LL-37在幽门螺杆菌相关性胃炎中的表达及临床意义

目的检测LL-37在幽门螺杆菌（Hp）相关性胃炎胃黏膜上皮中的表达,评价其在Hp感染的胃黏膜表面的抗菌作用。方法随机选择患者36例,取胃窦黏膜组织,以快速尿素酶及改良Giemsa染色两种方法判断Hp的存在与否。两者同时阳性诊断为Hp阳性,同时阴性为Hp阴性。采用免疫组织化学技术（IHC）检测36例胃炎患者的病变黏膜组织中LL-37蛋白的表达。结果IHC结果显示,LL-37在所有样本中均呈阳性胞质染色。22例幽门螺杆菌阳性胃黏膜均呈中一强阳性染色,幽门螺杆菌阴性胃黏膜组中LL-37为弱阳性染色,差异具有显著性（P〈0．05）。LL-37的表达量与幽门螺杆菌定植数量无明显相关（P〉0．05）。结论LL-37可能因Hp感染诱导呈上调表达,在Hp相关性胃炎中起到一定的抗菌作用。     

改良人源杀菌肽LL-37的两种构建及表达方法的对比研究

目的 将改良人源杀菌肽LL-37(rLL-37)用两种方法构建,并分别在原核细胞中融合表达,以寻找较好的制备方法.方法 ①将编码rLL-37基因序列放入载体pET-28a( ),构建表达质粒pET-28a( )-rLL-37,并于工程菌 BL21(DE3)中融合表达、纯化;②将编码rLL-37基因序列中的部分原核细菌稀有密码子替换为原核细菌偏爱密码子,并在其N端加入一段编码带负电荷的承载蛋白(carrier protein molecule, CPM)基因序列,构建表达质粒pET-30a( )-CPM-rLL-37,并于工程菌 BL21 Star(DE3)中融合表达、纯化.对比上述2种方法rLL-37的制备率,并初步研究其抗菌性.结果 通过Touch-Down PCR法成功获得rLL-37多肽的DNA序列,质粒pET-28a( )-rLL-37于杆菌BL21(DE3)中表达,融合蛋白约占全菌蛋白的20%,并成功由强阳离子交换柱芯Macro-Prep High S纯化;设计了一段含28个氨基酸残基的CPM (pHi 2.7、pH 7.4时电荷为-6.0),成功构建表达质粒pET-30a( )-CPM-rLL-37,并于杆菌BL21 star(DE3)中表达,融合蛋白约占全菌蛋白的35%,并被TALON亲和柱芯有效纯化.经抑菌圈实验证明两种方法所获得的rLL-37多肽对G 、G-菌都具有较好的杀菌力.结论 rLL-37在原核细胞中的高效表达,为深入研究rLL-37的杀菌活性奠定了基础.     

人源抗菌肽LL-37表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的:构建人源抗菌肽LL-37的表达载体pPIC9-LL-37,将其转化毕赤酵母GS115,诱导LL-37表达.方法:根据抗菌肽LL-37氨基酸序列及毕赤酵母偏爱密码子,应用互补延伸PCR技术扩增抗菌肽LL-37基因,定向克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9上,转化E.coli DH5α,构建重组分泌型酵母表达载体pPIC9-LL-37,PCR鉴定并测序;原生质球法转化毕赤酵母GS115,PCR扩增鉴定;甲醇诱导LL-37表达,筛选最高表达株,检测表达产物对大肠杆菌的抑菌活性,并对其进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹分析.结果: pPIC9-LL-37载体构建成功;转化毕赤酵母后PCR鉴定出LL-37基因;0.5%甲醇能诱导LL-37高表达,筛选出最高表达株,发酵上清约含LL-37 0.5 μg/ml,对E.coli具有较强的抑菌活性,电泳及Western印迹分析证实表达产物为LL-37.结论:成功构建pPIC9-LL-37载体,转化毕赤酵母后,经甲醇诱导能高表达分泌LL-37,表达的LL-37蛋白具有较强的抑菌活性.     

改良人源LL-37杀菌肽的融合表达及其杀菌活性

目的:将改良LL-37多肽以融合肽形式表达、纯化,并初步研究其杀菌活性. 方法:将编码改良的LL-37多肽的DNA序列放入载体pET-30a( ),转入工程菌BL21 star(DE3)中,用IPTG诱导表达得到含6×His标记的改良融合蛋白LL-37. 再以TALON柱芯亲和层析、SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用FXa裂解融合肽. 将裂解后多肽进一步用强阳离子交换柱Macro-Prep High S纯化、收集各洗脱峰, 脱盐、冻干. 采用抑菌圈法检测改良LL-37的抗菌活性. 结果:改良的LL-37多肽于载体pET-30a( )在杆菌BL21 star(DE3)中高效融合表达,用凝胶扫描显示融合蛋白的表达量约占全菌蛋白的35%. 融合蛋白经纯化后用SDS-PAGE鉴定在Mr 4000处见单一条带. 经抑菌圈法检测改良的LL-37多肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有很好的杀菌力. 结论:改良的人源性LL-37多肽以原核细胞进行融合表达是可行的,并具有较强的杀菌活性.     

抗菌肽LL-37对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜的抑制作用

目的 研究人抗菌肽LL-37对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)生物膜的相关作用,为MRSA的预防治疗以及新药物开发应用提供新策略.方法 运用微量肉汤稀释法测定LL-37对临床MRSA菌株的最小抑菌浓度;建立96孔板及6孔板生物膜体外模型;通过结晶紫定量法以及激光共聚焦荧光染色法检测LL-37对MRSA生物膜形成的影响.结果 微量肉汤稀释法测得LL-37对临床MRSA菌株的MIC为12.5 μmol/L.不同浓度LL-37作用后,结晶紫定量法结果表明1/20 MIC亚抑菌浓度的LL-37即可抑制生物膜形成(P＜0.01),且抑制率随用药浓度增加也随之提高,在1/4 MIC条件下生物膜形成抑制率可达到63％.与生理盐水对照组相比,激光共聚焦扫描显微镜下可见,用药组生物膜排列稀疏,厚度变薄,组成菌量明显减少.结论 低浓度的LL-37能够抑制MRSA生物膜的形成,并且对成熟生物膜结构也具有一定的破坏作用.     

人源LL-37杀菌多肽的改建及原核细胞中表达

目的改良人源杀菌肽LL-37的氨基酸序列,提高其杀菌力,并在原核细菌中表达.方法应用蛋白质分析软件(Anthepro 5.0、SWISS-MODEL等),对人源杀菌肽LL-37的氨基酸序列进行二维、三维结构及理化特性分析,将其中部分氨基酸残基进行替换,提高其正电荷,并以人源杀菌肽LL-37的基因序列为模板,进行相应的DNA序列替换,转入表达载体pET-28a( )于杆菌BL21(DE3)中表达、纯化,并初步研究其抗菌性.结果在维持LL-37空间构象不变的基础上,将Glu16、Asp26、Glu36分别替换为Gln16、Asn26、Gln36,其静电荷由pH 7.4时的 5.8提高到 9.0,并且其多肽N端疏水、C端亲水的特性不变.通过Touch-Down PCR法,成功获得改良LL-37多肽的DNA序列,并将重组质粒pET-28a( )-rLL-37在杆菌BL21(DE3)中表达,改良LL-37多肽成功由强离子交换柱芯Macro-Prep High S纯化,并对G 、G-菌具有一定的抗菌力.结论将杀菌肽LL-37多肽进行氨基酸残基替换并以原核细胞进行融合型表达是可行的,为改良LL-37的大量制备及杀菌活性研究奠定了基础.     

Expression of CC Chemokine Ligand 20 and CC Chemokine Receptor 6 mRNA in Patients with Psoriasis Vuigaris

Itiswell knownthatimmune inflammatorymechanism playsanimportantroleinpsoriasis .Therelationshipbetweenchemokine ,receptorsandpsori asishasbeenconfirmed[1] .CCchemokineligand 2 0(CCL2 0 )isanewmemberinthefamilyof β chemokineandalsotheonlyligandofCCchemoki…     

肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎患者腹腔白细胞维生素D受体及LL-37表达

目的评价腹腔白细胞维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)及LL-37是否参与了自发性细菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis,SBP)的发病机制。方法应用Real-ti me PCR方法检测19例肝硬化合并SBP患者及28例单纯腹水患者的腹腔白细胞VDR及LL-37 mRNA表达水平。评价它们与SBP的相关性,并分析肝硬化合并SBP患者的VDR及LL-37 mRNA水平的相关性。结果肝硬化合并SBP患者腹腔白细胞VDRmRNA表达水平为6.79×10-3±7.60×10-4,肝硬化单纯腹水患者为4.13×10-3±4.43×10-4,肝硬化合并SBP患者腹腔白细胞VDR水平显著高于单纯腹水患者,差异有统计学意义(P<0.01)。肝硬化合并SBP患者腹腔白细胞LL-37 mRNA表达水平为6.81×10-5±1.47×10-5,单纯腹水患者为1.74×10-5±2.42×10-6,前者显著高于后者,差异有统计学意义(P<0.01)。肝硬化合并SBP患者腹腔白细胞LL-37 mRNA表达水平与VDRmRNA表达水平呈正相关(r=0.700,P<0.01...     

银屑病患者外周血单个核细胞CCR5的表达及其意义

目的研究银屑病患者外周血单个核细胞趋化因子受体5(CCR5)的表达及其与银屑病皮损面积和严重程度指数(PASI)的关系。方法分离35例中重度寻常型银屑病患者及30例健康对照者外周血单个核细胞(PBMCs),用RT-PCR法测定PBMCs培养前后CCR5 mRNA的表达水平,免疫荧光标记-流式细胞仪检测CCR5阳性细胞比率。结果治疗前银屑病患者外周血单个核细胞中CCR5 mRNA表达水平明显高于治疗后及健康对照组,并与PASI呈正相关(r=0.516,P<0.05)。结论 CCR5可能通过活化与趋化单个核细胞到银屑病皮损而参与了银屑病的发病。     

寻常型银屑病患者血清及皮肤组织中PLA2活性研究

应用快速简便微量滴定法测定寻常型银屑病患者和正常人血清中及皮肤组织中磷脂酶A2 (PLA2 )活性 ,结果发现 ,寻常型银屑病患者血清及皮肤组织中PLA2 活性均高于正常对照组 ,进行期和皮损面积 >30 %组的患者血清中PLA2 活性明显高于静止期和皮损面积 <30 %的患者 ,但患者血中PLA2 水平与病程无关。提示血清中PLA2 活性可能与银屑病的病情活动性有关 ,PLA2 在银屑病的发病机制中起着一定的作用。     

Expression of IRF-4 and IBP in skin lesions of patients with psoriasis vulgaris

The expression of the interferon regulatory factor 4 (IRF-4) and the IRF-4-binding pro-tein (IBP) in psoriatic skin lesions was investigated. The expression of IRF-4 and IBP in skin lesions of 20 patients with psoriasis vulgaris were immunohistochemically dectected. Normal skin from 10 healthy people was used as normal control. The study showed that expression of IRF-4 was increased significantly in keratinocytes and inflammatory cells in the lesions of psoriasis vulgaris than that in the normal control. The detection revealed that IBP expression in keratinocytes, lymphocytes, hair follicles, and sebaceous glands in normal skin was significantly lower than that in the lesions of pso-riasis vulgaris (P<0.05). Both IRF-4 and IBP might be involved in the pathogenesis of psoriasis vul-garis.     

抗菌肽LL-37对结肠癌小鼠肿瘤生长的抑制作用及其机制

目的：探讨抗菌肽LL-37对结肠癌小鼠肿瘤生长和细胞凋亡的影响,阐明其抗肿瘤作用的可能分子机制。方法：构建LL-37过表达结肠癌HT-29细胞,采用qRT-PCR和Western blotting法检测HT-29细胞中LL-37 mRNA和蛋白表达水平。30只BALB/c小鼠随机分为对照组（给予未经感染的HT-29细胞）、空载组（给予感染空载质粒的HT-29细胞）、LL-37过表达组（给予感染LL-37过表达载体的HT-29细胞）、AMPK抑制剂组[给予感染空载体的HT-29细胞后,立刻尾静脉注射2 mg·kg^-1（Dorsomorphin,Dor）]和联合组（给予感染LL-37过表达载体的HT-29细胞后,立刻尾静脉注射2 mg·kg^-1 Dor）,每组6只。采用结肠癌HT-29细胞复制结肠癌小鼠模型,观察各组小鼠肿瘤体积并绘制生长曲线,感染24 d后剥离肿瘤测量质量并计算抑瘤率,TUNEL染色检测各组小鼠肿瘤细胞凋亡情况,Western blotting法检测各组小鼠肿瘤组织中自噬相关蛋白Beclin1、Atg5、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ及AMPK/mTOR通路相关蛋白AMPK、p-AMPK、mTOR及p-mTOR表达水平。结果：与对照组和空载组比较,LL-37过表达组小鼠结肠癌HT-29细胞中LL-37 mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,肿瘤质量和体积明显降低（P<0.05）,抑瘤率升高（P<0.05）,肿瘤细胞凋亡数减少,肿瘤组织中自噬相关蛋白Beclin1和Atg5表达水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及p-AMPK/AMPK比值均明显升高（P<0.05）,p-mTOR/mTOR比值明显降低（P<0.05）;与空载组比较,AMPK抑制剂组小鼠肿瘤质量和体积明显升高（P<0.05）、抑瘤率降低（P<0.05）,肿瘤细胞凋亡数减少,自噬相关蛋白Beclin1和Atg5表达水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及p-AMPK/AMPK比值明显降低（P<0.05）,p-mTOR/mTOR比值明显升高（P<0.05）;与LL-37过表达组比较,联合组小鼠肿瘤组织中Beclin1和Atg5表达水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及p-AMPK/AMPK比值明显降低（P<0.05或P<0.01）,p-mTOR/mTOR比值明显升高（P<0.01）。结论：抗菌肽LL-37能激活AMPK/mTOR信号通路促进细胞自噬,进而抑制结肠癌HT-29荷瘤小鼠的肿瘤生长。     

烟草烟雾暴露对哮喘大鼠气道CCR6 mRNA及其蛋白表达的影响

目的研究烟草烟雾暴露对支气管哮喘(简称哮喘)大鼠气道chemokine receptor 6(CCR6)表达的影响,探讨吸烟加重哮喘气道炎症的免疫学机制。方法雄性Wistar大鼠40只,随机分为对照组、烟雾暴露组、哮喘组和哮喘+烟雾暴露组,每组10只。建立哮喘大鼠模型和哮喘大鼠烟草烟雾暴露模型,采集大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)行白细胞计数及分类,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法及免疫组织化学法检测各组大鼠气道CCR6 mRNA及蛋白的表达。结果①哮喘组(69.0±3.5;4.1±1.0;8.9±2.0)、哮喘+烟雾暴露组(86.7±5.2;2.2±1.0;19.0±2.8)BALF中白细胞总数、嗜酸粒细胞、中性粒细胞均高于对照组(10.1±3.8;1.3±0.7;2.2±1.1)、烟雾暴露组(47.7±6.8;0.5±0.3;2.7±1.4)(P均<0.05);哮喘+烟雾暴露组BALF中白细胞总数和中性粒细胞高于哮喘组,嗜酸粒细胞低于哮喘组(P均<0.05)。②哮喘组(8.15±0.88;0.452±0.013)、哮喘+烟雾暴露组(15.16±0.87;0.531±0.024)CCR6 mRNA及其蛋白表达水平均明显高于对照组(1.01±0.52;0.299±0.027)、烟雾暴露组(5.55±0.54;0.442±0.018)(均P<0.01);哮喘+烟雾暴露组明显高于哮喘组(均P<0.01)。结论烟草烟雾暴露可通过促使气道CCR6 mRNA及其蛋白高表达,加重哮喘大鼠气道慢性炎症。     

Tregs细胞CCR4、CCR6表达异常在类风湿关节炎患者发病时的意义

目的探讨Tregs细胞CCR4、CCR6受体在类风湿关节炎（RA）患者发病时的意义。方法选择45例活动期RA患者（RA组）及30例健康体检者（对照组）,从外周血分离单个核细胞（PBMC）,采用流式细胞分析法检测RA患者外周血中CD4+Foxp3+细胞（Tregs）占比及其该类细胞上CCR4、CCR6的表达水平,并对Tregs上CCR4、CCR6水平与RA临床活动指标进行相关性分析。结果与对照组比较,RA活动期患者外周血Tregs细胞数量明显减少,差异有统计学意义（P＜0.05）;RA活动期患者外周血Tregs细胞表面趋化因子受体CCR4、CCR6表达水平与对照组的差异有统计学意义（P＜0.05）;RA活动期患者外周血Tregs细胞CCR4、CCR6表达水平与DAS28评分呈正相关（P＜0.05）。结论 RA患者外周血中Tregs细胞上趋化因子受体CCR4、CCR6表达增加,可能是Tregs细胞获得定向迁徙至病变关节能力的表现,也是机体炎症反应时反馈性调节的一种现象。     

抗菌肽LL-37对糖尿病心肌病大鼠心肌损伤的保护作用及其机制

目的:探讨抗菌肽LL-37对糖尿病心肌病(DCM)大鼠心肌损伤的影响,并阐明其可能的作用机制.方法:将48只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、低剂量LL-37组(0.5 mg·kg-1)和高剂量LL-37组(2.0 mg·kg-1),每组12只.除正常对照组外,其他各组大鼠均通过高脂饲料喂养联合腹腔注射链脲佐菌素(S...     

趋化因子受体CCR6在人肝癌组织中的表达及临床意义

目的:探讨趋化因子受体CCR6在肝癌组织中的表达及其临床意义。方法:采用免疫组化方法检测30例肝癌组织及癌旁组织CCR6表达情况,探讨其与临床病理特征的关系。结果:⑴肝癌组织及癌旁肝组织中均可以检测到CCR6的表达,肝癌组织表达水平明显高于癌旁组织(P<0.05)。⑵CCR6表达与病人性别、年龄、肿瘤大小、乙肝表面抗原、肿瘤分级及分期、肝硬化均无明显关系(P>0.05),而与肿瘤是否有包膜,门静脉浸润显著相关(P<0.05)。⑶肝癌患者术后生存率与CCR6的表达相关,阳性组生存率低于阴性组。结论:肝癌细胞表达CCR6趋化因子受体,其表达与门静脉浸润有关,有望成为判断肝癌侵袭性及预后的指标。     

原发性胆汁性肝硬化患者外周血单个核细胞中趋化因子及其受体CCR6 mRNA的表达及其临床意义

目的探讨原发性胆汁性肝硬化（PBC）患者外周血单个核细胞（PBMCs）中CC型趋化因子配体20（CCL20）和CC型趋化因子受体6（CCR6）mRNA的表达及临床意义。方法采用TaqMan荧光探针技术,建立实时荧光定量PCR的方法,分别检测50例PBC患者、50例乙型肝炎肝硬化患者及50例健康对照者PBMCs中CCL20和CCR6 mRNA的表达水平。结果 PBC患者中CCL20和CCR6的mRNA表达显著高于健康对照组和疾病对照组（P〈0.01）;并根据临床不同分期检测后发现,PBC患者中Ⅲ、Ⅳ期CCL20和CCR6 mRNA的表达较Ⅰ、Ⅱ期明显升高（P〈0.05）。结论 PBC患者CCL20和CCR6 mRNA的表达与PBC的发生发展存在一定的相关性,可能参与PBC的调控机制,从而可能为PBC的诊断和预防提供一定的线索。     

中国人群CCR5△32、CCR2-64I、SDF1-3’A基因多态性与HIV-1感染相关性的Meta分析

目的探讨中国人群CCR5△32、CCR2-64I、SDF1-3’A三种基因的多态性与HIV-1感染之间的关系。方法检索国内外有关中国人群CCR5△32、CCR2-64I、SDF1-3’A基因多态性与HIV感染相关性的病例对照研究文献并进行Meta分析。结果符合CCR5△32的研究共14个,累计HIV感染者病例1607例,正常对照组1632例。杂合子(wt/mt)、纯合子(mt/mt)和杂合子加纯合子(wt/mt+mt/mt)与野生基因型(wt/wt)相比合并的OR值(95%CI)分别为1.156(0.808,1.654)、0.997(0.198,5.022)、1.149(0.808,1.634)。符合CCR2-64I的研究共12个,累计HIV感染者病例1415例,正常对照组1239例。杂合子(wt/mt)、纯合子(mt/mt)和杂合子加纯合子(wt/mt+mt/mt)与野生基因型(wt/wt)相比合并的OR值(95%CI)分别为1.005(0.844,1.197)、1.191(0.808,1.754)、1.028(0.870,1.214)。符合SDFl-3’A的研究10个,累计HIV感染者病例1179例,正常对照组1003例。杂合子(wt/mt)、纯合子(mt/wt)和纯合子加杂合子(wt/mt+mt/mt)与野生基因型(wt/wt)相比合并的OR值(95%CI)分别为1.010(0.830,1.228)、1.188(0.860,1.643)、1.038(0.861,1.250)。结论中国人群CCR5△32、CCR2-64I、SDFl-3’A三种抗性基因与HIV-1感染之间无相关性,显示CCR5△32、CCR2-641、SDFl-3’A三种基因对中国人群HIV-1感染可能不具有保护作用,提示中国人群可能为易感人群。     

寻常型银屑病患者血清S100A12水平的测定及临床意义

目的了解寻常型银屑病患者血清中S100A12水平及其临床意义。方法 ELISA法检测50例寻常型银屑病患者和50例健康对照组血清S100A12水平,并计算患者银屑病面积和严重程度指数(psoriasis area and severity index,PASI)。使用Pearson分析法分析S100A12水平与PASI相关性。结果寻常型银屑病组血清S100A12水平为(154.4±114.9)ng/mL;对照组血清S100A12水平为(72.6±62.8)ng/mL。寻常型银屑病组S100A12水平高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。Pearson分析结果显示寻常型银屑病组S100A12水平与PASI评分之间呈正相关性(r=0.436,P0.05)。结论银屑病患者血清S100A12水平明显高于健康人,与疾病严重程度相关,可作为判断银屑病严重程度的指标。