反转录病毒介导基因转移治疗脑肿瘤的安全性研究：Ⅰ.具有？…

目的：检测反转录病毒介导的脑肿瘤基因治疗中具有复制能力野生型反转录病毒（ＲＣＲ）。方法．；ＲＣＲ检测主要方法有：ＤＮＡ聚合酶链式反应（ＰＣＲ），反转录ＰＣＲ（ＲＴ／ＰＣＲ）。Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交以及ｎｅｏ基因和ｌａｃＺ基因的补救分析。结果：建立了ＰＣＲ的检测系统，从ＤＮＡ水平、ＲＮＡ水平和病毒活体水平对产ＨＳＶ＿ＴＫ病毒我装细胞（ＴＫ／ＶＰＣ），Ｃ６转ＴＫ基因细胞和实验动物血液可能存在的ＲＣＲ野生型     

反转录病毒介导基因转移治疗脑肿瘤的安全性研究Ⅱ.HSV—tk/ACV系统的安全性研究

采用细胞接种、X－gal染色、TK基因的PCR和病理切片观察，分别将PA317／BAG．PA317／TK产病毒细胞注射到动物体内，结果产病毒细胞在动物体内存活期均不超过1个月；产病毒细胞在体内没有形成肿瘤，也没有发现严重的炎症反应；HSV－tk／ACV系统用于动物基因治疗，ACV及其代谢产物没有发现明显的毒副作用和病理改变。说明反转录病毒介导的HSV－tk／ACV系统在动物体内取得了安全的结果。     

应用多重反转录PCR技术检测病毒性呼吸道感染

目的：为了寻求呼吸道感染病毒的快速诊断并指导治疗，建立一种多重反转录PCR体系。方法：分别设计针对肠病毒、腺病毒、乙型流感病毒和甲型流感病毒标准株的特异性引物，采用多重反转录PCR检测4种病毒。结果：应用此多重反转录PCR系统可以特异的同时检测到同一模板中的肠病毒、腺病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒。通过用多重反转录PCR和单一PCR对36份临床标本的检测相比较，结果表明多重反转录PCR的检测与单一PCR的检测结果是一致的。结论：通过与单一的PCR对比，证明该多重反转录PCR系统可替代单一的PCR用于肠病毒、腺病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的呼吸道感染的快速诊断。     

用DNA-PCR方法于基因组水平检测K562细胞及慢性粒细胞白血病患者bcr/abl融合基因

目的：在慢性粒细胞白血病（慢粒）细胞系K562及慢粒患者中尝试基于DNA水平的bcr／abl融合基因检测方法。方法：以Waller的“L—T DNA PCR”方法为基础，并针对其引物位置设计的缺陷，改进设计了一套DNA—PCR引物，分别提取K562细胞及慢粒患者外周血单个核细胞DNA，进行bcr／abl融合基因扩增，并对扩增片段进行序列测定。结果：运用DNA—PCR方法成功地扩增出了K562细胞及2名CML患者外周血基因组的bcr／abl融合基因片段，随后进行的片段测序进一步明确了融合基因的断裂位点。结论：DNA—PCR提供了一种基于基因组DNA水平的新检测手段，结合测序能鉴定融合基因的断裂位点，若结合定量PCR的方法则能监测患者的治疗效果与预后，还能检测患者经化疗后的残留微小病灶。     

荧光定量反转录PCR检测新生儿脐血ξ珠蛋白mRNA的转录水平

目的运用荧光定量反转录PCR技术,检测新生儿脐血ξ珠蛋白mRNA的转录水平。方法以基因型为（αα/αα）的新生儿作为正常对照组,基因型为（--／αα）的新生儿为病例组。选择β肌动蛋白基因为校正基因,ξ珠蛋白基因为目的基因。运用双标准曲线法检测两组新生儿脐血的ξ珠蛋白mRNA的转录水平。结果病例组的ξ珠蛋白mRNA的平均转录水平明显增高。结论通过荧光定量反转录PCR技术能够检测出基因型为（--SEA／αα）的新生儿的ξ珠蛋白mRNA转录水平的增高,具有较好的诊断价值。     

HSV-tk/GCV系统对人宫颈癌细胞株ME180旁观者效应的研究

目的：研究以逆转录病毒载体介导的HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞株的旁观者效应。方法：应用脂质体及ploybrene转染技术，将重组逆转录病毒载体PLXSN－HSV－tk，导入PA317包装细胞，以其分泌的逆转录病毒感染宫颈癌ME180细胞（ME），建立ME／TK转化细胞株。观察GCV对ME、ME／TK细胞的存活率及旁观者效应。结果：从病毒滴度、电镜及PCR检查，证实tk基因随病毒的感染已成功地导入PA317及ME180细胞。ME／TK细胞对GCV的敏感性显著高于亲代ME细胞。ME／TK及ME＋ME／TK混合细胞还随GCV浓度的增加受到明显的抑制。ME＋ME／TK混合细胞的存活率，随ME／TK细胞比例的增加而降低，说明TK／GCV系统不但能杀伤tk^ 细胞，也能杀伤未导入tk的细胞，存在明显的旁观者效应。结论：HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞具有明显的杀伤及旁观者效应。     

含TKglyES融合基因重组质粒的构建

目的：构建携带胸腺嘧啶激酶（thymidine kinase，TK）及内皮抑素（Endostatin，ES）融合基因的重组质粒。方法：以pAdE1CMV—TK为模板，经聚合酶链反应（PCR）扩增TK片段，将其插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV，再以PET-19b—ES质粒为模板经PCR扩增glyES片段，将其插入TK片段的下游，构建成pAdTrackCMV—TKglyES。结果：酶切、PCR及DNA测序鉴定表明成功构建了携带胸腺嘧啶激酶（thymidine kinase）及内皮抑素（Endostatin）融合基因的重组质粒。结论：为进一步构建病毒载体用于肿瘤基因治疗打下基础。     

食管癌EC109细胞属人类乳头状瘤病毒18型阳性细胞株

目的：探究食管癌细胞系EC109是否为人类乳头状瘤病毒（HPV）感染。方法：以HeLa细胞为阳性对照，以细胞DNA为模板，聚合酶链反应（PCR）扩增HPV基因保守序列GPf／GP6基因片段；PCR扩增I-IPV18 E6和HPV18 E6／E7基因片段：对HPV18 E6／E7PCR扩增产物片段进行测序；采用逆转录（RT）．PCR扩增HPV18E6和研基因片段；利用HPV基因分型芯片对EC109和HeLa细胞进行HPV分型。结果：PCR、RT-PCR和测序结果证明EC109细胞为HPV18阳性细胞；HPV分型芯片结果显示EC109也为HPV18阳性细胞。结论：EC109细胞是属于HPV18亚型感染型细胞。     

野生型p53对胃癌细胞系的生长抑制作用

目的：观察野生型p53对胃癌细胞系的生长抑制作用。方法：以逆转录病毒为载体将野生型p53基因导入胃癌细胞系MKN28和BGC823，检测p53对肿瘤细胞的影响。结果：p53在转染细胞中表达水平提高。外源性p53的导入使肿瘤细胞增殖细胞核抗原（PCNA）水平明显降低；G0／G1期细胞数增加，S期降低。转染p53基因的MKN28细胞探鼠体内成瘤能力明显下降。结论：野生型p53基因参与调节DNA复制及细胞周期，抑制癌细胞过度增殖。     

构建单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因真核表达载体

从单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV－Ⅱ）Sav株感染的Hep-2细胞培养液和细胞裂解液中提取HSV－Ⅱ基因组DNSA，以此为模板，用PCR方法获取胸苷激酶（TK）基因，将获取的DNA片段克隆入真核表达载体pcDNA3中，筛选阳性克隆测序，结果表明：本研究获取的HSV－Ⅱ－TK基因全部编码区为1128bp，编码376个氨基酸，结果表明：本研究扩增出HSV－ⅡTK基因的全部编码区序列，并成功构建真核表达载体pcDNA3／TK.     

含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体构建与表达Tat蛋白功能检测

目的：构建含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体及评价表达Tat蛋白的功能。方法：使用HindⅢ将HIV-1 Tat101蛋白编码基因从pEV质粒中切出，插入到表达质粒LZRSpBMN—Z中，构建成重组反转录病毒表达质粒IZRS-Tratl01。采用磷酸钙转染法将重组质粒LZRS-Tat101转染进含反转录病毒erw、gal和pol编码基因的包装细胞phoenix(φNX)中，嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系。免疫组化(IHC)染色检查Tat在临时转染和稳定转染删x细胞中的表达水平。收集临时转染和稳定转染包装细胞分泌的病毒上清，并分别感染293细胞，Western blot检测Tat在293中表达。与此同时，收集感染293细胞培养上清，加入到HL3T1细胞(HELa—HIV-1-LTR／CAT报告基因)中，共培养72h后收集细胞，提取蛋白作CAT活性检测。结果：①含Tat101基因重组反转录病毒表达质粒转染包装细胞后，Tat在临时转染φNX中表达水平显高于在稳定转染中的水平；②临时转染病感染293细胞，Tat在感染细胞中得到了表达，且分泌至上清中的Tat蛋白能够激活靶细胞HL3T1中HIV-1的LTR启动子，使得其下游的CAT基因得到表达。结论：重组IZRS-Tat101反转录病毒能够在其感染靶细胞中表达Tat蛋白，且表达蛋白具有转录激活功能。     

荧光定量反转录PCR检测新生儿脐血ζ珠蛋白mRNA的转录水平

目的 运用荧光定量反转录PCR技术，检测新生儿脐血ζ珠蛋白mRNA的转录水平。方法 以基因型为（αα/αα）的新生儿作为正常对照组，基因型为（――/αα）的新生儿为病例组。选择β肌动蛋白基因为校正基因，ζ珠蛋白基因为目的基因。运用双标准曲线法检测两组新生儿脐血的ζ珠蛋白mRNA的转录水平。结果 病例组的ζ珠蛋白mRNA的平均转录水平明显增高。结论 通过荧光定量反转录PCR技术能够检测出基因型为（――SEA/αα）的新生儿的ζ珠蛋白mRNA转录水平的增高，具有较好的诊断价值。     

双自杀基因融合基因重组腺病毒的制备与鉴定

目的：制备含胞嘧部氨酶（CD）基因，胸苷激酶（TK）基因的融合基因重组腺病毒，为恶性肿瘤的基因治疗研究作准备。方法：构建包含有CD，TK融合基因的重组粘粒，将其与腺病毒DNA末端肽复合物混合后以磷酸钙共沉淀法转染人胚肾293细胞株细胞，获取重组腺病毒，并进行鉴定。结果：酶切结果及PCR结果显示，重组粘粒中CD，TK融合基因插入正确，经鉴定所获重组腺病毒带有融合基因，并且无具有复制能力的腺病毒存在。结论：所获重组病毒为E1，E3缺陷型，含有所需的双自杀基因，可进一步用于基因治疗研究。     

MDR1启动子调控的双自杀基因真核表达载体的构建及其在K562/A02细胞中的表达

目的：构建多药耐药基因（MDR1）启动子调控的CD-TK双自杀基因真核表达载体用于耐药白血病的靶向性基因治疗。方法：采用PCR方法从K562/A02细胞基因组DNA中扩增MDR1启动子，将其连接到双自杀基因CD TK的上游，构建pcDNA3 MDR1 Promoter CD-TK真核表达载体，用脂质体介导法将构建好的载体转染入K562、K562/A02细胞，PCR鉴定CD、TK基因的整合，RT-PCR鉴定CD、TK基因的表达。结果：PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确，通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK。转染入细胞后PCR结果显示，CD、TK基因均整合入K562、K562/A02细胞中，RT-PCR结果显示,562/A02/CD TK细胞CD、TK基因有特异性条带表达，而K562/CD TK细胞无特异性条带。结论： MDR1启动子调控的CD TK双自杀基因真核表达载体的成功构建及其在K562/A02细胞中的特异性表达为耐药白血病的靶向性基因治疗提供了实验基础。     

双自杀基因CD+TK对胰腺癌BxPC-3细胞的影响

目的探讨逆转录病毒介导的双自杀基因对胰腺癌BxPC-3细胞的杀伤作用及胰腺癌的基因治疗方法。方法通过脂质体将含有双自杀基因的逆转录病毒载体MMLV—CD＋TK导入包装细胞PA317，经G418筛选后大量培养产病毒的阳性克隆PA317／CD＋TK细胞株，收集病毒上清液，浓缩后转染胰腺癌BxPG3细胞系，再次经G418筛选，获得稳定表达双自杀基因的BxPC-3／CD＋TK细胞株。用RT—PCR检测双自杀基因的表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶（5-flourocytosine，5-FC）和（或）无环鸟苷（Ganciciovir，GCV）后，MTT法测定转基因组及未转基因组胰腺癌BxPC-3系细胞的存活率。结果双自杀基因在胰腺癌BxPC-3系细胞中可稳定表达，联合使用5-FC和GCV对细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应效果明显。结论逆转录病毒介导自杀基因可有效杀死胰腺癌Bx-PC-3系细胞，双自杀基因具有更强的抗肿瘤作用。     

腺病毒介导融合双自杀基因治疗膀胱癌

目的 探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶（CD）和胸苷激酶（TK）融合双自杀基因系统对膀胱癌治疗作用并与单基因系统作比较。方法 利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白（GFP）基因的复制缺陷腺病毒作载体,PCR检测CD、TK及E1基因。建立C57BL／6同系膀胱癌Mb49皮下移植瘤模型,观察肿瘤注射腺病毒联合丙氧鸟苷（GCV）或／和5-氟胞嘧啶（5-FC）治疗后肿瘤体积及组织学变化。结果 PCR可检测到腺病毒DNA中含CD及TK基因、无E1基因。腺病毒注射联合GCV、5-FC、GCV＋5-FC治疗后,肿瘤体积与对照组相比明显缩小（P=0.00）,腺病毒注射联合GCV＋5-FC有协同作用（P=0．04）,优于腺病毒注射联合GCV以及腺病毒注射5-FC。基因治疗后肿瘤细胞大片坏死．对照组细胞形态无变化。结论 腺病毒介导CD-TK融合双自杀基因联合GCV或／和5-FC能有效治疗膀胱癌,融合双自杀基因CD-TK／（GCV＋5-FC）系统对膀胱癌治疗有协同作用,其效果优于CD-TK／GCV或CD-TK／5-FC系统。     

稳定表达外源野生型p53基因人胆囊癌细胞系的建立和鉴定

目的：建立稳定表达外源野生型p53（wtp53）基因的人胆囊癌细胞系。方法：在脂质体lipofectamine^TM 2000介导下，将含有wtp53的真核表达质粒pCMV-p53导入胆囊癌细胞系GBC—SD中。经G418筛选抗性克隆，扩大培养，建立转染克隆细胞系。用聚合酶链反应（PCR）证实外源野生型p53基因的整合，用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）和蛋白印迹法分析目的基因及其蛋白表达。结果：野生型p53基因成功地导入胆囊癌细胞系GBC—SD，转染细胞中存在外源p53基因及蛋白的稳定表达。结论：GBC—SD胆囊癌细胞株能稳定表达外源野生型p53基因。     

猪内源性反转录病毒在中国实验小型猪中的存在与表达

目的对中国实验小型猪中内源性反转录病毒的存在与mRNA的表达进行检测,摸清中国实验小型猪中内源性反转录病毒的携带情况.方法根据已发表的PERV的序列设计并合成了三对引物,分别用于检测PERV核心蛋白基因(gag)、多聚酶基因(pol)及囊膜基因(env)的存在与表达;同时,根据目前通用的env基因分型方法合成了三对用于分型检测的引物env-A、env-B、env-C.应用PCR、RT-PCR扩增的方法,对来自于中国实验小型猪外周血淋巴细胞的DNA和RNA样品进行了检测.结果在6个被检DNA样品中均检出了PERV特异性DNA的存在;同样,在被检RNA样品中均有PERV特异性RNA的表达,且所表达的PERV均为A型和B型,在所有样品中均未检出C型PERV的表达.结论初步表明中国实验小型猪中存在内源性反转录病毒序列,且能以mRNA的形式表达,这一结果为我国特有小型猪的开发、利用及其病毒安全性评价奠定了基础.     

应用PCR测定Cx43转基因小鼠的基因型

目的：应用聚合酶链反应(PCR)技术，检测Cx43(connexin 43)转基因小鼠的基因型。方法：采用CMV43转基因小鼠和Cx43剔除小鼠分别与野生型小鼠杂交繁殖，切取子代小鼠尾巴制备DNA，应用PCR技术扩增DNA，观察目的基因的阳性率。结果：CMV43转基因小鼠子代66个，dhfr PCR检测阳性率为31．8％。Cx43基因剔除小鼠子代21个，分别与Cx43野生型引物和Cx43剔除引物进行PCR，两者均阳性( ／ )12个，百分率为57．1％，前者阳性而后者阴性(杂合子 ／-)7个，百分率为33．3％，两者均阴性(纯合子-／-)2个，百分率为9．6％。野生型小鼠经Cx43野生型引物PCR检测结果均为阳性。结论：PCR技术用于Cx43转基因小鼠基因型的检测敏感度高，特异性强，易操作，可用作Cx43转基因小鼠心血管畸形模型研究的初选方法。