耐拉米夫定乙型肝炎病毒变异株全基因组克隆及鉴定

目的:扩增并克隆耐拉米夫定乙型肝炎病毒(HBV)变异株全基因组DNA,为构建含双体HBV YMDDDNA质粒和HBV YMDD变异株细胞模型及研究药物筛选奠定基础。方法:从一名耐拉米夫定的慢性乙型肝炎病人血清中提取HBV病毒DNA,用错配PCR结合限制性片段长度多态性(RFLP)进行变异分析,然后采用PCR方法在HBV负链开环缺口处及基因组中单一酶切点(SpeⅠ)处,设计两对引物从两个方向分别扩增1.15 kb和2.05 kb的单链及双链DNA区,利用基因重组技术,将两片连接后克隆至质粒pcDNA3.1-中,再进行DNA序列测定。结果:错配PCR结合RFLP分析证实该病毒存在YVDD变异,通过两段法克隆出HBV全基因组,经序列分析所得为HBV YMDD变异株全基因组。结论:成功克隆出HBV YMDD变异株全基因组。     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

乙型肝炎病毒前C区1896点突变、基因分型及其实验室特征分析

目的:分析乙型肝炎病毒(HBV)前C区1896位基因突变与HBV基因型、HBV复制以及患者肝功能之间的关系.方法:对60例HBV DNA阳性患者进行荧光扩增检测前C区1896变异、HBV DNA基因分型、HBV DNA定量检测,酶免微粒子化学发光法检测血清HBeAg及HBeAb,全自动生化仪检测肝功能指标.结果:前C区1896变异者ALT水平为(109±111) U/L,比野生型者显著上升(P＜0.05);1896位点变异与HBeAg、HBV基因型及HBV DNA水平无关;乙型肝炎患者HBV DNA水平C型显著高于B型(P＜0.05).结论:HBV DNA前C区1896变异感染可能与肝细胞受损加重有关;基因型C型HBV DNA水平显著高于B型,提示C型病毒复制更为活跃.     

乙型肝炎病毒基因分型及对肝病的影响

乙型肝炎病毒(HBV)属于肝DNA病毒属,它的遗传变异性很高,可分为8种基因型,大多数基因型能进一步分成亚型。而HBV基因型之间的重组增加了HBV的变异性。本文概述了当前乙型肝炎DNA病毒属基因变异的流行病学知识,另外因为这一领域的快速进展,更新了一些有关HBV基因型和基因亚型的最近综述,并阐述了HBV基因型与肝病的关系。     

非放射性分子杂交法在乙型肝炎诊断中的价值

<正> 乙型肝炎病毒(HBV)的感染性由其基因HBV—DNA所决定。HBksAg、HBeAg和HBV—DNA聚合酶均是HBV—DNA编码的产物。显然在所有反映HBV感染性的指标中,HBV—DNA最有价值。故按常规方法检测抗原—抗体系统(Ag—Ab)判断乙肝病人及携带者,难以精确反映HBV的存在和其感染性。而HBV—DNA检测的开展和研究无疑是乙肝病原学诊断的一大进展。     

乙型肝炎病毒基因型与干扰素及拉米夫定抗病毒治疗相关性的探讨

目的:探讨慢性乙型肝炎病毒(HBV)基因型的特点,不同的基因型与干扰素及拉米夫定抗病毒治疗的反应关系。方法:通过乙型肝炎病毒基因分型荧光PCR对90例HBV DNA阳性(>5×102copies/ml)、HBeAg阳性、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)异常的乙型肝炎病毒感染者进行HBV基因分型;对乙型肝炎病毒感染者服用干扰素或拉米夫定治疗6个月后的HBV DNA、HBeAg、ALT的变化进行分析。结果:90例HBV DNA阳性、HBeAg阳性及ALT异常患者,基因型分别检出:B型有33例(占36.6%)、C型有48例(占53.3%)、BC混合型有8例(占8.9%)和非B非C型1例(占1.1%)。33例B基因型23例服用干扰素治疗6个月后HBV感染者HBV DNA阴转率为73.9%、HBeAg血清转换率为78.3%和ALT复常率为73.7%,其余10例服用拉米夫定治疗6个月后HBV感染者HBV DNA阴转率为30.0%、HBeAg血清转换率为40.0%和ALT复常率为70.0%;48例C基因型10例服用干扰素6个月后HBV DNA阴转率为30.0%、HBeAg转换率为40.0%、ALT复常率为50.0%,其余38例服用拉米夫定6个月后HBV DNA阴转率为89.5%、HBeAg转换率为84.2%、ALT复常率为92.1%。结论:90例乙型肝炎病毒感染者基因型以B型和C型为主,C基因型为优势基因型;干扰素治疗慢性乙型肝炎患者B基因型优于C基因型。拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者C基因型优于B基因型。     

HBsAg、HBeAg和HBV DNA对HBeAg阳性病人恩替卡韦疗效评估价值

目的研究HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平对HBeAg阳性慢性乙型肝炎病人恩替卡韦治疗效果的评估价值。方法选择应用恩替卡韦治疗≥3年的HBeAg阳性慢性乙型肝炎病人164例,对其基线时和治疗过程中的血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平进行观察。结果治疗3年后87.8%的病人发生了病毒学应答,34.1%的病人HBeAg发生了血清学转换。基线时的HBsAg和HBeAg对病毒学应答有评估价值(t=3.17、2.61,P<0.05)。与其余指标比较,治疗过程中HBV DNA下降水平对评估病毒学应答、HBeAg滴度对评估血清学转换有更高评估价值。最佳病毒学应答评估时间为治疗6个月,此时HBV DNA绝对值切点为2.40log10kU/L;最佳血清学转换评估时间为治疗12个月,此时HBeAg滴度评估切点为0.59log10kU/L。结论基线时HBsAg和HBeAg滴度均能评估恩替卡韦的远期治疗效果,而治疗过程中HBV DNA动态变化的评估效果更好。     

金纳米颗粒基因探针同步检测HBV和HCV的初步研究

目的 建立一种简单、快速同时检测HBV DNA和HCV RNA的诊断方法.方法 利用PCR方法扩增HBsAg阳性合并抗HCV阳性的患者血清中HBV DNA和HCV cDNA并提取.制备Au纳米颗粒HBV DNA、HCV cDNA基因探针.在含有Au纳米颗粒HBV DNA、HCV cDNA基因探针的液相检测体系中加入HBV DNA和(或)HCV cDNA,透射电镜下观察.结果 PCR(可扩增HBV DNA和HCV cDNA.出现预期的431bp和323bp特异性条带.使用Au纳米颗粒基因探针通过透射电镜可同步检出乙、丙型肝炎合并感染患者血清中提取的HBV DNA和HCV RNA.结论 通过透射电镜,使用Au纳米颗粒基因探针可同步检出乙、丙型肝炎合并感染患者血清中的HBV DNA和HCV cDNA,甚至可达到无需PCR水平,此方法具有敏感性高、特异性好的特点.     

乙型肝炎病毒基因型与血清HBV DNA水平的关系分析

目的: 分析乙型肝炎病毒(HBV)基因型与血清HBV DNA水平的关联性.方法:选择我院2014年5月21日-2016年5月21日收治的90例慢性乙型肝炎(CHB)患者,并进行HBV DNA基因分型与血清HBV DNA水平检测.结果:B、C基因型的血清HBV DNA、HBeAg检测水平比较差异显著,P<0.05;C基因型患者的TBIL、ALT、AST检测值相比B基因型明显较高、白蛋白相比B型明显较低,P<0.05.结论:本地区的CHB患者主要为B基因型,相比B型,C基因型的血清HBV DNA水平明显更高,肝损伤情况相比B型明显更高.     

双拷贝和x基因缺失HBV DNA质粒的构建及其细胞转染

目的:构建双拷贝和x基因缺失的HBV真核细胞复制表达质粒,并研究其在Hep3B肝癌细胞株中对HBV的复制表达效果.方法:利用含HBV DNA(adrⅠ)的质粒,酶切出HBV DNA片段,克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3,构建双拷贝HBV DNA的真核表达质粒pcDNA3-ES-HBV2;将原始质粒通过插入人工合成DNA片段和基因重组破坏乙肝病毒x基因区,再克隆入pcDNA3,构建成pcDNA3-KN-F1F2真核表达质粒;用两质粒分别转染Hep3B肝癌细胞株,进行G418筛选的同时用荧光定量PCR法检测细胞培养上清液HBV DNA.结果:(1)成功构建了x基因缺失的HBV真核表达质粒pcDNA3-KN-F1F2及含双拷贝HBV DNA的真核表达质粒pcDNA3-ES-HBV2;(2)对两质粒成功进行细胞转染后,测得第3、6、14天细胞培养上清液中HBV DNA均高表达,两质粒之间差别不明显.结论:构建的质粒可在Hep3B细胞株中表达并引起HBV的复制及分泌;x基因的缺失不影响HBV在Hep3B细胞株中的表达复制.     

建立检测血清HBV DNA的多聚酶链反应技术

建立检测血清HBV DNA的多聚酶链反应技术。人工合成adr、adw和ayw三个业型HBV的两个共有序列NC1和NC2作为引物扩增一长428bp且含一BglⅡ酶切点的HBV C基因片段。含FD酶的反应体系在水浴93℃30秒、55℃60秒、72℃90秒依序循环30周期,当克隆HBV DNA模板最小加量为10 fg时,产物作琼脂糖凝胶电泳经溴化乙锭染色在紫外线下观察仍可见428 bp位置的阳性荧光带。阳性产物经BgⅠⅡ酶切后分为125 bp和303 bp的两个特异片段。同一条件下的阴性对照则出现阴性结果。这一技术用以检测经常规DNA提取的127例HBsAg阳性血清,结果HBV DNA检出率达88％,其中HBeAg阳性血清HBV DNA检出率为97％,抗HBeAg阳性血清HBV DNA检出率为82％。     

PBMCs中HBV逆转录酶P基因的mRNA表达X基因的整合与肝细胞癌变的关系

目的在外周血单个核细胞(PBMCs)中研究乙型肝炎病毒(HBV)DNA多聚酶/逆转录酶P基因的mRNA表达、X基因的整合与肝细胞癌变的关系。方法设计HBV P基因引物P1、P2,及X基因引物X1、X2。分离HBsAg阳性40例原发性肝癌病人及36例慢性乙肝病人PBMCs,分别提取其基因组总DNA和总RNA,RNA逆转录合成cDNA;PCR检测HBV的X基因整合;RT-PCR方法检测HBV的DNA多聚酶/逆转录酶P基因在PBMCs中的mRNA表达。结果PBMCs中X基因片段的整合率在HCC组为79.5%(31/40),与CH组的整合率50%(18/36)无统计学差异(P>0.05)。P基因的mRNA表达率HCC组为10%(4/40),与CH组表达率33.3%(12/36)有统计学差异(P<0.05)。结论在HCC阶段HBV病毒复制相对静止,大量X基因整合最终导致HCC的发生。     

巢式PCR检测北京地区乙型肝炎病毒基因型的分布

目的了解北京地区乙型肝炎病毒(HBV)感染者HBV基因型分布情况。方法从前S1基因到S基因中的保守序列设计出10条内外引物,将其中8条内引物分成A、B组,分别扩增A、B、C、D、E、F型HBV,根据PCR产物片断判定HBV基因型。结果用此种方法检测HBV感染的不同转归类型患者血清728份,对HBV DNA阳性标本进行基因型分析。HBV DNA阳性者276例,其中自限性感染者阳性率为5.8%(14/243),慢性无症状HBV携带者血清HBV阳性率为42.6%(113/265),慢性肝炎患者HBV阳性率为67.7%(149/220)。慢性肝炎组HBV DNA检出率与其他2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。在276例HBV DNA阳性标本中,各基因型在不同组分布不同,但差异无统计学意义。HBV基因型总检出率以C型为主,占76.8%,B型占21·7%,同时检出B型和C型为1.5%,未检出A、D、E、F基因型。结论北京地区感染HBV基因型为B型和C型,以C型为主,感染结局不同组间基因型分布比较差异无统计学意义。     

反义寡聚脱氧核苷酸体外对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)C基因翻译起始区和C基因区反义寡聚脱氧核苷酸对HBV表达的序列性抑制作用.方法以乙型肝炎病毒基因组(HBV DNA)转染人肝癌细胞系HepG2而建立起来的转染细胞系2.2.15作为实验对象,设计了一系列互补于HBV mRNA编码核心蛋白基因区(C区)15聚反义硫代寡聚核苷酸(ASON),通过脂质体介导将这些合成的外源基因导入2.2.15细胞中,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测作用细胞培养上清液中乙型肝炎病毒E抗原(HBeAg)和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)含量,提取细胞中的HBV DNA经PCR扩增后,用Southern blotting方法对PCR产物进行半定量分析.结果与HBV mRNA C基因起始区互补的反义硫代寡核苷酸序列特异性地抑制乙型肝炎病毒基因表达,而正义硫代寡核苷酸未见有抑制效应,与HBV mRNA C基因内部互补的序列很少或无抗病毒活性.ASON作用24 h后的细胞培养上清液及细胞内HBV DNA量比对照组明显减少.另外,ASON对细胞生长无毒性作用.结论反义硫代寡核苷酸能够在细胞水平有效地抑制乙型肝炎病毒基因的表达.     

选择性聚合酶链反应检测 2.2.15 细胞内HBV cccDNA

0 引言1986年美国Sells等(The Mount Sinal Medical Center)将HB V基因转染到人肝癌细胞(HepG2)中,获得了能表达HBV标志的细胞株2.2.15细胞,并以此作为模型筛选抗HBV的药物,进行基因结构及功能的研究. 然而HBV在2.2.15细胞中复制方式与自然感染的肝细胞有何不同,有无HBV 的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)存在, 各学者说法不一[1.2],我们应用选择性PCR技术,检测了2.2.15细胞内的HBV cccD NA,现简报如下.     

乙型肝炎病毒外膜大蛋白检测对判断病毒复制的临床意义

目的:了解HBV外膜大蛋白(HBV-LP)对HBV感染、复制和乙肝患者诊断、治疗和预后评估的作用。方法:收集104例乙型肝炎患者血清(HBsAg阳性),同时检测血清HBV-M、HBV-LP、HBV DNA,HBV-LP检测采用ELISA法,HBV DNA由广州达安基因股份有限公司提供检测;测定采用FQ PCR。结果:不同HBV-M模式中,HBV DNA、HBV-LP阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05),HBV DNA含量(拷贝数对数)与HBV-LP浓度均值呈正相关关系。在72例血清HBV DNA阳性患者中,HBV-LP阳性65例,阳性率90.3%。结论:HBV-LP在不同HBV-M感染模式中,与HBV DNA的阳性率比较吻合,而且HBV-LP浓度能较好的反映体内HBV DNA的存在状态。     

血清中乙型肝炎病毒全基因组及X基因的克隆与鉴定

目的:建立从血清样品直接扩增乙型肝炎病毒(HBV)全长DNA的方法,构建HBV全基因组克隆.方法:用长链PCR从血清样品一次性扩增HBV全长DNA,测序鉴定后插入质粒puc19构建含HBV全基因组的重组质粒,再从重组质粒扩增X基因并进行序列分析.结果:经DNA序列测定和酶切分析,获得HBV全基因组克隆,从克隆的HBV全基因组扩增到X基因.结论:从血清中可直接扩增到HBV全基因组DNA,为整体水平研究HBV基因组的变异与其致病及宿主抗感染免疫之间的关系奠定了实验基础.     

乙型肝炎HBV—DNA与五项指标的关系

目的 探讨乙型肝炎(乙肝)HBV—DNA与五项指标的关系。方法 利用荧光探针定量基因检测(FQ—PCR)方法检贝11500例慢性乙肝患者。结果 五项指标中97．81％“大三阳”(HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性)为HBV—DNA阳性；71．62％“小三阳”(HBsAg、BHeAb、HBcAb阳性)为HBV—DNA阳性；59．25％表面抗原(HBsAg)阳性，52．35％其它(单项或两项乙肝抗原或抗体)阳性为HBV—DNA阳性。结论 HBV—DNA是唯一能准确反应乙肝病毒在体内是否复制具有传染性的唯一指标。     

广西北部乙型肝炎病毒基因型流行分布的研究

目的了解广西北部桂林乙型肝炎病毒(HBV)基因型的流行分布情况.方法用套式PCR扩增检测41例桂林慢性无症状HBV携带者血清HBV DNA,阳性者用直接测序法进行HBV基因分型.结果19例HBV DNA阳性,阳性率为46.34%(19/41),其中15例为基因型B,占78.9%(15/19),4例为基因型C,占21.1%(4/19),未见到其它目前已知的HBV基因型A、D、E、F、G和H;另外,还发现HBV基因型C组HBeAg阳性率显著高于基因型B组(P＜0.05),提示HBV基因型C比HBV基因型B危害更大.结论广西北部桂林流行的HBV基因型有基因型B和C两种,以基因型B为主要流行的优势基因型.     

HBV基因型与阿德福韦酯治疗的病毒学应答

[目的]评价阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎的疗效,研究HBV基因型与阿德福韦酯治疗后病毒学应答的关系。[方法]56例血清HBV DNA载量≥10 拷贝/mL并符合其他入选标准、不符合排除标准的慢性乙型肝炎患者进入此研究。头12周随机分为阿德福韦酯治疗组和安慰剂治疗组,比较12周时两组HBV DNA水平差异。12周后所有患者使用阿德福韦酯治疗,所有患者接受阿德福韦酯治疗40周,比较40周治疗后和基线相比HBV DNA载量的变化、ALT复常率及HBeAg血清转换率。HBV DNA载量检测采用实时定量PCR法,HBV基因型采用线性探针分析法(INNO-LiPA)检测。[结果]12周双盲治疗结束时,阿德福韦酯组和安慰剂组的HBV DNA载量较基线分别下降3.1±1.4 log拷贝/mL和O.3±1.1 log拷贝/mL。所有患者治疗40周后,HBV DNA载量平均下降3.6±1.2 log拷贝/mL,71%(40/56)的患者ALT复常,20%(9/46)基线HBeAg阳性患者发生HBeAg血清转换,29%(16/56)出现完全应答。52例进行了HBV基因型检测,28 f54%)为B型,24(46%)例为C型,未检测到其他基因型。两种基因型患者基线HBV DNA载量、ALT水平及HBeAg状态无明显统计学差异。阿德福韦酯治疗40周后,两组基因型患者HBV DNA载量、ALT复常率及:HBeAg血清转换率无统计学差异。[结论]阿德福韦酯能明显抑制HBV复制,促进ALT复常和HBeAg血清转换。阿德福韦酯抑制HBV疗效与感染HBV基因型B型或C型无关。