蛋白质组分析中双向聚丙烯酰胺电泳技术的初步建立与优化

目的：初步建立并优化用于蛋白质组分析的双向电泳技术，提高其分辨率及重复性。方法：以ＨｅｐＧ２细胞为例，对以固相ｐＨ梯度为第一向的双向电泳的关键因素与环节，如样品处理、电泳参数和凝胶浓度进行一系列的优化。结果与结论：本研究采用增溶、排异的裂解法处理样品，选择适中的样品量，用预制固相ｐＨ梯度——ＩＰＧ胶条（ｐＨ＝３～１０）第进行第一向等电聚焦，并选用１２％～１４％的梯度胶进行第二向ＳＤＳ分离，可获得质量较好的双向电泳图谱     

蜡样芽孢杆菌总蛋白双向电泳方法的建立和优化

目的探索建立有效的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)蛋白质组双向电泳体系,为进一步揭示其促进氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)产酸的作用机制奠定基础。方法以培养的B.cereus为材料,比较蛋白质制备超声破壁时间、新型细胞裂解液、pH梯度和不同上样量对B.cereus蛋白双向电泳结果的影响。结果与结论采用15 min超声破壁提取B.cereus总蛋白,选用新型蛋白质裂解,用长24 cm、pH 4～7的IPG胶条,采用80μg上样量进行等电聚焦,于60 V 15 min、120 V 6 h条件下进行SDS-PAGE垂直电泳,可以获得背景清晰、重复性好的双向电泳图谱,建立一套用于B.cereus蛋白质组分析的双向电泳方法。     

两种原发大肠肿瘤细胞株蛋白质表达谱差异初步分析

目的应用双向电泳技术分析大肠侧向发育型肿瘤(LST)细胞株和结肠肿瘤SW480细胞株间的蛋白质表达谱差异。方法以双向电泳技术分离两种细胞株总蛋白质,银染显色,进行差异蛋白质分析。结果LST和SW480细胞株双向电泳图谱蛋白质点数分别为1285±51和1184±47,共获得96±7的蛋白质差异点,其中50±6个点仅在LST细胞株中表达或表达明显增强,47±5个点仅在SW480细胞中表达或表达明显增强。结论大肠LST细胞株与SW480细胞株的蛋白质表达谱存在一定的差异,对这些蛋白质点进行鉴定将为研究大肠LST特殊性生物学行为提供一定的线索。     

小鼠小肠上皮细胞经γ射线照射后蛋白质组差异分析

目的　分析γ射线照射后 ,在辐射损伤期和修复期小鼠肠上皮细胞蛋白质组的改变 ,以探讨肠上皮细胞损伤与修复的分子机理。方法　采用 9Gy全身照射BALB c小鼠 ,分别于照射后3h和 72h取小肠制备卷肠切片 ,染色并观察小肠形态。分离未照射小鼠及照射后 3h和 72h小鼠的肠上皮细胞 ,制备蛋白样品 ,采用双向电泳技术分离样品 ,PDQuest软件处理双向电泳图谱 ;并对差异的蛋白质点进行肽质量指纹分析。结果　小鼠肠上皮在照射后 3h以损伤性改变为主 ,72h后出现明显再生修复。采用双向电泳技术在正常对照组、照射后 3h组以及照射后 72h组分别检测到(6 38± 39)、(5 6 6± 32 )和 (5 91± 2 9)个蛋白质点。对其中 2 8个差异蛋白质点进行了肽质量指纹分析 ,经数据库检索 ,初步鉴定为一些与代谢、过氧化应急、信号转导相关的蛋白质。结论　电离辐射能诱导小鼠肠上皮细胞蛋白表达的改变 ,双向电泳技术对从整体方面揭示辐射损伤的分子机理有重要价值。     

细菌蛋白质组双向电泳中"串联珠"现象初探

目的 初步探讨细菌样品双向电泳中"串联珠"状蛋白点产生的原因.方法 通过对比不同样品制备方法对双向电泳胶图的影响,分析"串联珠"状蛋白点出现的条件,并取"串联珠"状蛋白点进行胶内酶解及MALDI-TOF/TOF分析,寻找"串联珠"状蛋白点可能产生的原因.结果 以含0.5% SDS的裂解液煮沸菌体的方法制备样品,就会产生"串联珠"状蛋白点.蛋白鉴定结果显示"串联珠"状蛋白点为同一蛋白,MALDI-TOF/TOF一级质谱峰没有出现明显的偏移峰.结论 "串联珠"产生的原因是由于SDS在加热条件下会对蛋白产生修饰或紧密结合作用,特别是相对分子质量较大的酸性蛋白.     

农业系统理论在牧区生态建设中的应用--农业系统理论在新疆阿勒泰市农业科技综合示范区建设中的应用

以阿勒泰市为例，应用农业系统研究方法，分析了农业生态系统结构及存在的问题，提出了系统结构优化措施，并对优化效果进行了生态、经济和社会效益的全面分析，为进一步优化系统结构，提高牧区生态系统综合生产力，改善生态环境，确保草地畜牧业可持续发展和以牧为主，农牧结合，农林牧渔协调发展提供依据。     

电离辐射诱导PC12细胞分化的蛋白质组学分析

目的探索辐射诱导PC12细胞分化的分子机理，筛选神经系统辐射损伤的分子靶标。方法16Gyγ射线照射PC12细胞，照射48h，提取正常与照射后细胞总蛋白，进行双向电泳分析，并对部分差异表达蛋白质进行质谱鉴定。结果电泳中共发现差异表达蛋白质位点876个。鉴定出表达水平增高的蛋白泛素羧端水解酶L1，表达水平降低的蛋白HP1α类似蛋白。结论应用蛋白质组技术鉴定出部分辐射后差异表达蛋白质，为辐射诱导PC12细胞分化的分子机理研究提供了线索。     

肝移植前后人血清中蛋白质双向电泳图谱比较

目的 研究比较肝移植前后人血清蛋白质双向电泳图谱,探索人肝脏移植后免疫排斥和耐受反应的机制.方法 用Aurum Serum Protein Mini Kit对血清预处理,进行双向凝胶电泳（2-DE）分离.Image Master 2D Platinum分析凝胶图谱.结果 建立了移植前和移植后24 h、10 d、30 d的人血清双向电泳图谱.与移植前相比,共筛选出明显表达差异的蛋白质斑点15个,其中在移植后蛋白斑点表达上调的14个,表达下调的1个.结论 初步建立了肝移植后的人血清蛋白质组学分析方法,差异表达蛋白质点的发现为深入研究肝移植术后免疫耐受和免疫排斥的机制提供了线索.     

弗氏志贺菌ΔlysA突变株的构建及SILAC技术的应用尝试

目的构建弗氏2a志贺菌301株赖氨酸营养缺陷型突变株,为将细胞培养条件下稳定同位素标记(SILAC)技术应用于志贺菌蛋白质组学研究奠定基础。方法采用λ-Red重组系统对弗氏2a志贺菌301株lysA基因进行缺失,对野生株和突变株进行基本的表型测评和毒力评价,并利用双向电泳技术比较二者在全菌蛋白表达谱上的差异,最后将突变株分别在含有12C6-赖氨酸和13C6-赖氨酸的培养基中培养,根据双向电泳胶图取对应蛋白点进行胶内酶切及MALDI-TOF/TOF分析。结果成功构建了301 lysA基因缺失突变株,蛋白鉴定结果显示所取对应蛋白点为同一蛋白,在质谱图上轻重同位素峰位移为6 amu。结论本研究所构建的赖氨酸营养缺陷型突变株适合进行SILAC分析。     

弗氏志贺菌2a GadB蛋白的功能研究

目的探究gadB基因的潜在功能及其对弗氏志贺菌2a 301株致病能力的影响。方法利用λ-Red重组系统构建弗氏志贺菌2a 301株的gadB缺失突变株,随后进行基本的表型实验测评,并初步评价其毒力,最后制备突变株和野生株全菌蛋白样品,利用双向电泳技术比较二者在蛋白表达谱上的差异。结果成功获得gadB基因缺失株;生化实验发现缺失株不能利用甘油发酵;而豚鼠角膜实验发现突变株炎症反应稍轻于野生株;全菌蛋白表达谱中发现10个差异蛋白。结论利用双向电泳鉴定到一些可能与GadB有关的蛋白,为gadB潜在功能的研究提供了线索。     

弗氏志贺菌ΔlysA突变株的构建及SILAC技术的应用尝试

目的构建弗氏2a志贺菌301株赖氨酸营养缺陷型突变株,为将细胞培养条件下稳定同位素标记（SILAC）技术应用于志贺菌蛋白质组学研究奠定基础。方法采用λ-Red重组系统对弗氏2a志贺菌301株lysA基因进行缺失,对野生株和突变株进行基本的表型测评和毒力评价,并利用双向电泳技术比较二者在全菌蛋白表达谱上的差异,最后将突变株分别在含有12C6-赖氨酸和13C6-赖氨酸的培养基中培养,根据双向电泳胶图取对应蛋白点进行胶内酶切及MALDI-TOF/TOF分析。结果成功构建了301 lysA基因缺失突变株,蛋白鉴定结果显示所取对应蛋白点为同一蛋白,在质谱图上轻重同位素峰位移为6 amu。结论本研究所构建的赖氨酸营养缺陷型突变株适合进行SILAC分析。     

临涧地区空气中气传致敏真菌的调查及真菌致敏性疾病的研究

根据牵引式行星锥环变速器的结构特点、传动原理及许用功率的计算方法，提出了以无级变速器恒功率机械特性为目标的优化数学模型，并对其基本几何参数进行系列优化设计，可明显改善无级变速器的恒功率机械特性。     

酮洛芬聚氰基丙烯酸正丁酯毫微粒制备工艺研究

目的：制备酮洛芬聚氰基丙烯酸正丁酯毫微粒（ KP-PBCA-NP）。方法：采用乳化聚合法制备空白PBCA—NP，以粒径为指标，应用L9（3^4）正交试验优化处方工艺；吸附法制备KP—PBCA—NP，以包封率、载药量为指标，应用U10（10^8）均匀法设计实验，进行条件优化。结果：制备PBCA—NP的优化条件为反应液pH2～3，Pluronic F68的含量为1．0％～1．5％，优化条件下制备PBCA—NP平均粒径为50nm；在制备KP-PBCA—NP时，当反应液的pH值为1，PBCA含量为0．5％，KP含量为0．8mg／ml时，可获得较高的包封率（平均为95．64％）和载药量（15．32％）。结论：控制工艺条件，可制备不同粒径的PBCA—NP作为各种药物载体，并且可以从此为载体制备可用于注射给药的KP—PBCA—NP。     

弗氏2a志贺菌CobB和GtrⅡ蛋白水平及毒力相关性的初步研究

目的研究翻译后修饰基因cobB和gtrⅡ对志贺菌致病能力的影响。方法采用λ-Red重组系统构建福氏2a志贺菌2457T的cobB,gtrⅡ缺失突变株,进行初步的毒力评价,随后制备野生株,cobB,gtrⅡ缺失突变株的全菌蛋白样品,并进行双向电泳比较野生株和缺失株在蛋白表达谱上的差异。结果成功构建cobB、gtrⅡ基因的缺失突变株,豚鼠角膜实验发现cobB、gtrⅡ缺失株症状稍弱于野生株,但在全菌蛋白表达谱中野生株和突变株并无明显差异。结论双向电泳难以有效地呈现CobB和GtrⅡ的翻译后修饰能力。     

改进的质谱兼容的胶内酶切方法

目的：改善胶内酶切的肽段回收率，提高蛋白质的有效鉴定率。方法：将改进的胶内酶切“四步提取法”，应用到96个双向电泳蛋白质斑点分析。结果：该方法提高了胶内蛋白质酶切肽段的回收率，改善了质谱图谱的质量。蛋白质的有效鉴定率达89．6％，其中，数据库检索得分80分以上者达82％。另外，证实了酶解原液直接用于质谱分析可获得较好信噪比的谱图。结论：应用“四步提取法”使得酶解肽段提取率和蛋白质的有效鉴定率明显提高。     

精制冠心颗粒制备工艺的研究

目的：优化精制冠心颗粒制备工艺。方法：通过对红花温浸加水量及其余药材提取加水量进行考察，以红花中的黄色素的吸收度以及芍药苷的含量为考核指标，优化提取工艺。结果：第一次加水12倍量，温浸2h，第二次加水10倍量，温浸1h温浸方法红花黄色素的吸收度最高最佳提取工艺为：第一次加水10倍量，第二次加水8倍量，第三次加水8倍量。此方法丹参的鉴别明显，芍药苷的含量高。结论：本优化工艺稳定，制剂质量可控。     

离心制粒工艺制备微晶纤维素空白微丸的研究

目的：考察微日纤维素（MCC）以离心制粒工艺制备微丸时的颗粒形成机理和影响因素，优化工艺参数。方法：采用不同批次间颗粒性质比较的方法，考察并确定影响离心制粒工艺的处方和工艺因素，通过均匀设计，优化MCC处方成丸的工艺参数。以优化条件制备微丸，与市售空白丸芯进行颗粒物理性质比较。结果：粘合剂用量、主机转速、粘合剂加入速度和滚圆时间对MCC处方的颗粒结聚影响较大。经多元线性回归，获得了这些因素与微丸收率、均匀度、微丸粒径间的定量关系，颗粒增长主要受物料含水量的制约，以优化工艺参数制备的微丸颗粒物理性质，与市售MCC空白丸芯相比无较大差异。结论：水性辅料以离心制粒工艺制备微丸切实可靠。     

志贺菌rfbA基因突变体的构建

目的构建弗氏2a志贺菌301 rfbA基因缺失突变株,初步探究志贺菌脂多糖合成与糖蛋白合成通路是否相关。方法首先用PCR扩增出rfbA基因上下游同源臂,构建含有kan基因的打靶片段,采用λ-Red重组系统对rfbA基因进行缺失,用PCR进行初步验证,然后通过LPS的银染方法进行进一步验证。随后,制备野生株、rfbA缺失突变株的全菌蛋白样品,进行双向电泳后比较野生株301和rfbA缺失株的蛋白表达谱。结果成功构建了301 rfbA缺失突变株。在LPS的银染实验中,rfbA突变株在凝胶中未形成一长串的梯状条带。在双向电泳实验中,野生株和突变株没有明显的蛋白差异点。结论获得了301 rfbA基因缺失突变体,初步认为志贺菌中不存在与脂多糖O-抗原合成相关的蛋白糖基化途径。     

细胞裂解物的O''''Farrell电泳

本实验室建立了O'Farrell 1975年提出的一种新型双向电泳(2-DE)技术,采用含脲与中性去污剂的等电聚焦技术(IEF)为第一向,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)为第二向.此技术将上述两种分离方法的特点结合起来,显著提高了对蛋白质多肽的电泳分辨率.O'Farrell电泳技术已成为现今所有蛋白质多肽分离分析技术中分辨率最高的一种,在基因表达、遗传变异、癌变过程的研究中应用日益广泛.     

O''''Farrell双向电泳的中间监测方法

O'Farrell 双向电泳是目前分辨力最高的蛋白、多肽分析技术之一,应用日益广泛。但该法环节多、周期长,尤以第一向导电聚焦电泳影响因素较多,易出现问题。由于缺乏有效的中间监测手段,在实际操作中多于第一向电泳结束后盲目进行第二向 SDS-PAGE 及银染显示,时常造成人力物力的浪费。