体外构建气管黏膜上皮组织的研究

目的:应用组织工程原理和方法在体外构建气管黏膜上皮组织.方法:将原代兔气管上皮细胞种植在铺有鼠尾胶原的小肠黏膜下层(SIS)上培养,在体外构建气管黏膜上皮组织,培养1 wk后行HE染色,对气管上皮细胞行免疫细胞学鉴定.结果:原代气管上皮细胞培养1 wk后增殖旺盛,10 d时上皮细胞分布范围更广. 将构建的气管黏膜上皮组织行HE染色,显示有气管黏膜上皮和SIS双层结构. 抗角蛋白单克隆抗体免疫细胞化学反应阳性显色率可达90%左右.结论:将铺有鼠尾胶原的SIS复合气管上皮细胞生长,成功的在体外构建出组织工程化的气管黏膜上皮组织.     

不同基质对兔气管纤毛上皮细胞贴壁生长的影响

目的比较几种不同培养基质对兔气管纤毛上皮细胞贴壁生长的影响,探讨兔气管纤毛上皮细胞体外培养最佳生长基质。方法用组织块法比较兔气管纤毛上皮细胞分别在新鲜配制鼠尾胶原、市售鼠尾胶原、多聚赖氨酸和明胶4种基质上的贴壁和生长状况。结果兔气管黏膜上皮组织在4种基质上的贴壁率分别为:新鲜配制胶原89.1%,市售胶原43.5%,多聚赖氨酸36.9%,明胶21.7%;贴壁组织的单细胞层最大生长半径分别为:新鲜配制胶原(1 432.2±383.2)μm,市售胶原(928.9±390.3)μm,多聚赖氨酸(889±229.2)μm,明胶(651±221.2)μm;纤毛摆动最大频率及持续时间分别为:新鲜配制胶原(10.0±1.5)Hz 11 d,市售胶原(8.5±0.6)Hz 5 d,多聚赖氨酸(8.9±0.5)Hz 3 d,明胶(5.9±0.3)Hz 2 d。扫描电镜下新鲜配制鼠尾胶原纤维成条索状,相互交织成网,利于组织贴壁和细胞生长。结论在常用的4种培养基质中,新鲜配制的鼠尾胶原是兔气管纤毛上皮细胞体外培养的最佳生长基质,是纤毛功能研究的可靠保证。     

风湿性心脏病人心瓣膜成纤维细胞的体外培养及其胶原合成

目的：观察风湿性心脏病人瓣膜成纤维细胞的胶原合成，为研究风湿性心脏病瓣膜纤维化的发病机制建立基础。方法：采用消化组织块培养法建立人二尖瓣和主脉瓣成纤维细胞体外培养方法，对５例风湿性心脏病人和５例尸检中除外心血管疾病和胶原系统疾病的二尖瓣和主动脉瓣成纤维细胞进行了体外培养，并用３Ｈ－脯氨酸测定瓣膜成纤维细胞的胶原合成。结果：二尖瓣和主动脉瓣的瓣膜成纤维细胞其形态、生长方式及胶原合成差异均不明显，风湿性心脏病瓣膜成纤维细胞的胶原合成明显高于对照组。结论：体外培养的风湿性心脏病人瓣膜成纤维细胞胶原合成明显增加     

利用胶原构建皮肤组织工程支架的研究

目的 利用胶原海绵膜构建皮肤组织工程支架。方法 从大鼠鼠尾肌腱中提取胶原。胶原和6-硫酸软骨素冷冻干燥，重度脱水及戊二醛交联后制得胶原海绵膜。将其行扫描电镜观察；并埋藏在Balb／c小鼠皮下，术后定期取出观察组织学变化。将成纤维细胞种植于该支架上。结果 构建的支架孔径均匀，孔径在50～100μm；具有良好的组织相容性，并逐渐降解。成纤维细胞于其上生长良好。结论 该支架适合成纤维细胞生长，可作为组织工程皮肤的支架。     

人眼睑组织来源的成纤维细胞作为饲养层细胞构建人口腔黏膜上皮细胞片层的研究

目的：探讨人眼睑组织来源的成纤维细胞作为饲养层细胞代替鼠源饲养层细胞在体外培养人口腔黏膜上皮细胞的可行性。方法：通过酶消化法从人眼睑组织中分离成纤维细胞传代培养，取P5代成纤维细胞通过丝裂霉素C方法制备饲养层细胞，将其制备成的饲养层细胞用来培养商品化人口腔黏膜上皮细胞。通过罗丹明染色观察其细胞克隆形成率；HE染色观察细胞片层的结构；免疫荧光检测特征蛋白P63、β1-integrin的表达。结果：人眼睑组织来源的成纤维细胞在体外具有较强的增殖能力，高表达成纤维细胞特异性标志性蛋白CD90，培养的人口腔黏膜上皮细胞呈克隆样生长，细胞克隆形成率约为2.2%，并将其构建成3～4层口腔黏膜细胞片层，且高表达上皮细胞标志物P63及β1-integrin。结论：人眼睑组织来源的成纤维细胞可以作为饲养层细胞构建人口腔黏膜上皮细胞片层，为临床应用提供一种新的人源化饲养层工具细胞。     

高脂饮食通过小肠上皮组织外泌体促进心脏纤维化

目的：研究高脂饮食通过小肠上皮组织外泌体对小鼠心脏成纤维细胞增殖、分化、胶原蛋白合成的影响。方法：分别提取正常饮食/高脂饮食小鼠小肠上皮组织外泌体,与小鼠原代心脏成纤维细胞共培养,PKH26标记外泌体,示踪观察心脏成纤维细胞对外泌体的摄取情况;对心脏成纤维细胞进行荧光定量PCR,观察增殖、分化、纤维化、炎症等基因表达;利用免疫荧光染色观察心脏成纤维细胞α平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscleactin,α-SMA）、Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达。结果：正常/高脂饮食小鼠小肠上皮组织外泌体均可被心脏成纤维细胞摄取,且两者摄取效率无差异。相比正常饮食组,高脂饮食小鼠小肠上皮组织外泌体可显著增加心脏成纤维细胞增殖分化、细胞外基质积聚、炎症等基因表达,合成α-SMA蛋白、Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白能力增强。结论：高脂饮食可以通过小肠上皮组织外泌体促进心脏成纤维细胞增殖、分化及胶原产生。     

应用骨髓干细胞和自制胶原-壳聚糖构建组织工程心瓣膜

目的探讨应用骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导分化的内皮细胞为种子细胞,以胶原-壳聚糖复合物为支架材料,运用组织工程学的原理和方法体外构建组织工程心脏瓣膜(tissue engineering heart valve,TEHV)的可行性。方法兔主动脉壁体外分离、培养、传代平滑肌细胞、成纤维细胞,将培养的成纤维细胞、平滑肌细胞与兔骨髓基质干细胞诱导分化的内皮细胞按顺序种植在预湿处理的胶原-壳聚糖复合支架上,通过组织学及倒置显微镜、扫描电镜观察内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞在支架上生长、增殖和基质分泌情况。结果 HE染色示内皮细胞能够在胶原-壳聚糖复合支架黏附、伸展、增殖,在TEHV表面长成连续的细胞层;扫描电子显微镜示TEHV表面光滑,细胞生长良好,细胞层完整,且瓣膜表面的内皮细胞具有合成和分泌前列环素(PGI2)的功能。结论以兔主动脉壁体外分离、培养、传代的平滑肌细胞、成纤维细胞和BMSCs诱导分化的内皮细胞为种子细胞,依次种植在胶原-壳聚糖复合支架上可以构建TEHV,且内皮细胞能够分泌PGI2。     

新生兔与成兔角膜缘上皮移植于纤维蛋白胶载体的实验研究

目的：利用组织工程技术体外重建角膜上皮组织，为重建角膜表面提供良好的移植材料和方法．方法：以等量凝血酶和纤维蛋白原作用生成的纤维蛋白胶为载体，分别种植新生兔和成兔角膜缘组织块．体外培养重建角膜上皮层．观察两组细胞的生长覆盖面积，t检验比较两组细胞的生长差异，并从生长特性、形态学特点及免疫细胞化学方面进行观察检测和比较。结果：两组兔角膜缘上皮细胞在纤维蛋白胶上黏附生长增殖，生长覆盖面积差异无统计学意义。体外培养7天左右即能较好地形成单层上皮细胞，2周左右形成的复层上皮细胞与纤维蛋白胶构成角膜上皮组织经检测与生理状态下的角膜上皮组织相近．结论：以纤维蛋白胶为载体、新生兔和成兔体外培养的角膜上皮组织片有些可作为眼表重建角膜上皮移植良好的来源之一。     

组织工程皮肤用真皮支架细胞相容性的比较研究

目的研究几种真皮支架的细胞相容性，为构建组织工程皮肤提供资料。方法取胶原海绵、明胶海绵、PEGA和PHBV共4种真皮支架，与小鼠成纤维细胞和ES源表皮样干细胞体外培养，观察前者对后者粘附率的影响，及对成纤维细胞增殖的影响，评价真皮支架的细胞相容性。结果成纤维细胞和ES源表皮样干细胞在4种支架材料上均能粘附存活，成纤维细胞能增殖，但在胶原海绵、PHBV和PLGA支架上的增殖率明显高于明胶海绵。结论几种真皮支架的细胞相容性较好，可用于新型组织工程皮肤的构建。     

利用人气道基底细胞体外构建类气管球

目的:利用人气道基底细胞体外培养类气管球.方法:利用河南省人民医院肺移植术中弃用的供肺分离并培养人气道基底细胞、肺成纤维细胞.将气道基底细胞和肺成纤维细胞1:1混合,重悬于基质胶,用EpiX Base培养基培养,以单独培养的基底细胞或肺成纤维细胞为对照.观察是否形成类气管球及不同时间点类气管球的形态,并采用免疫荧光染色...     

兔角膜上皮——基质层组织工程方法三维重建

目的：利用细胞生物学和工程学原理在体外重建角膜上皮和基质层,提供与正常生理结构相似的模型。方法：兔角膜上皮和基质细胞原代并传代培养,免疫组化方法对细胞进行鉴定,以鼠尾为原料提取I型胶原溶液,重建角膜的基质和上皮,上皮实行气-液界面培养,倒置显微镜观察细胞形态。36h、72h、7d、14d、20d重建组织常规病理切片。结果：倒置显微镜下角膜成纤维细胞呈梭形三维生长,上皮细胞多层生长。组织病理检查显示重建的角膜组织结构类似于天然角膜组织。结论：本实验可为角膜的病理生理、毒理、药理以及基因表达等研究提供有利的模型和工具。     

以纤维蛋白为基质网架的组织工程角膜上皮的构建

目的：应用组织工程技术以纤维蛋白为基质网架、角膜缘干细胞为种子细胞构建组织工程角膜上皮，为角膜上皮移植提供新的移植材料。方法：将20 g•L^-1的纤维蛋白原溶液和含有10 U•mL^-1凝血酶的催化剂溶液混合构成纤维蛋白基质网架，检测支架材料的一般结构和超微结构；取2 mm×2 mm角膜缘组织，胰蛋白酶消化后移至纤维蛋白胶上培养，观察角膜上皮干细胞的生长情况，2周后进行形态学、超微结构和免疫组织化学观察。结果：纤维蛋白基质网架柔软有伸拉性，孔径70～108 μm，平均三维空孔率为70.4%；扫描电镜下呈多层次网络状；接种36 h后，细胞从组织块边缘迁移，7 d后细胞几乎铺满整个培养板孔底，14 d左右细胞与纤维蛋白胶体形成复合植片。透射电镜下观察仍维持上皮细胞特有的超微结构特征。抗细胞角蛋白K3单克隆抗体AE5和抗p63的单克隆抗体4A4免疫组织化学染色均为阳性。 结论：纤维蛋白可作为角膜上皮干细胞移植的良好支架材料，可为组织工程角膜上皮提供新的移植材料。     

组织工程的发展与主要研究方向

该文简要回顾了组织工程的建立与发展历史，重点讨论组织工程中的种子细胞、生物材料与组织构建等研究现状．对中国组织工程的建立与研究成果作了概括性总结。     

去细胞组织工程心脏瓣膜构建的实验研究

目的:探讨人脐静脉内皮细胞(HUVECs)种植在去细胞瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法:测定瓣叶去细胞前、后的生物力学性能;观察去细胞瓣叶上内皮细胞生长情况。结果:瓣叶去细胞可获得完整无细胞的纤维支架,瓣叶去细胞前、后的生物力学性能无差异;内皮细胞在去细胞瓣叶表面生长,形成一层基本连续的细胞层。结论:去细胞瓣叶组织是一种良好的纤维支架,可以用于构建组织工程瓣膜;内皮细胞种植在去细胞瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜是可行的。     

体外分离培养的人尿道黏膜上皮细胞的生物学特性

目的 探讨体外分离培养的人尿道黏膜上皮细胞的生物学特性,为构建组织工程尿道提供种子细胞.方法 取尿道下裂患者尿道黏膜,经消化离心后,接种于培养基中连续培养,观察细胞形态变化及生长、增殖过程,并绘制生长曲线;对细胞进行常规冻存和复苏;应用免疫细胞化学技术进行角蛋白染色的鉴定.结论 体外培养的细胞呈铺路石样外观,可传至8代;可进行常规冻存和复苏;角蛋白免疫细胞化学染色呈阳性.结论人尿道黏膜上皮细胞的体外连续培养及扩增技术被建立,本实验培养的细胞可用于构建组织工程尿道.     

肺组织瓣包埋金属支架重建气管、食管的动物实验研究

目的 用犬的自体肺组织瓣包埋金属支架重建气管、食管,探索应用肺组织瓣重建气管、食管的可行性.方法 24只杂种犬,分别制成气管、食管缺损模型,用自体肺组织瓣内衬金属支架分别修补.定期处死实验犬,行大体观察、组织学观察和影像学检查.结果 18只实验犬存活超过2周以上.肺组织瓣与气管、食管紧密结合,未发生缺血坏死,术后12周被走行一致的胶原纤维替代.肺组织瓣表面有新生上皮爬行,且爬行较快.结论 自体肺组织瓣与气管、食管上皮细胞有较好的相容性,能为气管、食管上皮的爬行提供良好的载体.

Abstract：

Objective To study the feasibility of applying autogenous pulmonary tissue flap with alloy stent to correct the defects of trachea and esophagus. Methods Twenty-four dogs were divided into tracheal and esophageal groups. Bronchus was ligated to prepare a pulmonary flap. And a defect of 3 -4 cm long and 1/2-2/3 perimeter was made in tracheal or esophageal wall. Pulmonary arteries and veins were protected. Then the pulmonary gas was emitted to create a pulmonary tissue flap. The defect was repaired with a pulmonary flap with a self-expanded stent inside. The gross appearance, histological appearance, CT and barium X-ray films were observed at Weeks 2, 4, 6 and 8 post-operation. Results Eighteen experimental dogs survived over 2 weeks. Anatomotic leak was the main cause of death. Two dogs died of perforation of ulcer in esophageal group. Reliable cicatrisation was observed between the pulmonary tissue flap and damage area. A quick growth of new tracheal and esophageal epithelium was observed from periphery area to central area. During the first 2 weeks, a little epithelization was observed at free edge of anastomosis equivalent to 1 - 2 layers of new epithelial cells. At weeks 4-6 post-operation, the internal surface of defect was covered with 3 - 5 layers of epithelial cells. At Weeks 8-10 post-operation, the luminal surface was covered with 6 - 8 layers of stratified epithelial cells. More ulcers could be observed on the surface of pulmonary tissue flap in esophageal group. In pulmonary flap, massive fibrous tissue proliferated and fibroblasts were active, but no necrosis occurred. CT and barium X-ray showed no obstruction in anastomotic stoma. Conclusion With an excellent compatibility with epithelial cells of trachea and esophagus, the autogenous pulmonary tissue flap can support the mucosal crawl in the defect of trachea and esophagus. When combined with alloy stent, it may be a choice procedure for reconstructing the defect of trachea and esophagus.     

猪主动脉组织工程瓣膜制备的初步研究

目的：初步探索猪主动脉组织工程瓣膜的制备方法。方法：经胰酶－EDTA、表面活性剂、核酸酶处理，去除猪主动脉瓣的细胞成分，测定瓣叶去细胞前、后的生物力学特性，并在其表面种植BAECs。结果：猪主动脉瓣膜中的细胞成分能完全被去除，获得完整无细胞的纤维网状支架，瓣叶去细胞前、后的断裂强度和断裂伸长率无明显变化，瓣膜近端存留的主动脉壁中的细胞一半被去除；种植的BAECs在去细胞瓣膜表面、主动脉内膜形成一连续的细胞层。结论：猪主动脉瓣膜去细胞后获得的纤维支架适宜血管内皮细胞的生长，可以用来构建组织工程瓣膜。     

共培养大鼠睾丸体细胞组织工程技术构建雄激素分泌组织

目的：探讨应用组织工程技术体内外构建具有一定形态和睾酮分泌功能组织的可行性。方法：雄性Wister大鼠,无菌切取双侧睾丸,制备去势及移植鼠动物模型。睾丸去包膜,剪碎,胶原酶消化,经差速贴壁或直接混合共培养方法,分别获取睾丸间质细胞（Leydig细胞）和共培养的睾丸多种体细胞,两类细胞分别与可降解生物材料聚羟基乙酸（PGA）纤维复合并进行体外培养,光、电镜观察体外组织形成过程,定期检测培养液内睾酮分泌水平。取体外培养7d细胞-材料复合物,分别移植于去势鼠睾丸鞘膜腔或大网膜内（n=6）,不同时间点取材,通过大体观察、组织学染色和免疫细胞化学方法,检测移植鼠体内雄激素分泌组织的形成过程及血睾酮水平。结果：两类细胞均与PGA具有良好的亲和性,体外可形成具有一定睾酮分泌功能的细胞-材料复合物,体内移植2个月后,两类细胞-材料复合物在大网膜和睾丸鞘膜内均可形成具有一定形态的雄激素分泌组织,再生组织具有良好的血管化。血睾酮检测及统计分析结果表明,移植6周后,单纯Leydig细胞组血睾酮水平为（0．604±0．04）μg/L,共培养细胞组血睾酮水平为（0．854±0．03）μg／L,均明显高于单纯去势鼠血睾酮水平（0．564±0．05）μg/L（P〈0．01）,两组移植鼠相比,共培养细胞移植组血睾酮水平明显高于单纯Leydig细胞移植组（P〈0．01）。结论：以共培养睾丸体细胞作为种子细胞在体内外构建雄激素分泌组织具有可行性,共培养睾丸内体细胞是雄激素分泌组织构建的良好种子细胞。     

兔眼晶体上皮细胞体外培养的研究

目的：建立兔晶体上皮细胞体外培养模型,方法：采用组织块培养法,对兔眼晶体前囊膜进行培养,并利用形态学检查方法和兔疫组化技术鉴定。结果：组织块接种24h后即可见细胞生长,且保持上皮细胞形态,1周左右细胞融合,在体外可传到7例,5代以后细胞呈成纤维细胞状,α-晶体蛋白间接免疫荧光试验呈阳性反应,结论：成功地建立晶体上皮细胞体外培养模型,可用于后发 白内障发病机制的研究。     

自体内皮祖细胞促进组织工程骨血管化的体内外实验研究

目的：探讨自体内皮祖细胞（EPCs）在体内、外促进组织工程骨血管化的能力。方法将兔自体外周血 EPCs 及骨髓间充质干细胞（BMSCs）按联合培养时细胞增殖率最大时配比（EPCs ∶ BMSCs ＝1∶2）体外培养（联合培养组）,在体外采用实时定量 PCR 方法检测成骨相关细胞因子 Osteonectin 、Osteopotin 、Col-1及成血管相关细胞因子血管内皮生长因子（VEGF）表达,于培养3、7、14 d 观察表达量的变化并与单纯 EPCs 及 BMSCs 组比较;将单纯 EPCs 、BMSCs 及联合培养组的组织工程骨移植到兔四肢肌袋内,于移植后2、4、8周观察组织工程骨生长情况,同时制成组织切片行 CD34、CD105、ZO-1免疫组织化学染色,采用 Im-age-Pro plus 6．0图像分析软件,测量光密度值,比较3组工程骨表达量变化。结果3、7、14 d Osteonectin 、Osteopotin 、Col-1、VEGF 各组表达均逐渐增高,其中联合培养组增高最明显,且各时间点表达量最高（P＜0．01）;2、4、8周兔四肢肌袋内的组织工程骨中联合培养组细胞复合的工程骨随时间延长成骨增加最明显,新生血管长入最多,免疫组织化学显示 CD34、CD105、ZO-1表达最明显（P＜0．01）。结论自体 EPCs 与 BMSCs 相互作用,在体内、体外均可促进组织工程骨血管化。