成纤维样细胞。体外诱导分化鉴定分离的细胞，用传代的细胞进行生长曲线测定，观察其接种贴壁率、分裂指数，检测细胞周期和超微结构，并建立下肢缺血模型。荧光标记的体外扩增的骨髓单个核细胞被移植入缺血组织。移植后2周，荧光显微镜及内皮细胞碱性磷酸酶染色，检查荧光阳性细胞与染色阳性细胞的时空关系。结果体外传代培养的单个核细胞倍增时间约为42h。传代10h贴壁率达90％以上。分裂指数曲线与生长曲线相似。细胞周期显示约83％的细胞处于G1期。结论 体外培养的骨髓基质细胞生长稳定，传代后的细胞适应性强，增殖较快，表现出较早期细胞特点，在体外及移植入体内缺血区能分化为血管内皮细胞，有望用于改善组织缺血。     

染料介导的光氧化处理去细胞猪主动脉瓣的细胞毒性研究

目的 评价染料亚甲基蓝介导的光氧化处理去细胞猪主动脉瓣膜的细胞毒性。方法 将L929细胞经亚甲基蓝介导光氧化处理去细胞猪主动脉瓣浸提液培养后,用MTT比色法测定其相对增殖率。将L929细胞与染料介导光氧化处理去细胞猪主动脉瓣直接接触培养,于不同时间观察细胞的生长状态。将L929细胞种植于染料介导的光氧化处理去细胞猪主动脉瓣表面,用扫描电镜观察其生长情况。结果 染料亚甲基蓝介导的光氧化处理去细胞猪主动脉瓣的性质稳定,细胞毒性程度为0～Ⅰ级。L929细胞与瓣膜材料直接接触培养生长良好,形态学无明显改变。结论 染料亚甲基蓝介导的光氧化处理去细胞猪主动脉瓣的细胞相容性良好。     

组织工程心脏瓣叶体外研究瓣叶基质的检测

目的　初步探讨组织工程心脏瓣叶体外生成基质的检测。方法　杂种猪 4只 ,取主动脉。分离并培养、扩增内皮与成纤维、平滑肌细胞 ,将细胞种植在湿化处理后的支架材料上 (聚羟基烷酸酯 ,PHA)。以首次种植成纤维、平滑肌细胞为起点 ,培养 2 8d ,使用氯胺 T法检测样本的羟脯氨酸含量 ,并行扫描电镜检测。结果　氯胺 T法检测羟脯氨酸 ,方法简便 ,准确性高 ,经测定组织工程心脏瓣叶羟脯氨酸含量为 (10 93± 2 89) μg/g(材料重量 )。扫描电镜检测显示细胞表面可见基质的形成。结论　氯胺 T法可精确测定体外培养的组织工程心脏瓣叶胶原含量 ,结合扫描电镜可有效检测基质的生成     

新型一体两分支覆膜支架在犬胸主动脉模拟释放系统内重建主动脉弓的研究

目的：验证新型一体两分支覆膜支架在犬胸主动脉模拟释放系统内重建犬主动脉弓的可行性。
　　方法：研制新型一体两分支覆膜支架和用于主动脉腔内修复治疗的犬胸主动脉模拟释放系统，并在X线透视下完成新型支架在模拟系统内的释放，探索释放程序，验证该支架体外释放的可行性。
　　结果：新型一体两分支覆膜支架在犬胸主动脉体外释放模拟系统内成功释放，释放过程顺利，X线透视下观察覆膜支架释放后完全展开，位置良好，新型支架与各小支架对接成功。
　　结论：新型一体两分支覆膜支架在体外测试中能成功重建主动脉弓，胸主动脉模拟释放系统能较为真实的模拟腔内修复治疗的全过程，为进一步的动物实验奠定良好的基础。     

采用1.068 g/ml分离液对犬骨髓间充质干细胞的分离纯化与体外培养方法的探讨

目的探讨更为可靠、纯净度高的犬骨髓间充质于细胞分离、培养方法。方法将犬骨髓抽取液分别以1．068g／ml及1．073g／ml分离液进行密度梯度离心，采用贴壁培养法获得骨髓间充质干细胞（MSCs）；以LG-DMEM加15％FBS培养；应用于细胞表面标志蛋白，多向诱导分化等方法进行细胞鉴定。结果采用1．068g／ml分离液可获得纯度较高的单核细胞，接种细胞生长良好，孵育24h即可见细胞贴壁生长，平均倍增周期为1d，细胞呈纺锤状，螺旋梳状排列。连续培育8代以上，未见细胞形态、增殖特性改变。MSCs表面标志SH2阳性，CD45阴性，可定向分化为心肌细胞、成骨细胞及脂肪细胞。结论采用1．068g／m1分离液能够较好地进行犬MSCs的体外分离、培养与扩增，分离得到的细胞具备MSCs的特性。     

在肾动脉下方的腹主动脉上犬同种带瓣主、肺动脉移植模型

目的：建立在肾动脉下方的腹主动脉上犬同种带瓣主、肺动脉移植实验模型，以研究其移植后免疫学、组织活性和超微结构改变以及宿主细胞替换供体组织过程。方法：将犬分为４组，采用犬同种带瓣主、肺动脉沿血流方向移植于异性受体犬肾动脉下方的腹主动脉上的方法。结果：全组２８例均存活，满足实验设计要求。结论：本实验模型具有手术操作容易、成功率高、术后并发症少、费用低廉等优点