下调间隙连接蛋白43表达促进人胰腺癌细胞的侵袭和血管形成

背景：细胞间缝隙连接由间隙连接蛋白（Cx）构成,在肿瘤侵袭和血管形成过程中起重要作用。目的：以RNA干扰技术下调人胰腺癌细胞Cx43表达,观察Cx43表达改变对胰腺癌细胞缝隙连接的影响,探讨其在胰腺癌细胞侵袭和血管形成中的作用。方法：设计靶向Cx43的小干扰RNA（siRNA）并转染人胰腺癌细胞株BxPC3,以实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法检测Cx43siRNA的干扰效果。染料传递实验检测细胞间缝隙连接,体外血管形成实验检测与BxPC3细胞共培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的血管生成能力,体外侵袭实验检测BxPC3细胞的侵袭能力。结果：Cx43siRNA转染BxPC3细胞后,细胞Cx43mRNA和蛋白表达明显下调。Cx43表达下调后,BxPC3细胞间、BxPC3细胞与HUVEC间缝隙连接显著减少;与BxPC3细胞共培养的HUVEC血管生成增多,每视野血管节点数显著高于对照组（15.69±1.09对5.24±1.32,P〈0.05）;BxPC3细胞的侵袭能力亦明显增强,每视野侵袭细胞数显著多于对照组（76.0±3.0对48.0±2.0,P〈0.05）。结论：下调Cx43表达可能通过减少细胞间缝隙连接,促进人胰腺癌细胞的侵袭和血管形成。     

CD44V6在人类大肠癌细胞中的表达及其对细胞骨架的影响

目的研究 CD44V6在人类大肠癌细胞中的表达及其对细胞骨架的影响,探讨 CD44V6影响肿瘤转移的作用机理。方法应用原位 RT-PCR 分子杂交、免疫组化、免疫荧光定量分析的方法研究 CD44V6在人类大肠癌细胞及大肠癌组织中的表达,应用免疫荧光及共聚焦三维图象重构分析的方法,研究 CD44V6对大肠癌细胞的细胞骨架的影响。结果 CD44V6在 HT29、Lovo 细胞中均有表达,不管在 mRNA 水平还是在蛋白质水平,高转移能力的 Lovo 细胞表达 CD44V6均高于低转移能力的 HT29细胞。将 HT29、Lovo 细胞用 CD44V6单抗封闭则发现 CD44V6能使 HT29、Lovo 细胞的细胞骨架发生改变。结论 CD44V6的表达与大肠癌细胞的转移潜能有关。CD44V6能影响大肠癌细胞骨架的构像和分布。从而影响大肠癌细胞的运动能力而促进大肠癌转移。     

CD44V6在人类大肠癌细胞中的表达及其对细胞骨架的影响

目的 研究CD44V6在人类大肠癌细胞中的表达及其对细胞骨架的影响，探讨CD44V6影响肿瘤转移的作用机理。方法 应用原位RT-PCR分子杂交、免疫组化、免疫荧光定量分析的方法研究CD44V6在人类大肠癌细胞及大肠癌组织中的表达，应用免疫荧光及共聚焦三维图象重构分析的方法，研究CD44V6对大肠癌细胞的细胞骨架的影响。结果CD44V6在HT29、Lovo细胞中均有表选．不管在mRNA水平还是在蛋白质水平．高转移能力的Lovo细胞襄选CD44V6均高于低转移能力的HT29细胞。将HT29、Lovo细胞用CD44V6单抗封闭则发现CD44V6能使HT29、Lovo细胞的细胞骨架发生改变．结论CD44V6的表选与大肠癌细胞的转移潜能有关。CD44V6能影响大肠癌细胞骨架的构像和分布．从而影响大肠癌细胞的运动能力而促进大肠癌转移。     

p21活化激酶1基因在大肠癌细胞中的表达及意义

目的 探讨p21活化激酶l（PAK1）基因在大肠癌细胞中的表达及意义。方法 运用免疫印迹技术检测PAK1基因在8株不同转移和恶性潜能大肠癌细胞（LoVo、SW480、SW620、SW1116、HT29 HCT116和CO-LO320细胞）中的表达。结果 与HCT116、HT29、SW480、SW1116和LST细胞相比,PAK1在LoVo、COLO320和SW620大肠癌细胞中蛋白表达明显增加,而HT29和SW480细胞中的PAK1蛋白表达亦强于SW1116和LST细胞,但PAK1在SW1116和LST细胞几乎无表达。结论 PAK1蛋白过度表达可促进大肠癌的发生、发展,且可能与大肠癌的恶性生物学表型密切相关。     

血管紧张素Ⅱ下调肥厚心肌细胞缝隙连接蛋白Cx43的表达

目的研究血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后连接蛋白43（Cx43）表达的变化及与细胞周期分布的关系。方法分离培养大鼠心肌细胞，用血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大，72h后用RT-PCR，Western-blot和免疫荧光方法观察心肌细胞Cx43基因和蛋白表达，用流式细胞仪测定法观察心肌细胞周期分布变化以及与Cx43表达量的关系。结果血管紧张素Ⅱ处理后的心肌细胞表现细胞肥大且细胞活力增强，S期、G2-M期细胞百分比增加，细胞内G2-M（二倍体）DNA含量降低，Cx43蛋白表达明显低于正常对照组，呈浓度依赖性下调，Cx43mRNA表达水平显著下调，Cx43蛋白表达下调与细胞周期分布的改变相关。结论血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后Cx43基因及Cx43蛋白表达出现浓度依赖性下调，这一改变与心肌肥大过程中的细胞周期变化有关，提示血管紧张素Ⅱ可能通过调控Cx43基因的表达而参与缝隙连接重构过程，而Cx43表达的变化可能与心肌肥大的机制有关。     

血管紧张素Ⅱ下调肥厚心肌细胞缝隙连接蛋白Cx43的表达

目的 研究血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后连接蛋白43(Cx43)表达的变化及与细胞周期分布的关系.方法 分离培养大鼠心肌细胞,用血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大,72 h后用RT-PCR,Western-blot和免疫荧光方法 观察心肌细胞Cx43基因和蛋白表达,用流式细胞仪测定法观察心肌细胞周期分布变化以及与Cx43表达量的关系.结果 血管紧张素Ⅱ处理后的心肌细胞表现细胞肥大且细胞活力增强,S期、G2-M期细胞百分比增加,细胞内G2-M(二倍体)DNA含量降低,Cx43蛋白表达明显低于正常对照组,呈浓度依赖性下调,Cx43 mRNA表达水平显著下调,Cx43蛋白表达下调与细胞周期分布的改变相关.结论 血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后Cx43基因及Cx43蛋白表达出现浓度依赖性下调,这一改变与心肌肥大过程中的细胞周期变化有关,提示血管紧张素Ⅱ可能通过调控Cx43基因的表达而参与缝隙连接重构过程,而Cx43表达的变化可能与心肌肥大的机制有关.     

大肠癌HT-29,Lovo细胞P 53转录表达差异同步研究

目的探讨HT-29,Lovo两种大肠癌细胞中p53基因mRNA转录及蛋白表达水平与其分子生物学特性之间的关系.方法以RNA真空转移法行Northern blot分析,以光敏生物素标记的探针行细胞原位杂交,对此两种细胞中p53 mRNA转录水平分别进行比较研究.采用免疫细胞化学染色方法同步对此两种细胞中p53蛋白表达进行比较研究.结果Northern blot与原位杂交检测结果一致.两种细胞中均为p53 mRNA转录阳性,前者强度明显高于后者.p53蛋白仅在HT-29细胞检出,Lovo细胞为阴性.结论两种细胞内存在不同类型p53基因,HT-29细胞为突变型,Lovo细胞为野生型.p53转录表达水平的差异可能与其细胞分化程度及转移有关.     

黄芩苷对肝癌细胞GJIC及Cx26、Cx43表达的影响

目的:探讨黄芩苷对肝癌细胞缝隙连接细胞间通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)及细胞间隙连接蛋白26(connexion26,Cx26)、细胞间隙连接蛋白43(connexion43,Cx43)表达的影响.方法:人肝癌细胞株SMMC-7721分为黄芩苷10、20、40mg/L组和对照组.划痕染料示踪技术检测GJIC的变化.用RT-PCR法检测肝癌细胞Cx26、Cx43基因表达,用Westernblot法检测Cx26蛋白表达,用免疫细胞化学检测Cx43蛋白表达.结果:对照组细胞的染料局限于划痕两侧的细胞内,无明显的荧光染料传输现象.随着黄芩苷浓度的增强,LY染料传输范围逐渐增大.黄芩苷10、20、40mg/L各浓度组Cx26mRNA表达水平与对照组比较显著提高(0.148±0.111,10.253±0.222,17.283±0.024vs0.138±0.111;P<0.05).Cx26蛋白表达量与对照组比较明显增加(0.516±0.029,0.759±0.020,1.019±0.076vs0.367±0.029;P<0.05).黄芩苷各浓度组Cx43mRNA表达量与对照组比较无显著变化.而Cx43蛋白的表达水平与对照组比较明显增加(5.512±0.003,5.844±0.046,6.216±0.015vs4.316±0.032;P<0.05).结论:黄芩苷促进肝癌细胞Cx26及Cx43表达,导致肝癌细胞GJIC功能的恢复,这很可能是黄芩苷抑制肿瘤生长的分子机制之一.     

胃癌组织中PTEN、Cx43及Skp2的表达及其相关性

采用免疫组化方法检测PTEN、Cx43及skp2蛋白在胃癌及正常胃组织中的表达。结果发现,胃癌组织中PTEN、Cx43、skv2蛋白的阳性表达率分别为51．81％（43183）、46．99％（39／83）和69．88％（58／83）,与正常胃黏膜组织比较,有统计学差异（P均〈0．05）。PTEN、Cx43、Skp2蛋白的表达均与为癌细胞的病理分期、组织分化类型和有无淋巴结转移显著相关（P〈0．05）。胃癌组织中PTEN、Cx43与Skp2蛋白的表达呈负相关（r别为-0．582和-0．382,P均〈0．001）,FIEN与Cx43的表达呈正相关（r=0．570,P〈0．1301）。认为胃癌组织中skp2蛋白水平的高表达和FTEN、Cx43蛋白的低表达可能与胃癌组织的浸润和转变有关,且联合监测可以用于判断胃癌的生物学行为。     

细胞接触诱导骨髓间充质干细胞获得窦房结细胞表型的初步研究

目的 通过建立体外骨髓间充质干细胞(BMSCs)与纯化培养的乳鼠窦房结细胞共培养体系,探讨窦房结微环境对BMSCs分化的诱导作用.方法 自新生乳鼠的心脏分离窦房结细胞,并差速贴壁纯化培养,免疫荧光检测超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因4(HCN4)和缝隙连接蛋白45(Cx45)的表达.自成年大鼠的骨髓分离BMSCs,传2代后,用脂质体介导pEGFP-N1转染标记BMSCs,再与纯化培养的窦房结细胞以1:5比例进行直接接触共培养,并用窦房结细胞条件培养液对转染后的BMSCs进行培养作为对照.1周后应用免疫荧光检测BMSCs的HCN4和Cx45表达.结果 接触共培养组中,可见部分表达绿色荧光蛋白的BMSCs同时表达HCN4和Cx45,而条件液培养组中未见HCN4和Cx45的表达.结论 直接接触共培养体系可诱导BMSCs初步分化为窦房结样细胞.     

Cx43和Fas在胃癌组织中的表达

目的研究间隙连接蛋白43（Cx43）和凋亡调节因子Fas在胃癌组织中的表达情况。方法应用免疫组化法检测70例胃癌患者手术切除的癌组织和癌旁正常组织中Cx43和Fas表达水平。结果Cx43在胃癌组织中的表达率为44．29％（31／70）,在癌旁正常组织中的表达率为92．86％（65／70）,P〈0．01;Fas在胃癌组织中的表达率为40．00％（28／70）,在癌旁正常组织中表达率为87．14％（61／70）,P〈0．01。Cx43表达水平与胃癌组织学分化程度、浸润深度、淋巴结转移有关（P〈0．05）,Fas表达水平与胃癌组织学分化程度、浸润深度、TMN分期、淋巴结转移有关（P〈0．05）。结论胃癌组织中Cx43和Fas表达水平的检测有助于判断胃癌的恶性程度。     

高转移性结肠癌细胞株HT29的基因筛选

目的在结肠癌HT29细胞株基础上获得高转移结肠癌细胞株,并建立高侵袭性结肠癌肝转移的动物模型。方法将结肠癌HT29细胞株通过体内连续传代方法获得高转移结肠癌细胞株,并成功建立高侵袭性结肠癌肝转移的动物模型,采用cDNA-microarray技术比较结肠癌细胞株及高转移细胞株形成的肝转移组织,获得与结肠癌肝转移相关的差异基因。采用荧光定量PCR方法检测亲代细胞和高转移细胞的基因表达。结果建立高侵袭性结肠癌肝转移的动物模型。定量PCR检测显示结肠癌高转移性HT29的酪氨酸激酶受体家族、基质金属蛋白酶家族和细胞周期调控蛋白的基因较亲代HT29细胞均有不同程度的变化。结论结肠癌HT29细胞株及其高侵袭性结肠癌肝转移的动物模型为结肠癌转移的生物学研究提供了一个良好的技术平台。     

肿瘤坏死因子-α活化的人源骨髓间充质干细胞对结肠癌细胞 HT29生长及侵袭的影响

目的：探讨 TNF-α活化的人源骨髓间充质干细胞（MSC）对结肠癌细胞株 HT29生长、转移的影响。方法制备、收集 MSC 条件培养液（CM）及 TNF-α活化的 MSC（T-MSC）条件培养液（TCM）。采用 MTT 比色法检测在α-最低基础培养液（α-MEM）、CM、TCM 中培养2、4、6 d 的 HT29细胞增殖率。制备下层不接种细胞、接种 MSC 或接种 T-MSC,上层均含有 HT29细胞的双层软琼脂糖共培养体系,表面加入α-MEM 后培养30 d,检测单细胞肿瘤集落形成能力。利用悬滴法制备的 HT29肿瘤球进行3D 基质胶侵袭实验,检测α-MEM、CM、TCM 中 HT29细胞的侵袭能力。实时聚合酶链反应检测在α-MEM、CM、TCM 中培养的 HT29细胞中上皮钙黏素 mRNA 表达变化。两组数据比较采用成组 t 检验,多组数据比较采用单因素方差分析。结果培养4～6 d 后,CM 或 TCM 组 HT29细胞增殖率显著高于α-MEM 组（第4、6天各组吸光度值分别为0．57±0．06、0．51±0．02、0．22±0．01和0．45±0．01、0．73±0．04、0．15±0．02）,差异均有统计学意义（tCM ＝8．090、21．140,tTCM ＝21．190、17．950;P 均＜0．05）。软琼脂糖实验培养后30 d,T-MSC 共培养的 HT29单细胞集落数目明显多于其他两组。3D侵袭实验中 TCM 刺激后 HT29向周围侵袭能力强于α-MEM 组[侵袭率分别为（82±2）％和（65±8）％],差异有统计学意义（t＝2．848,P ＜0．05）。TCM 刺激后 HT29细胞中膜上皮钙黏素 mRNA 水平较α-MEM 组显著下降（0．32±0．02比1．00±0．00）,差异有统计学意义（t ＝35．190,P ＜0．05）。结论TNF-α活化的人源 MSC 可促进结肠癌细胞生长及侵袭。     

E-cadherin对人大肠癌细胞株浸润行为的影响

目的研究上皮性钙调蛋白(E-cad)对人大肠癌细胞株浸润行为及Ⅳ型胶原酶(Ⅳcol)表达的影响。方法定量检测体外培养的人大肠癌细胞 E-cad 及Ⅳcol 的表达;应用人羊膜浸润模型,观察 E-cad 对大肠癌细胞浸润羊膜时的形态变化及细胞内Ⅳcol 表达的影响。结果低转移细胞株 HT29弱表达 E-cad,而高转移细胞株 LoVo几乎不表达 E-cad。两细胞株均表达Ⅳcol,高转移细胞株 LoVo 表达Ⅳcol 高于低转移株 HT29。瘤细胞用 E-cad单抗封闭后培养于羊膜上,两细胞株内Ⅳ型胶原酶表达明显增高,且以高转移株变化更为明显。结论 E-cad 可能通过细胞内信使传递作用影响细胞内Ⅳ型胶原酶的表达,从而对肿瘤影响浸润.     

大黄素抑制Lovo细胞迁移与黏附的作用

目的探讨大黄素对lovo细胞与内皮细胞迁移和黏附的影响。方法采用MTT法检测大黄素对Lovo细胞和HUVECs增殖的影响,分光光度法检测大黄素对Lovo细胞与HUVECs黏附的影响,Transwell双层小室观察大黄素对Lovo细胞迁移穿过单层HUVECs的影响。结果与对照组比较,10～40μmol/L大黄素对Lovo细胞和HUVECs增殖无显著性影响(P>0.05);与对照组比较,大黄素能够降低Lovo细胞与内皮细胞的黏附(P<0.05),并显著减少迁移与穿过单层HUVECs的Lovo细胞数目(P<0.05)。结论大黄素具有抑制肿瘤细胞与内皮细胞的黏附以及肿瘤细胞迁移穿过内皮细胞的作用,提示其具有抗肿瘤转移的潜能。     

HSV-TK/GCV系统杀伤高、低转移卵巢癌细胞株旁观者效应的观察

目的探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷（HSV-TK/GCV）系统杀伤高、低转移卵巢癌细胞时的旁观者效应及其与间隙连接蛋白（Cx）43表达的关系。方法比较经HSV-TK/GCV作用的高、低转移性卵巢癌细胞株Ho-8910pm和Ho-8910旁观者效应;检测两种细胞Cx43的表达。结果HSV-TK/GCV系统对Ho- 8910细胞产生明显的旁观者效应,而对Ho-8910pm细胞旁观者效应较弱;Ho-8910细胞的Cx43表达为7.12（平均荧光强度）,而Ho-8910pm细胞的Cx43表达为1.34,两者相比,P〈0.05。结论HSV-TK/GCV系统杀伤低转移卵巢癌细胞时旁观者效应强,与Cx43的表达水平有关。     

胃癌血管靶向肽GX1抑制人胃癌血管内皮细胞增殖的机制研究

为提高胃癌血管抑制治疗的选择性,本课题前期研究应用噬菌体呈现肽库技术筛选获得了人胃癌血管靶向性环七肽GX1,并发现GX1能抑制人胃癌血管内皮细胞增殖,诱导细胞凋亡。目的：探讨GX1抑制人胃癌血管内皮细胞增殖的相关机制。方法：分别以40μmolfLGX1和40μmol／L对照肽Pep2处理正常人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和与人胃腺癌细胞株SGC7901体外共培养、产生肿瘤血管内皮相关特征的CO—HUVEC。流式细胞术检测细胞周期分布,基因芯片检测筛选GX1组与对照肽Pep2组CO—HUVEC差异表达基因并行GO分类,蛋白质印迹法检测凋亡相关基因蛋白表达。结果：与对照肽Pep2相比,GX1对CO．HUVEC和正常HUVEC的细胞周期分布均无明显影响（P〉0．05）。两组co-HUVEC共存在三百余个显著差异表达基因,其中与肿瘤生长、侵袭、转移相关者-百余个,功能主要涉及信号转导、凋亡、应激、细胞黏附、细胞代谢等。GX1组CO—HUVEC的Bax、CleavedCaspase-3蛋白表达明显上调,Bel-2蛋白表达明显下调,Caspase-8蛋白表达无明显变化。结论：GX1可能通过下调Bcl-2／Bax比值,经线粒体途径诱导靶细胞凋亡,实现对人胃癌血管内皮细胞增殖的抑制作用。     

PHLPP1对结直肠癌细胞生长抑制及细胞周期阻滞的作用

目的探讨PHLPP1对结直肠癌细胞生长和细胞周期的影响。方法以荧光定量PCR和Western印迹方法检测结直肠癌细胞HT29、Lovo、SW480和人正常结肠上皮细胞FHC中PHLPP1表达水平。在结直肠癌细胞中转染pcDNA3.1-PHLPP1,筛选稳定转染的细胞株用荧光定量PCR和Western印迹方法测定细胞中PHLPP1水平。MTT测定结直肠癌细胞增殖情况,PI单染法测定结直肠癌细胞周期变化,Annexin V-FITC/PI双染法检测结直肠癌细胞凋亡情况,Western印迹检测细胞周期蛋白(Cyclin)D1、细胞周期依赖性蛋白激酶(Cdk)4和凋亡蛋白活化型Caspase-3、活化型Caspase-9(Cleaved Caspase-9)表达水平。结果 PHLPP1表达水平由高到低依次为:FHCSW480HT29Lovo,选用Lovo细胞做后续实验。pcDNA3.1-PHLPP1转染可以上调结直肠癌细胞中PHLPP1表达水平。高表达PHLPP1的结直肠癌细胞的增殖能力降低,细胞G0/G1期比例升高,细胞中CyclinD1、Cdk4蛋白水平降低,细胞凋亡率升高,细胞中活化型Caspase-3、活化型Caspase-9蛋白水平也升高。结论 PHLPP1在结直肠癌细胞中表达下调,上调其表达可以将结直肠癌细胞周期阻滞在G0/G1期,诱导结直肠癌细胞凋亡,降低结直肠癌细胞增殖能力。     

基因重组质粒pBudCE4.1_Cx43转染骨髓间充质干细胞及其表达和功能的测定

目的用重组质粒pBudCE4.1_Cx43转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)的mRNA和蛋白的表达及细胞间隙连接通讯功能的变化。方法用脂质体转染的方法将重组表达质粒pBudCE4.1_Cx43转染细胞;用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测Cx43mRNA表达,免疫细胞化学法检测Cx43蛋白的表达,划痕染料示踪法检测细胞间通讯功能。结果转染Cx43基因后的细胞在形态学、生长能力等方面的特征与未转染的细胞比较没有明显变化;Cx43mRNA与蛋白的相对表达量和对照组相比差异显著(P<0.01);转染组细胞传递的荧光强度与对照组相比亦差异显著(P<0.01)。结论转染Cx43基因的BMSCs能表达有生物学活性的基因产物,改善细胞间通讯功能,能为细胞性心肌成形术提供较理想的基因工程细胞。     

缺氧对肥大心肌细胞凋亡和缝隙连接蛋白43表达的影响

目的探讨缺氧对正常心肌细胞和肥大心肌细胞缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响。方法将培养的乳鼠心肌细胞或诱导肥大后的心肌细胞分别缺氧24 h,并以Hoechst33258染色法检测缺氧对心肌细胞凋亡的影响,Western blot和免疫荧光法检测Cx43的表达。结果培养的心肌细胞经血管紧张素Ⅱ诱导48 h后出现肥大,肥大心肌细胞缺氧24 h比正常心肌细胞出现更明显的凋亡,缺氧明显下调心肌细胞Cx43的表达,而肥大心肌细胞Cx43的表达下调更为明显。结论缺氧导致肥大心肌细胞Cx43的表达显著下调,细胞凋亡更明显,可能与缺氧时肥大心肌的电生理重构和恶性心律失常的产生机制有关。