LuxS基因缺失对变形链球菌蛋白表达的影响

目的通过双向电泳技术对比研究变形链球菌标准株与LuxS突变株菌体总蛋白质的表达差异,为进一步研究LuxS信号系统对变形链球菌致龋毒力的调控机制奠定基础。方法提取变形链球菌标准株及LuxS突变株的菌体总蛋白质,采用双向电泳技术对比研究两者蛋白质的表达差异,找出差异蛋白点。结果与标准株菌体总蛋白2-DE图谱相比较,LuxS突变株菌体总蛋白2-DE图谱中有61个斑点的蛋白质表达量发生了改变:36个点蛋白质表达量升高,25个点蛋白质表达量降低。结论变形链球菌标准株与LuxS突变株菌体总蛋白存在明显的差异,表现为2-DE图谱蛋白斑点染色的深浅不同,提示LuxS突变株菌体总蛋白发生了量的变化。     

变形链球菌LuxS基因缺失株对生物膜结构影响的研究

目的研究变形链球菌标准株和LuxS基因缺失菌株变形链球菌在离体模型上生物膜形成的差异变化情况。方法收集临床上因正畸而拔除的前磨牙或无龋坏的第三磨牙,行菌株复苏增菌及变形链球菌鉴定,最后将标本置于扫描电镜下观察。结果变形链球菌标准菌株和LuxS基因缺失菌株在24 h形成的生物膜有明显差异,经观察发现LuxS基因缺失菌株较标准菌稀疏。结论口腔变形链球菌可通过LuxS基因介导的菌种密度感应信号来影响口腔生物膜的形成。     

B型链球菌数量感应通路测定及LuxS缺失突变株的构建

目的对GBS中可能存在的AI-2数量感应通路进行测定，构建数量感应相关分子LuxS缺失突变株并对其基因型进行确认。方法培养GBS至不同D（λ）值．利用V．harveyi BB170作为报告菌株，对GBS诱导生物发光的能力进行测定，然后寻找GBS中LuxS同源基岗，通过同源重组法在GBS中构建LuxS缺失突变株，Southern杂交分析确证。结果GBS中的某种分泌成份可在报告菌株中诱导生物发光活性，提示GBS中存在AI-2数量感应通路，在GBS中发现了LuxS同源基因并成功地构建了LuxS缺失突变株。结论本研究为探索LuxS在GBS中AI-2数量感应通路中的重要性及GBS毒力研究建立了细菌模型     

B型链球菌数量感应通路测定及LuxS缺失突变株的构建

目的 对GBS中可能存在的AI-2数量感应通路进行测定,构建数量感应相关分子LuxS缺失突变株并对其基因型进行确认。方法 培养GBS至不同D(λ)值,利用V.harveyi BB170作为报告菌株,对GBS诱导生物发光的能力进行测定,然后寻找GBS中LuxS同源基因,通过同源重组法在GBS中构建LuxS缺失突变株,Southern杂交分析确证。结果 GBS中的某种分泌成份可在报告菌株中诱导生物发光活性,提示GBS中存在AI-2数量感应通路,在GBS中发现了LuxS同源基因并成功地构建了LuxS缺失突变株。结论 本研究为探索LuxS在GBS中AI-2数量感应通路中的重要性及GBS毒力研究建立了细菌模型。     

银染法观察葡萄球菌生物被膜

[目的]探讨银染法观察葡萄球菌生物被膜方法的可靠性。[方法]建立细菌生物被膜,分别用银染法和扫描电镜进行观察。[结果]银染后普通光学显微镜观察和扫描电镜观察生物被膜的结果完全相符。[结论]用银染法观察细菌生物被膜的变化方便、可靠。     

变异链球菌CRISPR-Cas9系统csn2基因突变株的转录组学分析

  目的  对变异链球菌CRISPR-Cas9系统csn2基因突变株的转录组基因表达差异进行分析。  方法  培养变异链球菌UA159、csn2基因的缺失菌株Δcsn2及回补菌株。提取总RNA,采用高通量测序技术,进行转录组测序,基于差异表达基因GO和KEGG数据库分析的基础上,对其参与的生物学过程进行挖掘,采用qRT-PCR的方法验证转录组测序结果。  结果  转录组结果显示与UA159相比,Δcsn2中基因表达量变化在1倍以上的基因有176个（P<0.05）,其中上调表达基因72个,下调表达基因104个,通过GO功能富集分析及KEGG代谢通路富集分析,发现上调和下调的差异表达基因（DEG）均参与的功能为氨基酸转运和代谢。除此之外,上调的DEG参与的生物过程主要与碳水化合物代谢、能量产生和转化、转录等有关;下调的DEG主要与脂质代谢、DNA的复制、重组和修复、信号转导机制、核苷酸转运和代谢等生物过程有关,还有部分DEG的功能尚不清楚。qRT-PCR验证发现,与UA159及Δcsn2/pDL278-csn2 菌株相比,与支链氨基酸形成相关的基因leuA、leuC和leuD在Δcsn2中的表达显著下调。  结论  通过转录组测序和qRT-PCR验证发现Δcsn2中与支链氨基酸合成与细胞膜通透性相关的基因表达量发生了明显变化。     

激光共聚焦扫描显微镜观察变异链球菌高致龋力临床株与标准株合成胞外多糖能力差异

目的了解变异链球菌(简称变链菌)593号高致龋力临床分离株在生物膜状态不同时期与标准株ATCC25175(均为血清型c)合成胞外多糖的能力差异。方法在聚苯乙烯塑料片上分别形成3、12、20 h变链菌生物膜标本,采用异硫氰酸荧光素标记的伴刀豆球蛋白A对合成的胞外多糖进行染色,用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察。采用静置法培养形成黏附生长的细菌,蒽酮法测定3～24 h其合成胞外多糖的量。结果胞外多糖与染料结合后发出绿色荧光,各时间段593号临床株绿色荧光的分布较ATCC 25175标准株更致密和广泛。3～20 h 593号临床株合成水溶性葡聚糖能力强于标准株(P<0.05);3～16 h 593号临床株合成水不溶性葡聚糖能力强于标准株(P<0.05);其他时间两者合成胞外多糖的能力差异无统计学意义(P>0.05)。结论在生物膜形成过程中两菌株合成胞外多糖的模式相同,均随时间延长而合成量增加,但在生物膜形成早期(3～16 h)高致龋力临床株表现出不同于标准株的胞外多糖合成模式,其更强的合成胞外多糖能力可能是其具高致龋力的原因之一,提示研究致龋机制时使用临床株作为研究样本较标准株更为敏感。     

乙型肝炎病毒外膜基因插入变异株及野株的全序列测定和系…

用核酸序列分析技术，测定１例乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）阴性中国人感染的乙型肝炎病毒ＨＢＶ／ａｄｗ亚型全基因充列。该变异株一列为３２２４个碱基戌从同一地区２例ＨＢｓＡｇ阳生携带者得到的ａｄｗ和ａｄｒ全序同源性分别为９８．０％和９２．５％，与已出版的Ａ－Ｅ基因组比较，进行了病毒的系统树分析，该变异毒株除在外膜基因Ａ决定族胶有９个碱基插入外，在多种调控元件，包括自动因子ＳＰＬＳＰＩＬＣＰ、ＸＰ、增强     

无乳链球菌对奥马环素的敏感性研究

目的 研究无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,GBS)对奥马环素(omadacycline,OMC)的药敏特点及其与生物被膜形成能力、耐药基因、毒力基因之间的关系。方法 收集深圳市南山区人民医院2015—2020年无乳链球菌临床分离株共136株,用微量肉汤稀释法测定这些菌株对OMC的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),用结晶紫染色法检测无乳链球菌的生物膜,采用聚合酶链反应(PCR)方法检测耐药基因(tet M、tet O、tet K、erm B、Optr A)和毒力基因(cpsⅢ、bca、fbs A、cps A、scp B)。结果 136株临床分离的无乳链球菌中,对OMC耐药的有20株(14.7%),中介有64株(47.1%),敏感有52株(38.2%);生物被膜阳性菌株有57株(41.9%),对OMC敏感的有20株(35.1%),生物被膜阴性菌株有79株(58.1%),对OMC敏感的有32株(40.5%),两组菌株敏感率之间差异有统计学意义(χ²=63.062,P<0.0...     

生物膜状态下变异链球菌生物学行为研究

龋病是细菌性疾病,变异链球菌是公认的主要致龋菌。现代龋病学研究认为,浮游变异链球难以在口腔中生存,只有形成牙菌斑生物膜才可能生存并致龋。大量研究表明,生物膜细菌与浮游细菌在生长代谢、致病性、对药物的敏感性以及对抗宿主防御系统等方面存在显著差异。本文就生物膜状态下变链菌的生物学行为予以综述。     

寡发酵链球菌在大鼠口腔内定植状态的观察

目的：对寡发酵链球菌在大鼠口腔内高糖环境下的定植能力进行初步探索。方法：21天龄SPF-SD大鼠48只,24~27天喂以氨苄青霉素水溶液（内源性细菌抑制）,28天时将大鼠分为4组,每组12只,高糖持续饲喂,28~30天连续3天接种菌液,组1（SM组）接种变形链球菌菌液,组2（SO组）接种寡发酵链球菌菌液,组3（SO+SM混合接种组）接种变形链球菌和寡发酵链球菌混合菌液,组4为阴性对照组,不接种任何菌液。细菌接种次日和第10天,用无菌棉签擦取大鼠双侧下颌磨牙（6颗）牙合面、颊、舌面的菌斑,PBS系列稀释,SM组接种于MSB平皿和BHIS血平皿,SO组接种于MSAE平皿,SO+SM混合接种组接种于MSB平皿、MSAE平皿和BHIS血平皿,阴性对照组接种于MSB平皿和MSAE平皿。从MSB平皿筛选、计数变形链球菌,从MSAE平皿筛选寡发酵链球菌疑似菌落并16S rDNA测序鉴定寡发酵链球菌。结果：SO组接种寡发酵链球菌次日,寡发酵链球菌检出率为33.3% (4/12);SO+SM混合接种组接种次日寡发酵链球菌检出率为0,而变形链球菌检出率为100.00%,变形链球菌占总菌的比例为14.70%±4.53%;SM组在接种次日的变形链球菌检出率也为100.00%,其占总菌的比例为12.42%±4.27%,与SO+SM混合接种组相比差异无统计学意义。SO组接种寡发酵链球菌第10天,寡发酵链球菌检出率为0;SO+SM混合接种组接种第10天,寡发酵链球菌检出率亦为0,而变形链球菌检出率为100.00%,变形链球菌占总菌的比例为15.78%±5.10%;SM组在接种第10天的变形链球菌检出率也为100%,其占总菌的比例为17.08%±5.75%,与SO+SM混合接种组相比差异无统计学意义。结论：本实验条件下,在大鼠口腔内高糖环境下,寡发酵链球菌在大鼠口腔内呈一过性显现,不能定植。     

人参皂苷Rh2型联合氟化钠对变异链球菌生长及生物膜形成的抑制作用

探讨人参皂苷Rh2型（G-Rh2）联合氟化钠（NaF）对体外变异链球菌生长及生物膜形成的抑制作用,为其将来在口腔临床上的应用提供理论依据。     

变形链球菌生物膜对红霉素敏感性的实验研究

目的:观察变形链球菌生物膜对红霉素敏感性。方法:体外形成变形链球菌生物膜，用不同浓度红霉素分别作用生物膜1h和3h。生物膜进行荧光染色，激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察。结果：变形链球菌生物膜在红霉素浓度为5000μg／mL作用1h以及浓度为1000μg／mL作用3h时，未被完全杀死。结论：变形链球菌生物膜比浮游状态变形链球菌对红霉素具有更高的抵抗力，但随着药物作用时间延长，生物膜对红霉素的抵抗力逐渐减弱。     

变异链球菌sepM基因中存在与变链素IV形成相关的突变类型

目的 了解sepM基因在变异链球菌临床株中的突变类型及其分布特征;探索sepM基因突变与变异链球菌变链素IV形成能力的关系。方法 采用抑菌圈法检测80株变异链球菌临床株的变链素IV形成能力,根据核心基因组多位点序列分型方法构建这80株变异链球菌临床株的最小生成树,根据最大似然法构建这80个样本的进化树。采用GeneMarkS 软件预测这些菌株的编码基因,并将预测到的基因与参考基因组UA159的sepM基因序列进行比对,了解sepM基因在变异链球菌临床株中的突变类型及其分布特征。通过分析变链素IV形成组和无变链素IV形成组菌株中差异分布的突变类型及比较突变组和无突变组菌株中抑菌圈的大小,明确与变链素IV形成相关的突变类型。结果 80株变异链球菌临床株中有变链素IV形成（变链素IV形成组）和无变链素IV形成（无变链素IV形成组）的菌株各25和55株。最小生成树结果提示变链素IV形成组菌株之间的等位基因差异少于变链素IV形成组和无变链素形成组组间菌株,并且变链素IV形成组菌株间起源类似。80株变异链球菌临床株中共检测到34个单碱基突变位点,其中有4个碱基突变（C31T、G533A、C756T、C1036T）在组间存在差异（P分别为0.001、<0.001、 0.025及0.003）。这些差异分布的突变均与变链素IV的形成呈正相关。 结论 变异链球菌临床株sepM基因中存在与变链素IV形成相关的突变类型。     

复方中药漱口剂对变形链球菌致龋的实验研究

目的探索复方中药的防龋效果,为研制新型中药漱口剂奠定基础.方法用平皿扩散法和试管稀释法观察3种不同中药复方漱口剂对c型变形链球菌(以下简称变链菌)的生长、产酸和粘附的影响.从中筛选出作用最强的方剂,并进一步观察其对变链菌葡糖基转移酶(GTF)活性的影响.结果以厚朴、黄芩等为主的漱口剂在平皿扩散法中对变链菌的抑菌圈直径最大(最小杀菌浓度为4mg/ml),pH(6.8±0.25)下降最小,与其它两组方漱口剂差别有显著性意义(均P＜0.01).该方对CTF活性有明显的抑制作用,其作用强度与漱口剂浓度呈正相关.结论以清热解毒、芳香化湿为主的复方中药漱口剂有望在龋病防治方面发挥良好作用.     

重组变形链球菌V+蛋白的表达和纯化

目的：探讨变形链球菌表面蛋白可变区（V＋）基因在大肠杆菌中高效诱导表达及其表达产物的进一步纯化。方法：将V＋基因以C端融合6个组氨酸的形式在E.coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达。His6融合表达产物经金属离子（Ni^2 )融体亲和层析分离纯化，SDS－PAGE电泳和Western blot印迹分析表达产物。结果：SDS－PAGE分析确定有与His6融合表达产物（His6-rV )理论相对分子质量一致的诱导表达条带，其表达量占全菌蛋白的20％左右，表达产物以可溶形式存在。进一步纯化目的蛋白，纯度可达90％。Western blot实验表明表达产物具有良好的抗原性。结论：His6融合表达载体可以高效地表达和纯化重组V＋蛋白。     

不可分型流感嗜血杆菌生物膜体外形成规律及其扫描电镜形态学

目的:探讨不可分型流感嗜血杆菌（NTHi）生物膜（BF）体外形成规律,采用扫描电子显微镜（SEM）观察BF内部结构。方法:以NTHi标准菌株ATCC49247为研究菌株,以铜绿假单胞菌（PA）标准菌株PAO1为阳性对照菌株,同时设空白对照组,分别培养1、2、3、4、5、6和7 d时,使用平板计数法和结晶紫染色法检测BF形成情况,并于3 d时采用SEM检测ATCC49247的 BF结构。结果:平板计数法检测BF内菌落数,ATCC49247和PAO1培养3 d时活菌数逐渐上升至最高,而后逐渐下降,至7　d时分别降至（0.829 4±0.007 5）×10⁷cfu•mL^-1和（0.942 6±0.019 9）×10⁷cfu•mL^-1,培养3、4、5和6　d时2组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）,同种细菌各不同时间点间比较差异有统计学意义（P<0.05）。结晶紫染色检测BF致密程度,ATCC49247和PAO1培养3 d时 BF致密度逐渐上升至最高,波长570 nm吸光度（A570）值分别为2.717　4±0.017　2和2.885　3±0.039　0,而后逐渐下降,至7　d时分别降至0.151 7±0.074 5和1.196 9±1.108 5,各时间点2组细菌与空白组比较差异均有统计学意义（P<0.05）,培养3、4和5 d时2组细菌间比较差异均有统计学意义（P<0.05）,同种细菌不同时间点比较差异有统计学意义（P<0.05）。SEM观察,培养3 d时ATCC49247形成了典型的BF结构。结论:ATCC49247可以在体外形成BF,结晶紫染色、平板计数和扫描电镜可作为检测BF的常规手段。