SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测survivin甲基化状态

目的建立SYBR Green Ⅰ实时荧光聚合酶链反应（PCR）检测survivin甲基化的方法。方法25例胃癌组织标本及与其配对的正常胃组织经甲基化敏感性限制性内切酶HpaⅡ和MspⅠ处理后，再用SYBR GreenⅠ实时荧光PCR对survivin外显子1进行检测。实时荧光定量PCR检测survivin基因内含子2，用于监测经限制性酶消化的基因组DNA浓度变化，10倍系列稀释的基因组标准物用于检验实时PCR的敏感度，PCR产物通过凝胶电泳分析证实。结果经Hpa Ⅱ酶切后，甲基化的目的基因PCR产物在熔解曲线上有Tm值为（91．5±0．5）℃的峰，电泳证实为338bp的条带。所有经酶消化的样本都能扩增出以Tm值（79．5±0．5）℃为特征的对照基因（survivin基因内含子2），表明基因组DNA未产生严重的非特异性降解。SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测甲基化目的基因的灵敏度为10^0拷贝／μL。用以上新建的体系检测25例胃癌标本，发现其survivin基因外显子1的去甲基化频率为96％。结论SYBR GreenⅠ荧光PCR法具有快速、准确、敏感、实时、简单和敏感的特点，是检测survivin外显子1甲基化状态的一种可靠的新方法。     

不同甲基化检测技术对模拟肺癌患者血浆中APC基因甲基化的检测

目的 研究模拟肺癌患者血浆DNA中APC基因甲基化最低检测限,确定不同甲基化检测技术在早期肺癌诊断中的价值.方法 用普通甲基化特异性基因扩增（methylation specific PCR,MSP）方法检测肺癌细胞株NCI-H460细胞APC基因,以酚-氯仿经典方法提取NCI-H460细胞DNA,紫外分光光度计定量并以10倍稀释的浓度梯度依次投入相同的健康人血浆200μl中去,得到模拟肺癌患者血浆,利用磁珠核酸提取方法从模拟血浆样本中提取血浆DNA.对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰,并以Sybr-Green Ⅰ为染料进行实时荧光定量MSP检测,同时进行普通MSP检测.结果 NCI-H460细胞中的APC基因启动子1A区719位点存在甲基化,实时荧光定量MSP检测模拟肺癌患者血浆APC基因甲基化的最低检测限为在200 μl血浆中能检测出10^2个肿瘤细胞的DNA,而以普通MSP检测,200 μl血浆中需投入10^3个以上肿瘤细胞的DNA才有弱阳性条带.实时荧光定量MSP检测技术比普通MSP检测的敏感性至少高出10倍.结论 实时荧光定量MSP比普通MSP检测灵敏度高,该技术用于肺癌患者血浆DNA甲基化检测,可能有助于肺癌早期诊断.     

分子信标荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的反应体系优化方法对比研究

目的建立分子信标荧光定量PCR检测结核分技杆菌的最佳反应体系,探讨影响分子信标荧光定量PCR扩增结果的多个因素。方法利用单因素法和正交实验法,从MgCl2,引物,分子信标探针,dNTP,Taq DNA聚合酶5种因素对分子信标荧光定量PCR反应体系进行优化,并对这两种方法所得的最优体系进行比较。结果单因素法得到的最优反应体系（25μl）为：4mmol／L MgCl2,上、下游引物各0．3μmol／L,分子信标探针0．1μmol／L,200μmol／L dNTP,2U Taq DNA;正交法得到的最优反应体系（25μl）为：6mmol／L MgCl2,上、下游引物各0．2μmol／L,分子信标探针0．1μmol／L,100μmol／L dNTP,3U Taq DNA聚合酶,正交法得到的最优反应体系的荧光定量PCR扩增曲线形状更好,Q值较小,△Rn较大。结论采用正交法得到的荧光定量PCR反应体系优于单因素法,进行实时荧光定量PCR反应体系优化时,正交实验设计是一条科学、可靠、高效、快捷的途径。     

SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测生存素基因的方法建立及条件优化

目的建立SYBRGreenⅠ染料实时定量PCR检测生存素（Survivin）基因定量的方法。方法根据PCR产物荧光强度、循环阈值（Ct值）、标准曲线斜率、相关系数和熔解曲线优化反应体系中各组分的量及反应条件，对引物二聚体消除策略和Ct值获取方式进行评价。并用该方法检测43份胃癌组织Survivin基因扩增情况。结果SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR体系扩增Survivin的最佳组成和条件是：Taq酶2．5U／100μl、MsCl2 2mmol／L、引物浓度0．2μmol／L和退火温度58℃；在PCR循环延伸结束后设置1个低于特异产物退火温度值2℃的荧光读取温度，能有效消除引物二聚体对定量检测的影响；以二次倒数最大值方式确定Ct值，能避免主观因素所致误差。研究建立的SYBRGreenⅠ染料实时定量PCR检测Survivin基因含量方法的灵敏度为10拷贝／μl，线性范围10^1～10^4拷贝μl（r=0．9997），批内变异系数（CV）1．13％-1．91％，批间CV3．31％-4．50％；胃癌组织中Sttrvivin基因扩增率为13．9％（6／43）。结论优化后的SYBRGreenI实时定量PCR方法具有方便、经济、灵敏度高和重复好等特性，可用于Survivin基因含量分析。     

稀土化合物氯化镧对脂多糖诱导小鼠巨噬细胞分泌-一氧化氮的影响

目的探讨氯化镧（LaCl3）由对脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激小鼠巨噬细胞（RAW264．7）分泌一氧化氮（nitric oxide，N01的影响。方法RAW 264．7细胞随机分成四组：空白对照组（培养基中不含LaCl3和LPS），氯化镧组（含LaCk2．5，5，10，20μmol／L培养24h）、氯化镧＋LPS组（分别以含LaCl3 2．5、5、10、20μmol／L的培养基培养24h后．更换含LPS 1mg／L的培养基继续培养24h）及LPS组（含LPS 1mg／L的培养基培养24h）。采用硝酸还原酶法测定各组细胞培养液上清一氧化氮（NO）的含量。结果LPS组培养上清NO浓度为52．82±12．60μmol／L与空白对照组（2．90±2．36μmol／L）和LaCl3组[（6．50±4．67μmol／L、9．52±4．47μmol／L、11．14±7．42μmol／L、6．74±2．00μmol／L]比较有显著性差异（P〈0．05）；LaCl3＋LPS组NO的浓度分别为26．00±5．83μmol/L（2．5μmol／L LaCl3＋LPS）、29．86±7．26μmol／L（5μmol／L LaCl3＋LPS）、34．62±6．24μmol／L （10μmol／L LaCl3＋LPS），与LPS组相比显著减少（P〈0．05），20μmol／L LaCl3＋LPS）组NO的产生为45．61±6．68μmol／L与LPS组比较无显著性差异。结论一定浓度的LaCl3可抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞产生NO的水平。     

不同妊娠期妇女血微量元素水平变化分析

目的探讨不同妊娠期妇女血液微量元素变化情况。方法用原子吸收光谱分析法分别测定294例孕妇和47例健康妇女（对照组）Se、Mn、Fe、Cu、Zn水平。结果Se,与对照组（79．524±10．55μg／L）比较,早孕组（72．16±9．48μg／L）、中孕组（72．40±11.58μg／L）,P〉0．05,晚孕组（56．76±13．85μg／L）,P〈0．01;Mn,与对照组（15．00±3．25μg／L）比较,早孕组（14．10±3．73μg／L）、中孕组（15．57±3．49μg／L）,P〉0．05,晚孕组（24．24±5．43μg／L）,P〈0．01;Fe,与对照组（18．64±3．76μmol／L）比较,早孕组（22．20±4．68μmol／L）、晚孕组（12．68±4．31μmol／L）,P〈0．01,中孕组（17．76±6．13μmol／L）,P〉0．05;Cu,与对照组（16．28±2．69μmol／L）比较,早孕组（23．28±5．62μmol／L）、中孕组（25．48±3．45μmol／L）、晚孕组（28．82±4．36μmol／L）,P〈0．01;Zn,与对照组（12．83±1．16μmol／L）比较,早孕组（10．85±2．17μmol／L）、中孕组（9．71±1.70μmol／L）、晚孕组（7．81±1．36μmol／L）;P〈0．01。结论健康孕妇微量元素水平反映了微量元素之间协同、拮抗作用。随着妊娠期的推移,Fe的下降导致Mn的水平上升,Se的水平下降;而Cu的水平不断上升导致Zn水平不断下降,妊娠晚期各元素水平上升或下降尤为显著。     

IgH重排的实时定量PCR检测及反应参数研究

为了探讨以通用引物应用PCR技术扩增克隆性免疫球蛋白重链基因（IgH）重排的最佳实验条件及SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测该基因的可行性，以通用引物对克隆性IgH重排进行扩增，对影响PCR扩增的退火温度、引物浓度、Taq酶用量、dNTP浓度、镁离子浓度、循环次数等实验因素进行了系统研究，找出最佳反应参数。并以通用引物进行了SYBR greenⅠ实时定量PCR对IgH重排基因的检测，测定了该法检测IgH重排基因的敏感性。结果表明：最佳退火温度为60℃，最佳引物浓度为0．8μmol／L，0．5U的Taq酶量效果满意，最适dNTP浓度为100μmol／L，最适镁离子浓度为3．0mmol／L，最佳循环次数为40次。SYBR GreenⅠ实时定量PCR可以实现对克隆性IgH重排的扩增和荧光信号的检测分析，其对IgH重排基因检测的敏感性为10^4／ml。结论：确定了应用PCR技术检测克隆性IgH重排的最适反应条件，实现了用通用引物对克隆性IgH重排稳定、特异的扩增，初步实现了以通用引物和应用SYBR Green Ⅰ实时定量PCR对IgH重排的检测。     

酶法与Jaffe速率法检测肌酐结果的探讨

目的探讨肌酐测定中酶法与Jaffe速率法的关系。方法选择该院住院患者血清和尿液标本200例，用日本TMS-1024i自动生化分析仪检测肌酐，然后对测定结果进行统计学分析。结果肌酐浓度小于200μmot／L时，酶法和Jaffe速率法测定肌酐的结果分别为（83．88±34．74）μmol／L、（84．38±34．44）μmol／L，2种方法测定肌酐的结果差异无统计学意义（P〉0．05）；而肌酐浓度大于200μmol／L时，酶法和Jaffe速率法测定肌酐的结果分别为（1721．89±1897．76）μmol／L、（1666．70±1824．07）μmol／L，2种方法测定肌酐的结果差异有统计学意义（P〈0．05）。结论酶法检测肌酐的灵敏度高，干扰因素少，线性浓度高，是比较理想的测定方法。     

VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA实时荧光定量检测方法的建立及初步应用

目的建立检测血管内皮生长因子-C（VEGF-C）mRNA和血管内皮生长因子受体-3（VEGFR-3）mRNA的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（FO-RT-PCR）方法,并在食管癌组织中作初步应用。方法采用TaqMan荧光探针技术,分别以pMD18-VEGF-C和pMD18-VEGFR-3质粒作为定量模板,应用循环阈值（Ct）定量起始模板,建立检测食管癌组织的VEGF-CmRNA和VEG—FR-3tuRNA的实时FQ-RT-PCR方法。结果所建方法的线性范围：VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA均为10^3～10^8拷贝／μg总RNA;测定VEGF-C mRNA低值的批内、批间变异系数（CV）分别为7．07％和9．04％,测定VDGF-CmRNA高值的批内、批间CV分别为7．55％和10．28％;测定VEGFR-3mRNA低值的批内、批间CV分别为7．69％和12．49％,测定VEGFR-3mRNA高值的批内、批间CV分别为7．31％和9．17％。24例淋巴结转移食管癌患者癌组织VEGF-CmRNA和VEG—FR-3 mRNA的测定范围分别为3．69×10^4～9．44×10^6拷贝／μg总RNA和2．54×10^4～8．03×10^6拷贝／μg总RNA,均值分别为2．18×10^6拷贝／μg总RNA和2．27×10^6拷贝／μg总RNA。16例无淋巴结转移食管癌患者癌组织VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA的测定范围分别为2．32×10^3～5．85×10^5拷贝／μg总RNA和7．31×10^2～8．21×10^4拷贝／μg总RNA,均值分别为1．08×10^5拷贝／μg总RNA和1．68×10^4拷贝／μg总RNA。提示有淋巴结转移的食管癌组织VEGF-C和VEG—FR-3基因表达水平上调。结论本组建立的检测VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA的实时FQ-RT-PCR方法灵敏、准确、稳定、重复性好,可供VEGF-C、VEGFR-3基因表达的临床检测和研究应用。     

阿仑磷酸钠对人成骨细胞增殖和护骨素／核因子KB受体活化因子配体mRNA表达的影响

背景：阿仑磷酸钠是新一代的二磷酸盐,属第2代骨质疏松药,临床上广泛用于治疗骨吸收增加类疾病。目的：观察阿仑磷酸钠对人成骨细胞增殖和核因子KB受体活化因子配体（RANKL）及护骨素（OPG）mRNA表达的影响。设计、时间及地点：单一样本观察,于2007-11／2008-03在重庆医科大学基础研究所完成。材料：成骨细胞来源于手术中取得的松质骨骨块;阿仑磷酸钠为杭州默沙东制药有限公司生产,批号：06130。方法：在含1×10^-9,1×10^-8,1×10^-7,1×10^-6,1×10^-5,1×10^-4mol／L不同浓度的阿仑磷酸钠培养液中培养成骨细胞,以不加阿仑磷酸钠培养为对照。主要观察指标：①成骨细胞观察。②以四甲基偶氮唑盐检测阿仑磷酸钠对成骨细胞的增殖的影响。③以半定量反转录一聚合酶链反应方法观察不同浓度阿仑磷酸钠对成骨细胞表达OPG,RANKLmRNA的影响。结果：1×10^-5,1×10^-4mol／L的阿仑磷酸钠抑制成骨细胞增殖,1×10^-8～10^-6mol／L的阿仑磷酸钠促进成骨细胞增殖,其中1×10^-8mol／L的阿仑磷酸钠对成骨细胞的增殖作用最强。阿仑磷酸钠呈浓度依赖性降低RANKLmRNA表达,干预72h,1×10^-5mol／L抑制作用最大（P〈0．01）。阿仑磷酸钠呈浓度依赖性增加护骨素mRNA表达,干预72h,1×10^-6mol／L增加作用最明显（P〈0．01）,而1×10^-5mol／L时又减低。结论：阿仑磷酸钠能使成骨细胞增殖,1×10^-8mol／L浓度增殖作用最强,其可能通过调节OPG／RANK LmRNA表达而影响骨代谢。