二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌方法的建立及初步应用

目的 利用二聚体蝎型荧光探针法,建立一种可广泛应用且敏感、特异的检测志贺菌的荧光定量PCR技术。方法 根据编码志贺菌ipaH基因的核苷酸序列设计引物和荧光探针,采用基因重组技术构建用于志贺菌检测的定量标准品,通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立了检测志贺菌的二聚体蝎型探针定量PCR方法。结果 成功构建了志贺菌重组质粒标准品和志贺菌实时荧光定量PCR方法;通过特异性、敏感性、稳定性和重复性验证,结果表明具有较好的特异性、敏感性、稳定性和重复性;对比分离培养标本,二者符合率为100％;对比TaqMan方法,本方法具有更敏感、省时、成本低的特点。结论 建立了一种以二聚体蝎型荧光探针技术为基础的志贺菌荧光定量PCR检测法,为研制新型的检测试剂盒奠定了基础,可应用于食品卫生监管以及传染病诊断等。     

TaqMan-MGB荧光定量PCR快速检测结核分枝杆菌katG基因突变

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测结核分枝杆菌katG基因突变的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。方法 根据结核分枝杆菌katG基因主要发生315位点突变的特点,设计一对特异性TaqMan-MGB探针和引物,通过反应条件优化,建立荧光定量PCR方法;用克隆到PMD18-T载体上katG基因阳性标准品及不同菌株来评价该方法的特异性、敏感性和重复性。结果 灵敏度高,检测目的基因的最低检测下限10copies/μl,比常规PCR灵敏高100倍;特异性高,检测16株非结核分枝杆菌标准株和7种常见呼吸道感染细菌的标准株均为阴性;与测序法相比,野生型和突变型探针的敏感性和特异性均为100%。重复性好,批内批间CT值变异系数均小于1%。结论：TaqMan-MGB荧光定量PCR的方法能特异、灵敏、快速检测结核杆菌菌株katG 315位点突变。     

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌TaqMan荧光PCR检测的建立

目的对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌分别建立荧光PCR快速检测方法。结核分枝杆菌荧光PCR对H37Rv标准菌株、结核分枝杆菌临床分离株的检测结果呈典型阳性反应，牛分枝杆菌荧光PCR对牛分枝杆菌标准菌株、BCG菌株的检测结果呈典型阳性反应，对其它分枝杆菌菌株以及常见微生物样品为阴性反应。两种荧光PCR对对应阳性重组质粒模板的检测灵敏度可达单个基因拷贝，对结核分枝杆菌或BCG标准菌株的检测灵敏度可达单个菌细胞。对临床样品的检测结果显示，荧光PCR对模拟感染奶样、血样的检测灵敏度可达单个菌细胞。所建立的方法，全过程包括血样、奶样、痰液等临床样品的前处理、核酸提取和荧光PCR检测，可在5～6h内完成。采用上述荧光PCR方法从临床采集的疑似病人痰液中检出多份结核分枝杆菌阳性样品。     

实时荧光定量PCR法分析结核分枝杆菌对异烟肼耐药的分析

目的利用实时荧光定量PCR技术快速检测异烟肼耐药结核分枝杆菌。方法收集到医院就诊的结核病疑似患者痰液样本,提取痰液样本的总DNA,利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术对结核分枝杆菌感染进行快速筛查,并与传统药敏试验进行比较,对两者的灵敏度、特异性、一致性进行比较分析。结果检测346例结核病人临床分离培养样本,药敏试验检出257例异烟肼敏感标本,101例异烟肼耐药标本;实时荧光定量PCR法共检测出异烟肼敏感和耐药标本225例98例,灵敏度为86.64%,特异性为93.92%,一致率为93.12%。结论跟传统药物敏感性实验相比,实时荧光定量PCR法检测速度快速、特异性强、灵敏度较高,可用于结核分枝杆菌耐异烟肼突变的快速检测,适于耐多药结核病的快速筛查。     

利用荧光定量RT-PCR和PCR方法检测结核分枝杆菌复合群

目的建立一种新的检测结核分枝杆菌复合群的荧光定量试验方法(R/P分析),探讨R/P分析检测临床标本中结核分枝杆菌复合群的应用价值。方法根据结核分枝杆菌复合群基因保守序列设计引物和探针构建质粒标准品。运用R/P分析检测54例确诊结核病人临床样本,检测的结果同时与培养法、荧光定量PCR法进行比较。结果不同临床标本用R/P分析诊断结核病,其敏感性高于荧光定量PCR法和培养法,阳性检出率分别为96.3%、83.3%和55.6%。结论 R/P方法是一种快速、特异的直接检测方法,它可以区分结核分枝杆菌复合群的死菌与活菌,因此可以更好的指导医生进行治疗,更准确地做出公共卫生决策。     

应用DNA探针直接检测结核分枝杆菌DNA

由于ＤＮＡ探针杂交反应特异性高 ,国内外研究者已采用ＤＮＡ探针杂交技术检测结核分枝杆菌。但该检测方法敏感性较低 ,通常采用与聚合酶链反应 (ＰＣＲ)扩增相结合的方法。但这样增加了实验的费用和交叉污染的机会。我们在对ＤＮＡ探针与ＰＣＲ结合检测临床标本进行系统研究的基础上 ,发现临床标本简化法处理 ,即ＤＮＡ探针化学发光检测 ,ＤＮＡ损失较少 ,还可提高检测的敏感性 ,现将结果报道如下。材料与方法一、菌种来源受试分枝杆菌标准株来自中国药品生物制品检定所。二、标本收集结核患者痰标本 2 31份 ,血液标本 85份 ,脑脊液、胸、…     

巢式实时荧光定量聚合酶链反应检测结核分枝杆菌DNA的临床应用

目的探讨巢式实时荧光定量PCR（QNRT-PCR）检测结核分枝杆菌（MTB）DNA的临床价值。方法应用SYBR Green I建立检测结核分枝杆菌MTP64基因的QNRT—PCR方法,分别检测24份肺结核患者痰液,27份结核性胸膜炎患者胸水,以及对照组75份痰液和胸水的MTBDNA含量。结果以培养为金标准,QNRT—PCR敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）分别为95．83％、61．54％、69．70％和94．12％,结核性胸膜炎的阳性率为70．37％。三种PCR方法阳性率比较,差异具有统计学意义（P〈0．05）,QNRT—PCR与实时荧光定量PCR拷贝数配对检验差异没有统计学意义（P〉0．05）,QNRT—PCR与实时荧光定量PCR的Cr值配对检验差异具有统计学意义（P〈0．01）。结论QNRT—PCR方法可检测痰液和胸水MTB DNA,对含微量MTB DNA样本的高敏感性在结核病的早期诊断中有重要参考价值。     

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌TaqMan(R)荧光PCR检测的建立

目的 对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌分别建立荧光PCR快速检测方法 .结核分枝杆菌荧光PCR对H37Rv标准菌株、结核分枝杆菌临床分离株的检测结果 呈典型阳性反应,牛分枝杆菌荧光PCR对牛分枝杆菌标准菌株、BCG菌株的检测结果 呈典型阳性反应,对其它分枝杆菌菌株以及常见微生物样品为阴性反应.两种荧光PCR对对应阳性重组质粒模板的检测灵敏度可达单个基因拷贝,对结核分枝杆菌或BCG标准菌株的检测灵敏度可达单个菌细胞.对临床样品的检测结果 显示,荧光PCR对模拟感染奶样、血样的检测灵敏度可达单个菌细胞.所建立的方法 ,全过程包括血样、奶样、痰液等临床样品的前处理、核酸提取和荧光PCR检测,可在5～6h内完成.采用上述荧光PCR方法 从临床采集的疑似病人痰液中检出多份结核分枝杆菌阳性样品.     

荧光定量聚合酶链反应技术检测结节病肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA

目的探讨结核分枝杆菌感染在结节病发病中的作用;方法荧光定量聚合酶链反应技术检测22例结节病肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA;结果22例肺泡灌洗液中9例检出结核分枝杆菌;结论结核分枝杆菌感染可能是结节病病因之一。     

PCR-荧光探针法检测临床痰标本结核分枝杆菌的可靠性研究

目的 评价PCR-荧光探针法快速检测Mtb和非结核分枝杆菌（NTM）的临床应用价值。方法 应用分枝杆菌核酸检测试剂对1015 例痰标本和56株临床分离株进行检测,与Mtb核酸扩增（PCR）荧光（目前临床上认可惟一同类产品）检测结果进行比较。采用SPSS 11.5统计软件进行数据统计处理,采用χ²检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。结果 PCR-荧光探针法检测痰标本分枝杆菌灵敏度50.3%（373/741）,特异度98.9%（271/274）;菌阳肺结核标本检测灵敏度97.0%（257/265）,菌阴肺结核标本检测灵敏度24.4%（116/476）;1015份痰标本中检测出11例非结核分枝杆菌（NTM）核酸阳性标本（占1.1%）,经16S rDNA 测序确认,准确率100.0%。随机数字量表法抽取138例标本重复进行第2次检测,符合率100.0%。对56株临床分离株（1株Mtb临床分离株,55株NTM临床分离株）检测,准确率100.0%。对临床需要的226份标本同时与达安公司试剂盒检测结果比较,总体符合率95.1%（215/226）,经统计学分析,两者之间差异无统计学意义（χ²=2.98,P=0.226）。结论 PCR-荧光探针法可快速检测和区分痰标本Mtb与NTM,具有临床推广应用价值。     

用DNA 芯片快速检测结核分支杆菌对利福平的耐药性

目的：研制一种新型DNA芯片,用于结核分支杆菌对利福平的耐药性快速检测,方法：根据结核分支杆菌rpoB基因的序列信息设计探针并制作DNA芯片,PCR扩增并荧光标记包含结核分支杆菌rpoB基因突变热点的目的片段,与芯片杂交,同时以DNA测序法为对照,结果：17株随机抽取的耐利福平结核分支杆菌菌株有14株可用DNA芯片检测出来,效率可达83％,患者痰液中少量的DNA足够进行芯片检测,无须进行培养。结论：用DNA芯片来检测结核分支杆菌对利福平的耐药性具有较高的特异性和灵敏度,该法快速,精确,可以应用于临床耐药性检测。     

石蜡包埋组织实时荧光定量聚合酶链反应检测在结核病诊断中的价值

目的探讨石蜡包埋组织实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测结核分枝杆菌DNA在结核病诊断中的价值。方法275例组织标本行常规组织病理学检查、抗酸染色,并对石蜡包埋组织应用实时荧光定量聚合酶链反应检测结核分枝杆菌DNA。结果275例FQ-PCR检测结核分枝杆菌DNA阳性211例(76.7%),病理诊断为结核183例(66.5%),抗酸染色阳性23例(8.4%)。病理诊断为结核者FQ-PCR阳性率为93.4%,抗酸染色阳性者FQ-PCR阳性率95.7%。结论实时荧光聚合酶链反应技术敏感性高、其与组织病理学相结合可以提高诊断率。     

PCR－SSCP技术快速检测结核分枝杆菌 rpoB基因突变的研究

目的 应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌H37Rv为对照、50例耐RFP(单耐和多耐)结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本,采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变。结果 50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%。结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法。     

应用噬菌体裂解法快速鉴定结核分支杆菌

目的 研究噬菌体裂解试验对结核分支杆菌快速鉴定的意义。方法 应用结核分支杆菌噬菌斑技术快速检测结核分支杆菌、非结核分支杆菌和非分支杆菌及肺结核患者痰标本。结果 结核分支杆菌H37Rv、牛分支杆菌和非洲分支杆菌噬菌体裂解试验均为阳性,10株常见非结核分支杆菌和7株非分支杆菌均为阴性;30株结核分支杆菌临床分离株本法检测结果全部阳性;20份涂阳培阳肺结核患者痰标本,本法阳性19份（95％）;21份涂阴培阳痰标本,本法阳性15份（71％）;19份涂阴培阴痰标本,5份阳性（26％）。结论 噬菌体裂解试验可以快速鉴定结核分支杆菌,用其检测痰标本中的结核分支杆菌具有很高的特异性和较高的敏感性。     

荧光定量PCR技术快速检测rpoB基因突变及其临床应用

目的探讨荧光定量PCR技术检测基因突变的价值及其临床应用。方法针对结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区(Rifampicin Resistance Determining Region,RRDR)526密码子和531密码子常见的突变形式设计探针(526CAC,526TAC,531TCG和531TTG),应用已知rpoB基因RRDR区序列的38株利福平耐药临床分离株和24株利福平敏感临床分离株以及5株非结核分枝杆菌菌株建立荧光定量PCR检测基因突变的方法。继而,应用该技术检测84份肺结核病例痰标本,与痰罗氏培养以及药敏结果进行比较,部分标本进行DNA测序证实。结果在38株利福平耐药、24株利福平敏感的临床分离株和5株非结核分枝杆菌中,其检测526密码子和531密码子突变的敏感性和特异性达100%。在84份肺结核病例的痰标本中,罗氏培养阳性62株,其中利福平耐药株48份,荧光定量PCR检测痰标本结核分枝杆菌DNA阳性为75例。荧光定量PCR检测到531密码子TTG突变65例,526密码子TAC突变7例。在48株利福平耐药株中,荧光定量PCR检测43株为531TTG突变,3株为526TAC突变,另2株利福平耐药株,经测序证实,1株514密码子TTC插入突变,1株为511密码子CCG和516密码子GGC联合突变。结论荧光定量PCR技术能快速检测rpoB基因突变,并能作为临床肺结核病人早期快速耐药诊断的辅助手段。     

荧光定量PCR技术快速检测rpoB基因突变及其临床应用

目的探讨荧光定量PCR技术检测基因突变的价值及其临床应用。方法针对结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区（Rifampicin Resistance Determining Region，RRDR）526密码子和531密码子常见的突变形式设计探针（526CAC，526TAC，531TCG和531TTG），应用已知rpoB基因RRDR区序列的38株利福平耐药临床分离株和24株利福平敏感临床分离株以及5株非结核分枝杆菌菌株建立荧光定量PCR检测基因突变的方法。继而，应用该技术检测84份肺结核病例痰标本，与痰罗氏培养以及药敏结果进行比较，部分标本进行DNA测序证实。结果在38株利福平耐药、24株利福平敏感的临床分离株和5株非结核分枝杆菌中，其检测526密码子和531密码子突变的敏感性和特异性达100％。在84份肺结核病例的痰标本中，罗氏培养阳性62株，其中利福平耐药株48份，荧光定量PCR检测痰标本结核分枝杆菌DNA阳性为75例。荧光定量PCR检测到531密码子TTG突变65例，526密码子TAC突变7例。在48株利福平耐药株中，荧光定量PCR检测43株为531TTG突变，3株为526TAC突变，另2株利福平耐药株，经测序证实，1株514密码子TTC插入突变，1株为511密码子CCG和516密码子GGC联合突变。结论荧光定量PCR技术能快速检测rpoB基因突变，并能作为临床肺结核病人早期快速耐药诊断的辅助手段。