uPA基因缺失型小鼠与野生型小鼠肝纤维化模型的比较研究

目的分别采用C57BL／6J野生型（wT）和uPA基因缺失（uPA-／-）小鼠构建肝纤维化动物模型,并进行比较研究。方法选取成年雄性C57BL／6J野生型和uPA-／-小鼠,分为4组：对照组（WT,uPA-／-）和模型组（WT,uPA-／-）,每组10只。模型组小鼠腹腔注射10％CCl40．15ml,对照组小鼠腹腔注射橄榄油0．15ml,每周2次,连续4周和6周。测定动物血清中ALT、AST、ALB及A／G等生化指标;盐酸水解法测定肝组织羟脯氨酸（Hyp）;用放射免疫法测定血清Ⅲ型前胶原蛋白（PCⅢ）含量;用HE染色及Masson三色胶原染色观察肝组织病理学改变。结果造模4周和6周时,无论是wT模型组小鼠还是uPA-／-模型组小鼠血清ALT和AST活性均较对照组小鼠显著升高,ALB含量降低（P〈0．01）;造模4周时,仅见uPA-／-小鼠的A／G含量降低（P〈0．01）。造模4周和6周时,uPA-／-模型组小鼠血清PCⅢ水平和肝脏组织Hyp含量较对照组显著升高（P〈0．01）;造模6周时,wT模型组小鼠才出现血清PCⅢ水平和肝脏组织Hyp含量升高（P〈0．01）,且升高值明显低于uPA-／-模型组小鼠。病理组织学观察显示,uPA-／-模型组的肝脏纤维化程度比wT模型组明显严重。结论与WT小鼠相比,采用uPA-／-小鼠建立肝纤维化动物模型的造模周期明显缩短,肝纤维化程度更严重。     

肝纤维化小鼠模型研究现状

肝纤维化是肝病领域研究的热点问题,其模型的制备有助于探究发病机理。本论文综述了目前报道的十种常用的肝纤维化小鼠模型,讨论了各自模型的成模原理、造模途径、模型效果、优缺点和用途,比较不同小鼠模型的异同,旨在为模型的选择提供依据,为肝纤维化的研究方向提供参考。     

MMP12、MMP13基因启动子区多态性与子宫内膜异位症遗传易感性研究

目的探讨MMP12、MMP13启动子区基因多态性与安徽地区育龄妇女的子宫内膜异位症(EMs)遗传易感性的关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态方法(PCR-RFLP)对221例EMs及235例对照组MMP12 A-82G、MMP-13 A-77G基因多态位点的基因型分析。结果 MMP12、MMP13各个基因型及等位基因频率在对照组和病例组的分布比较差异无统计学意义。结论 MMP12、MMP13启动子区A-82G、A-77G多态性与EMs无明显相关性,MMP12、MMP13启动子区的多态位点可能和安徽地区育龄妇女EMs的易感性无关。     

基质金属蛋白酶在肝纤维化组织中的表达

目的　探讨MMP -1和MMP -2在肝纤维化中的作用及其可能机制。方法　采用免疫组化SABC法 ,并应用图像分析法进行定量分析 39例手术切除的肝组织标本MMP -1,MMP -2的变化。结果　正常组与肝纤维化组MMP -1的表达差异无显著性 (P >0 0 5 ) ,而MMP -2的表达在肝纤维化组明显高于正常组 (P <0 0 1)。结论　基质金属蛋白酶在肝纤维化的发生和发展中可能起重要作用。     

大麻素受体1与FAK在血吸虫肝纤维化小鼠肝组织中的表达

目的：探讨大麻素受体1（CB1）与黏着斑激酶（FAK）在血吸虫肝纤维化小鼠肝组织中的表达。方法将32只昆明小鼠分为正常组（n＝10）和模型组（n＝22）,两组动物均普通喂养,8周后处死取肝组织。模型组小鼠采用腹壁贴附法建立血吸虫肝纤维化小鼠模型。根据纤维化程度将模型组分为Ⅰ级肝纤维化组（n＝4）、Ⅱ级肝纤维化组（n＝8）和Ⅲ级肝纤维化组（n＝10）。HE染色观察病理变化,Masson染色观察肝纤维化程度,免疫组织化学法检测不同纤维化组CB 1的表达,RT-PCR法检测各组CB 1 mRNA及FAK mRNA的表达。结果模型组可见明显虫卵结节及纤维化改变;不同纤维化组均可见CB 1、CB 1 mRNA及FAK mRNA表达,且随着肝脏纤维化程度的增加,CB1、CB1 mRNA及FAK mRNA的表达增加（P＜0．05）。结论 CB1和FAK参与了血吸虫肝纤维化的发生与发展。     

番茄红素对小鼠肝纤维化的保护作用

［摘要］目的: 探讨番茄红素对刀豆蛋白A(concanavalin A,Con A)诱导的小鼠肝纤维化的干预作用。方法: 24只小鼠随机均分为3组,对照组、模型组及预防组。模型组小鼠予以腹腔注射Con A(20 mg/kg),每周1次,对照组腹腔注射等量PBS溶液,预防组在注射Con A的同时予番茄红素灌胃(20 mg/kg),每天1次,8周后处死小鼠。收集血液检测肝纤维化指标,测定肝组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和丙二醛水平,病理学及半定量计分系统(semi-quantitative scoring system, SSS) 观察肝纤维化程度,免疫印迹法检测α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、Smad3蛋白、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表达。结果： 与对照组比较,模型组血清透明质酸(hyaluronic acid, HA)、层黏连蛋白(laminin, LN)、Ⅲ型前胶原(procollagen type Ⅲ, PC Ⅲ)水平,SSS计分,丙二醛,α-SMA、TGF-β1、Smad3的表达明显增加,SOD表达明显降低;与模型组相比,预防组HA、LN、PCⅢ水平,SSS计分,丙二醛,α-SMA、TGF-β1、Smad3的表达明显降低,SOD表达明显升高(P<0.01)。结论： 番茄红素通过减轻过氧化损伤,保护肝细胞,减少胶原生成,抑制α-SMA、TGF-β1及Smad3等致纤维化因子的表达,从而抵抗Con A诱导的肝纤维化作用。     

小鼠胆总管结扎致肝纤维化模型的建立与评价

目的:建立小鼠胆总管结扎致肝纤维化模型,并对其进行初步评价.方法:随机给予小鼠胆总管结扎和假手术,进行血清学指标(AST、ALT、ALP、TBIL、DBIL)检测;HE染色和天狼猩红染色进行形态学观察;采用免疫组化染色分析α-SMA和CK-19表达;实时荧光定量PCR检测α一SMA、Collagen-1 mRNA的表达.结果:小鼠胆总管结扎后2周可见CK-19阳性的棕褐色细胞明显增生,模型组血清AST、ALT、ALP、TBIL、DBIL明显增高,α-sMA、Collagen-1表达明显增强.结论:成功构建小鼠胆总管结扎致肝纤维化模型.     

强肝软坚丸对肝纤维化大鼠肝组织中MMP、TIMP表达的影响

目的:观察强肝软坚丸对肝纤维化的干预和治疗作用,探讨其作用机理。方法:120只SPF级雄性SD大鼠按照随机数字表法将其分为正常对照组、模型组、秋水仙碱治疗组、秋水仙碱干预组、强肝软坚丸治疗组、强肝软坚丸干预组6组。除正常对照组外,各组均采用未灭活猪血清腹腔注射造模,每只每次0.5 m L,每周两次,正常对照组给予同剂量生理盐水腹腔注射。各干预组造模同时每日1次灌胃给药:秋水仙碱溶液0.1 g·kg-1(秋水仙碱质量浓度为0.01 g·m L~(-1))、强肝软坚丸溶液2 g·kg-1(药物质量浓度为0.2 g·m L~(-1)),正常组、模型组和各治疗组每天同剂量灭菌水灌胃。于造模第5周末各组均随机抽取5%大鼠断头处死,肝组织病理提示造模成功,第6周初开始分别给予各治疗组药物灌胃,方法和剂量同各干预组。于造模10周结束后禁食12 h,各组均随机取10只大鼠断头处死,采集肝组织标本,通过常规HE染色和Masson染色观察各组大鼠肝组织病理学变化并进行Masson染色肝纤维化半定量分析;通过免疫组化染色,用图像分析法检测各组肝组织基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-1、MMP-2和MMP抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase,TIMP)-1、TIMP-2的表达。结果:与模型组比较,秋水仙碱组、强肝软坚丸组MMP-1表达均升高,差异有统计学意义(P0.05);提示强肝软坚丸可提高肝纤维化大鼠肝脏组织MMP-1的表达。与模型组比较,秋水仙碱干预组、强肝软坚丸治疗组和强肝软坚丸干预组MMP-2表达均升高,差异有统计学意义(P0.05)。与模型组比较,秋水仙碱组、强肝软坚丸组TIMP-1表达均下降,差异有统计学意义(P0.05);提示强肝软坚丸可降低肝纤维化大鼠肝脏组织TIMP-1的表达。与正常对照组比较,其余各组TIMP-2表达明显升高,差异有统计学意义(P0.05);与模型组比较,秋水仙碱组、强肝软坚丸组TIMP-2表达均下降,差异有统计学意义(P0.05)。结论:强肝软坚丸不仅可改善免疫损伤性肝纤维化大鼠一般情况和肝纤维化程度,也可使免疫损伤性肝纤维化大鼠肝组织中MMP-1、MMP-2的表达升高,TIMP-1、TIMP-2的表达降低。     

肝细胞线粒体NDUFA13蛋白缺陷可诱导小鼠自发性慢性肝纤维化

目的 探究肝细胞线粒体NDUFA13蛋白表达缺失在诱导小鼠肝脏纤维化发生中的作用及可能机制。方法 以肝脏特异性NDUFA13杂合敲除小鼠品系（NDUFA13fl/-;Alb-Cre）作为研究对象,以同窝NDUFA13fl/fl小鼠作为对照,8只/组,进行长达两年的实验观察,分别在实验早期和晚期处死小鼠获取肝组织样本。采用HE染色、Masson染色观察不同时期小鼠的肝组织病理变化及纤维化表型。Western blot检测肝组织中NDUFA13蛋白表达水平。免疫荧光分析巨噬细胞标志物F4/80与转化生长因子TGF-β1、肿瘤坏死因子TNF-α与白介素IL-1β的表达。免疫组化分析肝星型细胞活化标志物α-SMA、基质金属蛋白酶MMP-9与基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMP-1、胶原纤维Collagen-Ⅰ与Collagen-Ⅲ的表达情况。结果 HE染色、Masson染色发现4周 龄NDUFA13fl/-小鼠肝组织炎症浸润明显但未出现纤维化表型;2年龄NDUFA13fl/-小鼠肝组织严重损伤且伴大量胶原纤维产生。Western Blot结果显示2年龄NDUFA13fl/-小鼠肝组织中NDUFA13蛋白表达水平较对照小鼠明显降低（P<0.05）。免疫荧光与免疫组化结果显示,NDUFA13fl/-小鼠肝组织中巨噬细胞F4/80聚集增多并伴随大量TGF-β1产生（P<0.05）,以及TNF-α、IL-1β等炎症因子大量分泌（P<0.05）;同时,α-SMA、Collagen-Ⅰ及Collagen-Ⅲ表达明显增多（P<0.05）,基质金属蛋白酶MMP-9表达降低（P<0.05）,而其抑制剂TIMP-1表达明显增加（P<0.05）。结论 肝细胞线粒体NDUFA13蛋白缺陷能够诱导小鼠自发的慢性肝纤维化病理表型,可能与巨噬细胞/炎症因子信号诱导的肝星状细胞异常活化有关。     

茅台酒与乙醇影响二乙基亚硝胺致小鼠肝脏MMP2表达的差异

目的：研究茅台酒与乙醇影响二乙基亚硝胺（DEN）致小鼠肝脏金属基质蛋白酶2（MMP2）表达的影响。方法：将54只C57BL／6J小鼠随机分为正常对照组、茅台酒干预组、乙醇干预组,分别给予无菌生理盐水、茅台酒和乙醇灌胃处理,茅台酒干预组和乙醇干预组用DEN腹腔注射,35周后取小鼠肝脏,采用实时荧光定量PCR（RT—PCR）、免疫组化染色及Westernblot检测肝组织内MMP2mRNA及蛋白的表达。结果：MMP2基因在乙醇干预组中的mRNA表达显著高于正常对照组、茅台酒干预组,差异有统计学意义（P〈0．05）;MMP2mRNA水平在茅台酒干预组与正常对照组之间的差异无统计学意义（P〉0．05）;乙醇干预组MMP2蛋白表达比茅台酒干预组高,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：乙醇协同DEN致小鼠肝脏MMP2表达上调,含同样乙醇浓度的茅台酒没有这种作用。     

瘦素蛋白在小鼠日本血吸虫病肝纤维化组织中的表达及意义

目的 观察小鼠感染日本血吸虫后不同时期肝脏瘦素蛋白的表达,探讨瘦素在日本血吸虫病肝纤维化发生、发展中的意义.方法 日本血吸虫尾蚴皮肤敷贴法感染小鼠构建日本血吸虫病肝纤维化模型,于感染后不同时间取肝组织标本.HE和VG染色对肝组织进行病理学检查,半定量分析肝纤维化程度;采用免疫组织化学SP法动态观察瘦素及肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)标记物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况.结果 模型组肝胶原含量随病程发展呈进行性增多,肝纤维化程度随病程发展呈进行性加重;α-SMA阳性细胞于炎症早期在汇管区已有表达,随病程进展进行性增加,α-SMA阳性表达主要位于胶原纤维所在部位;瘦素阳性表达出现的时间、部位和进程类似于α-SMA阳性表达情况.相关分析表明,α-SMA蛋白表达与胶原含量呈正相关(r=0.956,P＜0.01),而与肝纤维化程度也呈正相关(r=0.804,P＜0.01) ;与瘦素蛋白呈正相关(r=0.836,P＜0.01);瘦素蛋白与胶原含量呈正相关(r=0.758,P＜0.01),而与肝纤维化程度也呈正相关(r=0.823,P＜0.01).结论 HSC是日本血吸虫病肝纤维化发生发展过程中的关键细胞,而瘦素在该过程中发挥重要的促肝纤维化作用,可望成为新的治疗靶点.     

Th2细胞因子在日本血吸虫小鼠肝脏中的变化

为探讨Th2细胞因子在感染日本血吸虫小鼠肝脏中的变化及其在肝纤维化中的意义,采用ABC免疫组化法,VG染色及多媒体病理图文定量分析,研究感染后IL-4、IL-5、IL-10和肝内胶原纤维的变化。结果发现小鼠肝脏IL-4、IL-5、IL-10随感染时间延长而明显升高,肝内胶原纤维化程度随感染时间延长而逐渐增多和加强,与Th2细胞因子表达呈显著正相关。提示小鼠肝脏是感染血吸虫后机体免疫应答场所之一,Th2细胞因子在血吸虫肝脏肉芽肿及纤维化形成中起重要介导作用。     

Th_2细胞因子在日本血吸虫小鼠肝脏中的变化及其与肝纤维化的比较

为探讨Ｔｈ２细胞因子在感染日本血吸虫小鼠肝脏中的变化及其在肝纤维化中的意义，采用ＡＢＣ免疫组化法，ＶＧ染色及多媒体病理图文定量分析，研究感染后ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１０和肝内胶原纤维的变化。结果发现：小鼠肝脏ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１０随感染时间延长而明显升高，肝内胶原纤维化程度随感染时间延长而逐渐增多和加强，与Ｔｈ２细胞因子表达呈显著正相关。提示小鼠肝脏是感染血吸虫后机体免疫应答场所之一，Ｔｈ２细胞因子在血吸虫肝脏肉芽肿及纤维化形成中起重要介导作用。     

uPA-uPAR系统对骨巨细胞瘤细胞p44(MAPK)信号转导的影响

目的研究uPA／uPAR系统对骨巨细胞瘤细胞MAPK信号转导的影响。方法分离并培养骨巨细胞瘤细胞，用免疫组化检测骨巨细胞瘤组织中uPAR的表达水平，用免疫共沉淀方法检测外源激活或阻断uPA—uPAR对骨巨细胞瘤细胞信号转导通路的p44（MAPK）蛋白磷酸化水平的影响。结果仅有单核基质细胞可以在体外培养中长期生存；在骨巨细胞瘤组织中uPAR主要表达在部分单核基质细胞和一些多核巨细胞的胞膜上；将uPA—ATF加入培养的骨巨细胞瘤细胞后，细胞信号通路上的p44蛋白磷酸化水平明显增高。用uPAR抗体处理后，细胞p44蛋白磷酸化水平明显降低。说明uPA—ATF具有细胞信号转导活性，该活性受uPAR拮抗剂的影响。结论本实验检测到uPA—uPAR系统是通过p44（MAPK）信号转导通路转导信息，从而调节骨巨细胞瘤细胞增殖、分化及其他生物学行为。     

Dynamic Observation of Liver Fibrosis in Mice Infected with Schistosoma japonica

Summary： The expression of TNF-α in the liver at different periods post Schistosoma japonica infection and the effect on liver fibrosis after supplementary injection of these cytokines were investigated. The mice infected with schistosome cercariae were divided into 3 groups., normal control group, TNF-α-untreated infection group and TNF-α-treated infection group. ABC immunohistochemistry and pathologic image multimedia quantification system were applied to dynamically detect the activity of TNF-α. The results showed that the levels of TNF-α in the liver in TNF-α-untreated infection group were slowly decreased with prolongation of infection time （from 8th, 11th, 14th to 18th week）, while in the TNF-α-treated infection group, those were increased significantly after intraperitoneal injection of TNF-α at 6th week after infection. At first to 8th week after the final injection of TNF-α, the intrahepatic TNF-α levels in the TNF-α-treated infection group were significantly higher than in the other two groups （P〈0.01）, and the granulomatous inflammation and fibrosis in the liver were also milder in the normal control group. It was concluded that at the early stage of Schistosoma japonica infection mouse liver mainly released Thl cytokine and TNF-α from Thl activated macrophages. Six weeks after infection （post egg deposition）, exogenous supplement with intraperitoneal injection of TNF-α could induce the enhanced expression of Thl cytokines and alleviate the liver granulomatous inflammation and fibrosis.     

IL-12在血吸虫感染小鼠肝脏中的表达及其对肝纤维化的影响

目的探讨日本血吸虫感染小鼠肝脏中白细胞介素-12（IL-12）的表达及其对肝纤维化的影响。方法在小鼠感染血吸虫后的不同时期（6、8、10、12周），分别采用免疫组织化学法观察肝脏IL-12的变化，VG染色及多媒体病理图文定量分析系统检测注射基因重组小鼠IL-12（rIL-12）前、后胶原纤维含量的改变。结果小鼠肝脏IL-12含量随感染时间延长而缓慢下降，胶原纤维含量随感染时间延长逐渐升高，经皮下注射rIL-12后小鼠肝脏IL-12含量随着相应因子补充而显著上升，胶原纤维含量则逐渐降低。结论IL-12能明显抑制血吸虫感染小鼠肝脏胶原纤维合成，延缓肝纤维化发生。     

大鼠肝纤维化模型中基质金属蛋白酶-2及其抑制物的表达

目的了解基质金属蛋白酶－２（ＭＭＰ－２）及其组织型抑制剂（ＴＩＭＰ－２）在纤维化过程中的变化,分析它们在始动阶段的作用。方法用免疫组化和酶图法,在异种血清诱导的大鼠肝纤维化模型不同阶段,作肝细胞内ＭＭＰ－２、ＴＩＭＰ－２、酶降解底物Ⅳ型胶原（ＣｏｌⅣ）以及结蛋白（Ｄｍ）定位和半定量研究。结果实验鼠于４周末形成细胞间隔,８周末发展为肝纤维化,含细胞－纤维间隔或纤维间隔,１２、１６周仍为纤维间隔。酶图法表明４周末ＭＭＰ－２活性升高２．５倍左右,８周末仍高于对照鼠。免疫组化显示４周末ＭＭＰ－２阳性细胞数最多,连续切片观察ＭＭＰ－２与Ｄｍ阳性细胞（活化的肝星状细胞）几乎重叠。８周末阳性细胞数有所减少,１２周末明显减少。半定量变化趋势与酶图法一致。ＴＩＭＰ－２于８周末表达开始升高,１２周末达最高。２周末ＣｏｌⅣ表达开始上升,４周末达高峰,以后缓慢下降。结论肝纤维化早期ＭＭＰ－２活性增高,继而ＴＩＭＰ－２分泌过多,ＭＭＰ－２活性受抑,ＥＣＭ降解受阻,纤维化进一步发展。     

CCl4诱发galectin-3基因敲除鼠急性肝损伤中GRP78和BAD表达

目的观察半乳糖凝集素-3(galectin-3)基因敲除鼠肝脏中GRP78和BAD表达,探讨急性肝损伤中galectin-3抗凋亡作用。方法制备GRP78和BADDNA探针,分别利用Western和Northern杂交技术检测在CCl4损伤galectin-3基因敲除鼠肝组织中GRP78和BAD蛋白和mRNA表达。结果成功构建PTS1-BAD和PTS1-GRP78扩增质粒。GRP78蛋白主要定位在微粒体中,galectin-3 / 小鼠经CCl4处理6-14h后,肝脏GRP78表达上调至高峰,而后恢复正常;在galectin-3-/-小鼠中,CCl4处理后GRP78表达水平未见变化。正常或者CCl4处理的galectin-3 / 和-/-小鼠中GRP78 mRNA表达未见显著差别。galectin-3 / 鼠中主要定位在微粒体中在CCl4处理前后未见BAD蛋白在细胞浆和微粒体中表达。galectin-3-/-中BAD主要定位在肝细胞浆和微粒体,CCl4处理前后表达升高。BAD mRNA 1.6kb片段在galectin-3 / 和-/-小鼠经CCl4处理前后均没有变化,但0.9kb片段galectin-3 / 和-/-小鼠经CCl4处理后表达降低。结论CCl4可诱导肝脏mRNA降解,该过程中参与细胞凋亡的蛋白质表达升高。galectin-3 / 小鼠CCl4处理后肝细胞凋亡以内质网应急途径为主,而galectin-3-/-则以线粒体为主。在肝细胞中galectin-3对线粒体凋亡和内质网应急途径均有抑制作用。