C基因截短的HBV复制与包装

目的 探讨C基因截短型HBV变异体的复制与包装。方法 采用分子克隆、人工定点突变等技术构建C基因截短型HBV变异体质粒，用脂质体法转染HepG2细胞，提取细胞内及培养上清液中DNA分别进行Southem杂交，PCR及实时定量荧光PCR分析。结果 经DNA测序及酶切鉴定证实C基因截短型HBV质粒载体构建成功；C基因截短型HBV为复制缺损型，与辅助质粒共转染HepG2细胞，可在细胞内及培养上清液中检测到HBV各种DNA构型；DNA定量分析提示C基因截短型HBV的包装效率较野生型HBV提高3～40倍。结论 C基因截短型HBV变异体为复制缺损型，单独转染后不能在肝细胞内包装与复制，但在缺失包装信号ε的相应辅助病毒辅助下可有效复制并包装成子代病毒颗粒分泌到胞外，且包装效率大大提高。     

乙型肝炎病毒S基因变异的研究进展

本文对血清ＨＢｓＡｇ阴性与乙型肝炎病毒Ｓ基因突变的关系及Ｓ基因突变与ＨＢＶ免疫逃脱等问题进行了综述。     

乙型肝炎病毒C基因调节序列变异分析

ＨＢＶＣ基因上游约 2 0 0ｂｐ序列(ｎｔ 16 0 0～ｎｔ 185 0 )是重要ＨＢＶ基因调控区。Ｔ 176 2Ａ 176 4(ｎｔ 176 4Ａ→Ｔ ,ｎｔ 176 4Ｇ→Ａ ,)变异在慢性ＨＢＶ感染者是变异的热点。为了解我国ＨＢＶ流行株Ｃ基因调节序列及变异情况 ,分别对 7例慢性无症状ＨＢＶ携带者和 7例亚急性重症乙型肝炎患者ＨＢＶＣＰ区序列进行了分析。1　研究对象　 7例慢性无症状ＨＢＶ携带者 (ＡｓＣ) (3例来自广东地区 ,4例自东北地区 )、7例亚急性重症乙型肝炎患者 (ＦＨ) (为我科 1993～ 1996年间收治的住院患者 )。酶联免疫法检测ＨＢＶ血清标志物。2…     

乙型肝炎病毒mRNA转录后剪接加工的研究进展

据统计,全世界乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的携带者可达两亿人。在我国,它是导致肝炎、肝硬化、肝癌的主要原因。然而,到目前为止,ＨＢＶ的某些遗传特性及转录后调控的分子生物学机制尚不十分清楚。本文试就ＨＢＶ ｍＲＮＡ转录后剪接加工的机制、类型、及可能的生物学作用作一综述。１ＨＢＶ基因组及其复制与表达 ＨＢＶ基因组由一个约３．２ｋｂ的双链环形ＤＮＡ组成,双链长度不对称,全长的一链因与病毒ｍＲＮＡ互补,定为负链,较短一链定为正链。正链仅５’端固定,长度为负链的５０％～１００％,其３’端位置不定,因而在病毒群体中…     

重型乙型肝炎病人中乙型肝炎病毒C基因启动子变？…

目的 了解重型乙型肝炎（乙肝）病人血清乙肝病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ Ｃ基因启动子（ＣＰ）的变异。方法 对用聚合酶链反应（ＰＣＲ）法扩增的血清ＨＢＶ ＤＮＡ直接测序。结果 ７例亚急性重型肝炎病人的ＨＢＶ分离株ＣＰ区分别有２￣１２个替代变异,１例病人有１１ｂｐ的碱基插入。ＣＰ变异主要发生于ＣＰ的第１和第２个ＡＴ丰富,ｎｔｌ７６２和ｎｔｌ７６４的替代变异见于７例亚急性重型肝炎病人的４例中,是ＣＰ变异的热点,     

乙型肝炎病毒C基因启动子区准种与变异特点的研究

目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)C基因启动子区难种与变异的特点。方法 以中国株HBV基因序列为依据，设计特异性聚合酶链反应(PCR)引物，自3例慢性HBV感染患者外周血血清中扩增HBVCP序列，克隆入pGEM Teasy质粒，随机挑选克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度。结果 测序结果发现HBV CP序列高度保守，但在TATA样盒(1—3)可发生多种突变，其中184nt(T→C)位替换突变员为常见；在直接重复序列(DR)I上游存有一缺失突变高发区33．3％(5／15)。结论 CP区内有一缺失高变区，TATA样盒3的变异可能影响前C蛋白的表达。结果 提示HBV长期携带者体内有HBV准种共存。     

重型乙型肝炎病人中乙型肝炎病毒C基因启动子变异的研究

目的　了解重型乙型肝炎（ 乙肝） 病人血清乙肝病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡＣ基因启动子（ＣＰ） 的变异。方法　对用聚合酶链反应（ＰＣＲ） 法扩增的血清ＨＢＶＤＮＡ 直接测序。结果　７ 例亚急性重型肝炎病人的ＨＢＶ 分离株ＣＰ区分别有２～１２ 个替代变异，１ 例病人有１１ｂｐ 的碱基插入。ＣＰ变异主要发生于ＣＰ的第１ 和第２ 个ＡＴ丰富区，ｎｔ１ ７６２ 和ｎｔ１ ７６４ 的替代变异见于７ 例亚急性重型肝炎病人的４ 例中，是ＣＰ变异的热点，其中３ 例ＨＢｅＡｇ 阴性，说明和ＨＢｅＡｇ 阴性表型相关。ＣＰ的第３ 个ＡＴ丰富区、ＨＢＶ逆转录起始位点（ＤＲ１） 和前Ｃ基因、前基因组转录起始位点未见变异。结论　重型肝炎病人的ＨＢＶＣＰ区存在较多的变异，ＣＰ变异主要发生于和前Ｃ基因相关的第１ 和第２ 个ＡＴ丰富区，可能和ＨＢｅＡｇ 阴性表型相关     

乙型肝炎病毒PreS1基因的原核表达及免疫学性质鉴定

目的 构建含乙型肝炎病毒(HBV)PreS1基因的原核表达载体,获得高纯度、有生物活性的PreS1重组蛋白.方法 采用PCR法扩增PreS1及其N末端和C末端部分基因序列,克隆入原核表达载体pGST-MOLUC.重组质粒经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot检测.用谷胱甘肽-Sepharose 4B凝胶亲和层析纯化的重组融合蛋白免疫新西兰家兔,制备GST-PreS1融合蛋白的抗血清.进一步用ELISA分析融合蛋白特异抑制HBV病毒与抗体结合的能力.结果 重组质粒转化宿主菌后成功诱导出Mr39 000、31 000和32 000的GST-PreS1、GST-PreS1N及GST-PreS1C融合蛋白,均与预期相对分子质量相符.Western blot检测获得特异的杂交条带.采用谷胱甘肽-Sepharose 4B凝胶纯化的融合蛋白纯度约为90%左右.融合蛋白免疫家兔后抗体滴度达到10-7.病毒捕获ELISA实验表明,融合蛋白能特异抑制病毒与家兔免疫血清结合.结论 GST-PreS1融合蛋白能够在大肠杆菌中高效表达,其纯化产物是研究PreS1基因在HBV感染过程中作用的有用工具.     

乙型肝炎病毒X基因变异与临床

乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｘ基因是病毒基因组内功能重叠最明显的区域。近来的研究表明，ＨＢＶＸ基因变异类型主要为Ｃ基因启动子区内的聚集变异，尤其是第Ｔ１７６２、Ａ１７６４联合点突变，是在转录水平上造成ＨＢｅＡｇ（一）ＨＢＶ感染的原因；以及ＤＲ２变异合并Ｃ基因启动子全段或部分缺失，此类变异毒株感染是造成部分非甲－戊型肝炎的原因；ＨＢＶＸ基因变异与重型肝炎的关系仍不明确。     

HBV与HCV融合基因免疫的抗肿瘤作用研究

目的 :观察基因疫苗SpcDNA3.1、CpcDNA3.1及融合基因疫苗CSpcDNA3.1诱导BALB c小鼠 (H 2 d)的特异性细胞免疫应答及其对稳定表达HBsAg和HCcAg的小鼠肥大细胞瘤P815细胞 (H 2 d)接种动物后成瘤性的影响。方法 :3种重组质粒SpcDNA3.1、CpcDNA3 1和CSpcDNA3 1分别肌注免疫小鼠 ,3w后背部皮下接种质粒CSpcDNA3 1转染的P815细胞 ,观察小鼠成瘤和存活时间。LDH法检测免疫小鼠的脾淋巴细胞CTL活性。结果 :融合质粒CSpcDNA3 1可显著抑制肿瘤出现和生长 ,小鼠生存时间明显延长 ,生存率提高 ,CSpcDNA3 1免疫的小鼠脾淋巴细胞体外对转染的P815肿瘤细胞有明显的杀伤作用。结论 :融合基因疫苗CSpcDNA3 1免疫的小鼠能诱发特异性抗肿瘤细胞免疫。     

基因芯片检测乙醇对慢性乙型肝炎患者乙肝病毒多位点基因突变的研究

目的：研究乙醇对HBV DNA多位点基因变异的影响，为慢性乙型肝炎的临床诊断和治疗提供依据。方法:选取85例慢性乙肝患者为研究对象，分为嗜酒组和非嗜酒组，采用DNA芯片技术, 检测HBV DNA前C区G1896A及A1814C位点、BCP区 A1762T及G1764A位点、P区C528A及T552C位点的基因突变。结果:嗜酒组在BCP区A1762T及G1764A位点的突变频率明显高于非嗜酒组(均P<0.05)。在前C区G1896A及A1814C位点，P区C528A及T552C位点突变频率无明显差异（均P>0.05）。结论:乙醇导致乙肝病毒BCP区A1762T及G1764A位点发生基因突变，增强HBV基因的表达和复制，加重慢性乙型肝炎患者的病情。     

乙肝疫苗免疫失败儿童病毒S基因"a"决定簇变异研究

目的 探讨江苏常州地区乙型肝炎疫苗免疫失败儿童病毒S基因“a”决定簇的变异情况。方法 对15例乙肝疫苗接种后血清表面抗原(HBsAg)阳性的儿童,采用聚合酶链反应方法(PCR)扩增其血清中HBV DNA S基因区。并对PCR产物直接标记测序。结果 15例HBsAg阳性儿童有14例血清HBV DNA阳性,其中有4例出现了S基因“a”决定簇的变异,变异率为28．6％,第126位的异亮氨酸（Ile)被苏氨酸(Thr)替代1例,第134位苯丙氨酸(Phe)被异亮氨酸替代1例。第145位甘氨酸(Gly)被丙氨酸(Pha)替代2例。结论乙型肝炎疫苗免疫失败儿童中存在s基因“a”抗原决定簇变异,江苏常州地区存在HBVS基因“a”决定簇变异的新类型。     

乙型肝炎病毒 C 基因启动子基因变异与免疫学标志及DNA含量的临床研究

目的 研究乙型肝炎病毒（HBV）C基因启动子（Basic core promoter,BCP）基因变异与HBV感染者免疫学标志及HBV DNA含量的临床关系。方法 采用聚合酶链（PCR）微板核酸分子杂交及荧光定量PCR检测技术,对246例HBV感染者进行HBV BCP基因变异及HBV DNA含量测定。结果 在HBsAg/HBeAg/HBcAB,HBsAg/HBeAg/HBcAb及HBsAg/HBcAb阳性的HBV感染者中,HBV DNA的阳性率分别为97.5%(48/49),22.9%(25/109),31.1%(14/45);HBV BCP基因变异率分别为59.1%(29/49),11%(12/109),13.3%(6/45);HBV BCP基因变异组DNA含量均≥10^6cps/ml,明显高于非BCP基因变异组。肝硬化病人BCP基因变异明显高于其他组。结论 e抗原免疫学标志的转换仅对部分感染者预示着病毒的免疫清除和静息,单独依靠乙型肝炎免疫学标志并不能确切提示HBV的复制状态、病变程度及愈后。     

S基因显性阴性突变体干扰乙肝病毒颗粒组装的研究

目的　探讨S基因突变对HBV病毒颗粒组装的影响。方法　构建野生型S基因、S基因突变的真核表达载体pcDNA3 S和pcDNA3 mS及S基因突变的全长HBV基因组表达载体pHBV mS ,用pHBV mS与pcDNA3 S共转染HepG2细胞 ,pHBV mS与pcDNA3共转染HepG2细胞 ,以adwR9与pcDNA3共转染为对照 ;pcDNA3 mS和adwR9共转染HepG2细胞 ,以adwR9和pcDNA3共转染为对照 ,用荧光定量PCR检测胞内和上清中病毒量 ,用ELISA方法检测上清中S抗原。结果　pHBV mS与pcDNA3共转染组上清中病毒量较对照组低而胞内病毒量二者相同。pHBV mS与pcDNA3 S共转染组上清、胞内病毒量与对照组相同。pcDNA3 mS和adwR9共转染HepG2细胞其上清中病毒量较对照组低而胞内病毒量两者相同。上清中S抗原实验组较对照组低。结论　S突变体干扰HBV病毒颗粒的组装 ,导致的HBV病毒颗粒分泌下降。     

HCV/HBV复合DNA免疫的初步研究

目的 探讨HCV/HBV复合抗原PCX/S免疫原性。方法 将已证实具有良好免疫原性的人工合成的HCV复合多表位抗原基因PCX与HBV的S抗原基因融合于真核表达载体pcDNA3.0,构建真核表达载体pcDNA-PCXS。大量提取质粒并免疫小鼠,用ELISA的方法检测抗-HBs和抗-HCVAb;~3H-TdR渗入法检测免疫小鼠T淋巴细胞增殖;用~(51)Cr释放法检测免疫小鼠特异性CTLs杀伤作用。结果 免疫后均能检测到抗-HBsAb和抗-HCVAb,抗体水平随着时间的推移逐渐升高,但后者OD_(450nm)平均值低于抗-HBsAb的OD_(450nm)。免疫小鼠诱发针对PCX或S抗原的CTL反应和淋巴细胞转化。结论 复合型PCX/S抗原基因可诱发特异性免疫应答,为HCV/HBV双价疫苗的研究提供一定实验基础。     

乙型肝炎病毒S基因129Leu和145Arg变异株的抗原表达与DNA免疫研究

目的 研究我国发现的乙肝病毒S基因突变株(129Leu和145Arg)表达HBsAg及DNA免疫的特性. 方法 用自乙肝疫苗免疫无保护婴儿血清中克隆的2株变异S基因(其中"a"决定簇突变,分别为nt540A→T,aa129Gln→Leu和nt587G→A,aa145Gly→Arg)片段,置换已知核苷酸序列并可表达及复制的HBV1.2个拷贝全基因野毒株重组质粒p3.8Ⅱ的S基因.将重组质粒转染HepG2细胞,用Abbott试剂和24种单抗检测转染细胞培养上清中HBsAg的结合力.用重组质粒DNA肌肉免疫小鼠. 结果 129Leu变异株转染细胞上清对HBsAg酶联免疫反应检测的吸光度(A)值高于p3.8Ⅱ野毒株,而145Arg变异株的A值低于p3.8Ⅱ;用24种单抗测定的总趋势为129Leu表达的HBsAg 的S/C值高于p3.8Ⅱ,而145Arg的结果则低于p3.8Ⅱ.三者表达的HBeAg水平相似.用DNA免疫经129Leu诱生的抗-HBs水平低于野毒株p3.8Ⅱ,但略高于145Arg. 结论 129Leu变异株表达的HBsAg与HBs多抗及单抗的结合力较野毒株明显增高,但129Leu 变异株DNA免疫诱生的抗-HBs水平却低于野毒株p3.8Ⅱ.免疫原性低下可能有利于129Leu致持续性感染.     

针对S基因的siRNA或shRNA表达框对HepG2.2.15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用比较

目的 化学合成针对乙型肝炎病毒（HBV）S基因的siRNA，同时制备针对相同区段的shRNA表达框，并比较二者对HepG2．2．15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用。方法 化学合成针对HBVS基因的带有FITC标记的siRNA，设计合成带有FTrc标记的引物，PCR扩增含有RNA聚合酶Ⅲ启动子H1序列和shRNA编码序列的表达框，并对扩增产物进行纯化，将等摩尔数siRNA和shRNA表达框分别用脂质体转染稳定表达HBV的HepG2．2．15细胞，转染1d后流式细胞仪检测转染效率，转染3d后RT-PCR检测靶基因mRNA的水平，用SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测HBsAg的表达。收集转染前和转染后1、3、5和7d的细胞培养上清，检测HBsAg水平，同时用荧光定量PCR方法检测HBV　DNA的含量。结果成功制备了针对HBVS基因的shRNA表达框，将其与等摩尔数siRNA分别转染HepG2．2．15细胞后，RT-PCR证实细胞中HBV　mRNA水平降低，SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测到HBsAg的表达受到抑制，细胞培养上清中HBsAg和HBV DNA含量下降。与siRNA相比，shRNA表达框对HBV的抑制作用虽然起效较慢，但持续时间更长。结论shRNA表达框和siRNA均可明显抑制HBV的转录和表达，与siRNA相比，shRNA表达框能够更持久地抑制靶基因的表达。     

乙型肝炎病毒新的免疫逃避株的S基因序列分析

目的分析乙型肝炎患者体内ＨＢＶＳ基因的变异情况及对乙型肝炎的免疫预防的现实意义。方法采用巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）、Ｍ１３噬菌体克隆和核苷酸序列分析方法对一例乙型肝炎免疫失败儿童患者体内ＨＢＶＳ基因序列进行分析。结果发现该患儿所感染ＨＢＶ的Ｓ基因上有一个重要的点突变,即第５５１位碱基由野生型的Ａ变为Ｇ。该突变使乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）１３３位氨基酸由甲硫（ＡＴＧ）变为缬（ＧＴＧ）。这一氨基酸替换恰恰发生在ＨＢｓＡｇ中和性α抗原决定簇区段（ａａ１２４～ａａ１４７）内。结论鉴于该患者接种乙型肝炎疫苗,其血清呈抗－ＨＢｓ阳性和ＨＢｓＡｇ阴性,推测其体内的ＨＢＶ为一个新的疫苗诱导的免疫逃避株     

原发性肝癌患者214例乙肝两对半及抗-HCV检测结果探析

目的探讨乙肝病毒(HBV)及丙肝病毒(HCV)感染模式与原发性肝癌(PHC)间的关系。方法选取我院于2012年1月至2015年1月间收治的PHC患者214例,抽取其早晨空腹静脉血5m L,分离获得血清,采用罗氏公司Elecsys2010型全自动化学发光免疫分析仪检测患者的乙肝两对半指标,采用酶联免疫法(ELISA)检测患者血清丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)水平。结果 214例PHC患者中,HBV的感染率高达87.85%,显著高于未感染者,其中HBs Ag阳性感染率为68.22%,显著高于HBs Ag阴性感染率19.63%,并且又以"小三阳"模式所占比例最高,达48.13%,显著高于"大三阳"模式的12.15%及其余10种感染模式所占比例,差异均有统计学意义(P<0.05)。同时HCV的感染率为16.82%,HBV与HCV双重感染率为10.75%;其中感染HCV并HBs Ag阳性感染者所占比例为0.93%,显著低于感染HCV并HBs Ag阴性感染者比例9.82%及仅感染HCV者的比例6.07%,差异有统计学意义(P<0.05)。HBs Ag阳性感染者感染HCV的几率为1.37%,显著低于HBs Ag阴性感染者感染HCV的几率47.62%及未感染HBV者感染HCV的几率53.85%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论HBV感染极有可能是致使PHC发生的主要因素,而HBs Ag阳性感染在其中居主导地位,且又以"小三阳"感染模式的PHC患者占多数。同时HCV感染也不容忽视,特别是HBV与HCV的双重感染更应该引起大家的重视。