放射性碘标记转铁蛋白体外示踪脊髓内移植的间充质干细胞

目的:检测间充质干细胞转铁蛋白受体(TfR)在体外培养及移植入脊髓后的表达,进行体外放射性核素示踪研究.方法:从胎儿血分离培养人间充质干细胞,应用流式细胞分析、免疫荧光染色和受体放射性分析鉴定转铁蛋白受体的表达,用放射性碘(125I)标记的铁饱和转铁蛋白[125I-Tf(Fe)2 ]作为示踪剂,进行体外放射自显影,示踪移植于兔正常脊髓内的间充质干细胞,并对125I-Tf(Fe)2在脊髓实质的弥散动力学进行研究.结果:流式细胞分析、免疫荧光染色证实体外培养的人间充质干细胞表达转铁蛋白受体, 受体放射性分析表明125I-Tf(Fe)2与其受体结合的平衡解离常数(KD)为(0.98±0.12) nmol/L, 最大结合位点(Bmax)为每个细胞(107 702±6 226)个.免疫荧光染色结果表明间充质干细胞移植于脊髓2 d后转铁蛋白受体表达,10 d后不表达,移植2 d后以125I-Tf(Fe)2为示踪剂进行脊髓切片体外放射自显影,获得移植细胞阳性影像.离体脊髓在125I-Tf(Fe)2溶液中体外孵育,16 h后 125I-Tf(Fe)2弥散入全部脊髓实质.结论:125I-Tf(Fe)2作为示踪剂可以在体外示踪到脊髓内移植2 d后的间充质干细胞,TfR和125I-Tf(Fe)2是应用核医学影像进行间充质干细胞移植初期活体示踪可能的生物学标志和示踪剂.     

永生化神经前体细胞系hNPC-TERT体内外D2受体的表达

目的 验证神经前体细胞系hNPC-TERT移植入动物中枢神经系统前后多巴胺D2受体的表达.方法 免疫荧光定性鉴定体外培养hNPC-TERT的D2受体表达,并进一步应用放射受体分析方法测定hNPC-TERT细胞表达D2受体数量.实验组兔脊髓内移植3×106 hNPC-TERT,对照组动物脊髓内移植同等数量HeLa细胞,移植后第7天,以11C-raclopride为示踪剂,移植动物活体或处死动物剥离出脊髓进行D2受体PET显像,并行移植段脊髓切片免疫荧光染色,验证hNPC-TERT在体内的D2受体表达.结果 免疫荧光和放射受体分析显示体外培养hNPC-TERT细胞表面表达大量D2受体(Bmax=8×104).移植入兔脊髓后,D2受体显像显示移植部位有明显的放射性浓聚,经ROI半定量分析,与对照组差异显著(P=0.0017),离体脊髓PET显像、组织免疫荧光进一步证实了活体显像结果.结论 神经前体细胞系hNPC-TERT高表达多巴胺D2受体,并且在移植入体内后仍保持该特性,具有移植治疗帕金森综合征等D2受体缺乏性疾病的潜力.     

以血管生成为靶点的肿瘤核素显像及治疗的实验研究

目的以荷人膀胱癌、胆管癌小鼠为模型,研究血管内皮生长因子(VEGF)及其受体KDR、整合素αvβ3受体在肿瘤的核素显像及治疗中的应用.方法①复制荷人膀胱癌小鼠模型,观察 131I-anti-VEGF的放射免疫显像;②将荷瘤小鼠分为实验组、非标记抗体对照组及空白对照组,探讨 131I-anti-KDR的放射免疫治疗;③建立荷人胆管癌小鼠模型,观察 125I-RGD-4CY的受体显像.结果①免疫组化结果示膀胱癌组织高表达VEGF及KDR蛋白,而正常组织极低水平表达;② 131I-anti-VEGF、 131I-anti-KDR及 125I-RGD-4CY在各组织中均具有较高的T/NT;③ 131I-anti-KDR的放射免疫治疗示实验组与非标记抗体对照组均能明显抑制膀胱癌的生长,但前者作用快且抑制率明显高于后者;④放射自显影示 125I-RGD-4CY在肿瘤组织中浓聚影最强,肺、颈部及其它软组织呈低水平分布.结论 131I- anti-VEGF、 131I-anti-KDR可较好地显示膀胱癌,并明显抑制其生长, 125I-RGD-4CY可望成为一有效的肿瘤αvβ3受体显像剂.     

主动靶向骨髓间充质干细胞的多模态分子探针的构建及验证

目的 构建人转铁蛋白(Tf)介导的磁性-近红外荧光(NIRF)分子探针,探讨其主动靶向标记人骨髓间充质干细胞(hMSCs)并用于多模态成像的可行性.方法 Tf与cy5.5、超微超顺磁性氧化铁(IO)连接,构建分子探针Tf-cy5.5-IO,确定连接效率并表征.利用人血清白蛋白(HSA)构建对照粒子HSA-cy5.5-IO.将hMSCs分为未标记组(A)、靶向探针组(B)、HSA对照组(C)和竞争实验组(D)4组,并以表达人转铁蛋白受体(hTfR)的肿瘤细胞(HeLa)作为阳性对照,进行激光共聚焦、铁含量、流式细胞仪及透射电镜检测.每组2×105个细胞行磁共振(MRI)和NIRF成像,定量检测R2值和平均荧光强度值(AI)变化率.结果 IO、Tf、cy5.5成功连接,摩尔比1∶2.89∶7.89,整体粒径(23.4 ±2.4)nm.激光共聚焦扫描示Tf-cy5.5-IO快速进入hMSCs和HeLa细胞内,其分布与人转铁蛋白受体(hTfR)表达位置一致.B组细胞铁含量和AI均明显高于其他组(均P＜0.01),探针对hTfR具主动靶向性.MRI和NIRF成像显示Tf-cy5.5-IO使hMSCs T2WI信号减低,NIRF成像荧光强度增加,R2和AI值的增高均较其他组明显(P＜0.05).结论 Tf-cy5.5-IO特异性识别hTfR,通过MRI和NIRF可实现hMSCs多模态主动靶向成像.     

免疫组化联合放射自显影术观察骨髓间充质干细胞在肌营养不良鼠表达抗肌萎缩蛋白*

目的：用免疫组化联合放射自显影术观察移植骨髓间充质干细胞表达dystrophin蛋白情况。方法：用3H-TdR标记的骨髓间充质干细胞经静脉移植肌营养不良鼠（mdx）,在1、2、3、4月取小鼠腓肠肌肉,先进行免疫组化染色,再将标本立即进行放射自显影,3月后再将组织HE染色,显微镜下观察干细胞是否表达了dystrophin蛋白。同时用激光共聚焦显微镜（LSCM）观察BrdU标记的间充质干细胞移植mdx鼠后的dystrophin蛋白表达为比较标准。结果：两法均观察到移植的干细胞表达了dystrophin蛋白,且观察到的阳性细胞数比较无统计学意义;干细胞表达dystrophin蛋白随着时间有逐渐增高趋势。结论：免疫组化联合放射自显影技术可以用于对干细胞移植后蛋白表达的示踪观察,干细胞移植对肌营养不良具有治疗前景。     

重组人纤溶酶原Kringle5的标记及其肿瘤显像

目的探讨放射性碘标记纤溶酶原Kringle5(K5)用于肿瘤显像的可行性.方法采用基因工程方法制备的重组人纤溶酶原Kringle5(rhK5),以Iodogen法制备125Ⅰ-rhK5和125Ⅰ-rhK5,进行荷瘤裸鼠体内分布和肿瘤显像研究.结果125Ⅰ-rhK5和131Ⅰ-rhK5的标记率为86%和84%,放化纯度为96%和95%.竞争结合实验表明,rhK5标记后其生物活性没有改变;荷瘤裸鼠体内分布显示,12 h肿瘤肌肉组织比可达4.94±0.89;131Ⅰ-rhK5肿瘤显像示肿瘤部位放射性浓聚随时间逐渐增加,3 h可见肿瘤清晰显影.结论Iodogen法制备125Ⅰ-rhK5和131Ⅰ-rhK5纯度高、稳定性好.131Ⅰ-rhK5可进行肿瘤的显像,为肿瘤的显像和治疗奠定了基础.     

131I标记多肽K237用于前列腺癌荷瘤裸鼠显像的实验研究

目的研究将放射性核素131I标记多肽K237用于前列腺癌荷瘤裸鼠显像的可行性。方法按Iodogen法用131I标记多肽K237,用薄层层析法(TLC)测定标记率及放射化学纯度,经Sephadex G25柱凝胶过滤法分离纯化,获得标记率大于95%的131I-K237注射液。体外培养前列腺癌LNCap细胞株,构建LNCap荷瘤裸鼠动物模型,经尾静脉注射131I-K237,于特定时间处死、取肿瘤及主要脏器,测定各组织的放射性百分注射剂量率,研究荷瘤裸鼠体内131I-K237的生物分布。对荷瘤裸鼠尾静脉注射5.55Mbq131I-K237 1、2、4和8h后,分别用SPECT/CT仪显像,考察最佳显像时间。结果131I标记多肽K237的标记率为(73.7±3.2)%,经Sephadex G25柱分离纯化后,放射化学纯度为(96.7±0.6)%;LNCap前列腺癌荷瘤裸鼠体内131I-K237分布显示:30min和1、2、4、8、12、24h的T/NT比值分别是2.08和2.28、2.45、2.68、3.04、3.97、4.41。荷瘤裸鼠显像结果表明,1h时即可见肿瘤隐约显影,4h肿瘤显影最清晰。结论131I-K237的制备与显像操作简易,用于前列腺癌荷瘤裸鼠显像效果理想,有望成为一种新的针对前列腺癌的肿瘤显像剂。     

抗HIF-1α肺腺癌人源单链抗体的制备和放射免疫显像

目的 利用噬菌体抗体库技术制备特异性的抗缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor,HIF-1α)肺腺癌人源单链抗体(scFv),并用于荷人肺腺癌裸鼠体内放射免疫显像(radioimmunoimaging,RII)研究.方法 利用噬菌体抗体库技术筛选特异性抗HIF-1α肺腺癌人源scFv,并将其感染大肠杆菌HB2151,进行scFv的可溶性表达.接种肺腺癌A549细胞复制荷瘤裸鼠模型,尾静脉注射131I标记可溶scFv,于注射后24、48、72 、120 h进行SPECT平面静态检查,观察肿瘤内放射性浓聚情况,用感兴趣区(region of interest,ROI)技术分析T/NT值,取平面静态检查肿瘤显影清晰时进行SPECT/CT图像融合.结果 经鉴定证实制备出特异性的抗HIF-1α肺腺癌人源scFv,荷瘤裸鼠体内RII结果 显示131I-可溶scFv可以选择性地积聚于肿瘤组织,肿瘤区放射性浓聚、T/NT值均在72 h达到高峰,利用ROI技术得到的T/NT值此时最大可达3 19.72 h时融合图像肿瘤显像良好,图像清晰.结论 成功制备特异性抗HIF-1α肺腺癌人源scFv,131I标记后荷人肺腺癌裸鼠RII肿瘤显影良好.     

超顺磁性氧化铁标记脂肪干细胞移植入大鼠心脏后的活体磁共振示踪成像

目的 探讨超顺磁性氧化铁(SPIO)标记脂肪干细胞(ADSCs)移植入大鼠心脏后的活体磁共振成像(MRI)示踪的可行性.方法 使用左旋多聚赖氨酸-SPIO共培养方式标记ADSCs.采用普鲁士蓝染色及透射电镜观察细胞内铁颗粒,台盼兰染色检测细胞活力,并对标记的干细胞进行体外MRI成像.将经过SPIO标记的干细胞移植入正常大鼠心脏,使用MRI进行活体成像观察并与病理结果进行对照分析.结果 普鲁士蓝染色于ADSCs胞浆内可见蓝色颗粒,电镜检查见铁颗粒位于内涵体/溶酶体内;台盼兰染色检测细胞活力实验组与对照组差异无显著性(P>0.05);标记了SPIO的干细胞体外MRI成像时,实验组信号显著低于阴性对照组和空白对照组;标记后的干细胞移植到心脏后,MRI显示细胞移植区域信号缺失,对应区域病理切片普鲁士蓝染色可见胞浆内染色阳性的细胞.结论 MRI可以对移植入心脏的经SPIO标记的干细胞进行无创、动态的活体示踪成像,有助于了解移植细胞在体内的存活及迁徙情况.     

SPECT对干细胞移植后梗死心肌细胞活性及心肌灌注的评价

目的 :应用SPECT观察干细胞移植后犬急性梗死心肌内血流灌注及心肌细胞活性的改变情况。方法 :取12只成年犬骨骼肌 ,分离干细胞并培养、传代、标记。将DAPI标记的干细胞 ,自左冠状动脉前降支注入急性心肌梗死动物模型缺血心肌中。 2 ,4 ,8周后自前肢浅静脉注射99Tcm-MIBI 2 0mCi,6 0min后显像 ,进行断层采集 ,范围从右前斜 4 5°到左后斜 4 5°,共 180°。结果 :实验前各实验动物SPECT心肌断层显像 ,所有断层均见不到显影的放射性缺损 ;实验组SPECT心肌断层显像与对照组比较 ,所有断层均见不到显影的放射性缺损 ,只可见到显影的稀疏区域 ,心肌血流灌注及细胞活性得到明显改善 ;实验组心肌灌注显像评分与对照组比较差异有显著性 (P <0 .0 5 )。结论 :干细胞移植可使缺血心肌的血流灌注及细胞活性得到明显改善 ;门控99Tcm-MIBISPECT心肌灌注显像操作简便 ,安全无创 ,结果准确可靠 ,能直观地反映缺血心肌内细胞活性及血流灌注的情况。     

多巴胺D2受体正电子发射计算机断层显像示踪兔脊髓内移植的神经前体细胞

目的探索脊髓内移植神经前体细胞的无创性活体示踪方法。方法培养人神经前体细胞系hNPC-TERT,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫荧光染色、放射性配基结合实验检测hNPC-TERT多巴胺D2受体在体内外的表达,移植于兔正常脊髓后,以D2受体拮抗剂^11C-raclopride作为示踪剂,正电子发射计算机断层成像（PET）显像示踪兔活体脊髓和离体脊髓内移植的hNPC-TERT。HeLa细胞移植于脊髓作为对照组。结果体外培养和脊髓内移植第2天的hNPC-TERT表达D2受体。静脉注射^11C-raclopride后PET显像,兔活体脊髓和离体脊髓内hNPC-TERT移植部位放射性积聚,对照组仅见本底影像。PET图像中,hNPC-TERT移植部位标准化摄取值明显高于Hela细胞移植部位（P〈0．05）。离体脊髓放射性剖面曲线分析及脊髓切片免疫荧光染色进一步证实了PET显像结果。结论以^11-raclopride为示踪剂,PET显像可以示踪到脊髓内移植第2天的人神经前体细胞系HNPC-TERT。提供了一种以特异性表面标志为靶点进行PET显像的移植干细胞活体示踪方法。     

骨髓间充质干细胞移植修复大鼠半横断脊髓损伤

目的探讨WHBE兔用于热原检查试验适用性。方法按照《中国药典》2005年版中对热原检测的要求,对WHBE兔进行测温。结果WHBE兔筛选一次性合格率为74．91％,与日本大耳白兔相当,但略高于普通级新西兰兔,且WHBE兔初筛体温分布频率呈正态分布,以38．5-39．5℃居多,且体重大小对WHBE兔合格率影响不明显。结论WHBE兔体温稳定,重复性好,适合用于热原检查试验。     

兔骨髓间充质干细胞自体移植治疗急性心肌梗塞

目的 :了解骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)在缺血心肌中转化为心肌细胞并改善心功能的可行性。方法 :结扎兔左前降支制作急性心肌梗塞 (acutemyocardiuminfarction ,AMI)模型 ,骨穿抽取骨髓 ,分离、培养、扩增骨髓间充质干细胞。术后 2周进行心肌梗塞瘢痕处移植 5 溴脱氧尿嘧啶 (Bromodeoxyuridine,Br dU)标记的骨髓间充质干细胞 ,对照组注射培养基。AMI术前、AMI术后 3d及移植后 4周做超声心动图检测心功能 ,移植后 4周用导管检查法测左室压力变化 ,随后处死动物取左室标本切片 ,采用免疫荧光方法鉴定植入细胞。结果 :细胞移植组左室切片中可见BrdU染色阳性细胞即植入细胞 ,对照组未见BrdU染色阳性细胞。超声心动图检查证实MSCs移植后 4周左室收缩末期直径 (LVESD)、舒张末期直径 (LVEDD)均小于对照组 (分别为P <0 .0 1及P <0 .0 5 ) ,小轴缩短率 (△D % )、射血分数 (EF)均大于对照组 (均为P <0 .0 1 )。导管测压显示MSCs移植组左室舒张末期压 (LVEDP)低于对照组、左室压上升及下降最大速率 (±dp/dt)高于对照组 (均为P <0 .0 1 )。 结论 :缺血心肌内注射骨髓间充质干细胞可依赖组织微环境转化为心肌细胞修复梗塞心肌 ,显著改善心功能 ,可用于心肌梗塞的治疗。     

人脐带间充质干细胞在脊髓损伤修复中的研究进展

脊髓损伤发病率和致残率高,至今尚无完全修复损伤脊髓的治疗方法。随着干细胞移植技术的发展,有望从根本上修复损伤的脊髓。而在所有干细胞中,人脐带间充质干细胞可能是最佳的移植选择。动物研究已证实人脐带间充质干细胞具有巨大的脊髓损伤修复潜力,但临床转化并不顺利。本文将着重讨论人脐带间充质干细胞对脊髓损伤的神经修复机制,以及临床最佳移植途径、剂量、时机和临床安全性、有效性。     

人胎盘微绒毛膜的制备及其转铁蛋白受体研究

Human placenta microvillous membrane (PMM) was prepared by differential centrifugation and by sucrose gradient centrifugation, and the transferrin receptor (TfR) was studied using the receptor radioassay with 125I-transferrin as a radioligand. The factors affecting ligand-receptor binding reaction and the characteristics of TfR were also studied. The result showed that there was no significant differences (P > 0.1) in specific binding rates of 125I-transferrin to its receptor between the two membrane preparations, indicating that both of them could be used for TfR analysis, but the method of differential centrifugation was more simple and less time consuming. The study of TfR in sixty cases showed that the TfR binding sites on PMM and Bmax were 3.53 +/- 1.98 x 10(12) sites/mg membrane protein and 6.33 +/- 4.21 x 10(-12) mol/mg membrane protein, respectively. The Kd was 4.95 +/- 3.39 x 10(-9) mol/L, and the highest specific binding was 26% with nonspecific binding less than 3%. The conditions for ligand-receptor binding reaction were optimized when the concentrations of membrane protein and the 125I-transferrin in each test tube were 50 micrograms and 50,000 cpm (specific radioactivity being 2109 kBq/micrograms transferrin) respectively the incubation time was 30 min, and the concentration of polyethylene glycol added for separating B/F was 12% (W/V). transferrin binding to its receptor was characterized by high affinity, high specificity and being saturated.     

自体骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤疗效观察

目的：总结自体骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的疗效。方法：对16例脊髓损伤患者行自体骨髓间充质干细胞移植的恢复情况进行回顾性分析。结果：16例脊髓伤患者术后ASIA评分的平均数较术前提高,其中10例出现运动、感觉方面不同程度的改善;6例出现不同程度感觉方面的改善。患者术后均顺利出院,未出现明显毒性反应。结论：脊髓损伤患者进行自体骨髓间充质干细胞移植治疗安全有效。     

Smad7转染人骨髓间充质干细胞的初步实验研究

目的：将 Smad7转染到人骨髓间充质干细胞（BMMSC）,并进行绿色荧光标记,将其植入兔青光眼手术模型,观察BMMSC 存活情况。方法采用 BP 反应和 LR 反应,将绿色荧光标记的 Smad7基因片段通过噬菌体插入 BMMSC 中,通过集落筛选,选出阳性表达细胞株。15只新西兰大耳白兔行小梁切除,局部予以 BMMSC,观察细胞存活情况。结果 BMMSC 的Smad7表达稳定,绿色荧光标记成功。BMMSC 在兔活体小梁存活,荧光表达满意,眼压稳定。结论绿色荧光标记的 Smad7能稳定转染到 BMMSC,在兔小梁切除术模型表达稳定。     

骨髓间充质干细胞移植对斑块内HIF-1α、VEGF的影响

目的观察缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管生长因子(VEGF)在动脉粥样硬化(AS)斑块中的表达,探讨骨髓间充质干细胞移植后HIF-1α、VEGF与斑块内血管形成的关系。方法 36只健康雄性新西兰大白兔随机分为A组(骨髓间充质干细胞移植组)、B组(假手术组:0.9%氯化钠注射液注射组)、C组(空白对照组)。A组造膜成功后耳缘静脉注射同种异体来源的骨髓间充质干细胞,B组给予等量0.9%氯化钠注射液注射,C组不做任何处理。分别在基线水平、移植前、后测血脂、炎症指标、易损斑块内新生血管参数。结果移植后A组血清TC、TG水平较对照组明显升高(P<0.05),RAAPIs、I/M明显高于B组(P<0.05),微血管密度(MVD)明显高于B组和C组,HIF-1α、VEGF、MVD均高于B组(P<0.05)。结论骨髓间充质干细胞移植后可增加VEGF的表达,VEGF可协同HIF-1α促进As斑块内血管生成,从而增加斑块的不稳定性。