GDNF基因诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的实验研究

目的 观察在体外培养的经GDNF基因诱导的骨髓间充质干细胞（BMSCs）向神经细胞分化的表达.方法 体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,选取第3代细胞,应用GDNF基因诱导BMSCs分化两周,观察诱导后细胞的形态学变化,免疫荧光方法验证及鉴定神经元特异性烯醇化酶（NSE）及髓磷脂酸性蛋白2（MAP-2）的表达.结果 镜下观察细胞形态学以及特异性荧光可见BMSCs向神经细胞分化明显.结论 GDNF基因转染的BMSCs在体外培养情况下可转化为神经细胞,并表达特定神经细胞标志蛋白.     

骨髓间充质干细胞的研究进展与周围神经修复

骨髓间充质干细胞(MSCs）具有多向分化潜能，在特定的条件下可以分化为多种成体细胞。MSCs易于贴壁培养，具有相对特异的表型，在各种诱导因子的作用下可以呈现不同种系的分化。与周围神经的修复相结合，阐述了与周围神经相关的研究进展，并做了展望。     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞的分化特点

背景:黄芪提取物有较好的抗氧化、清除氧自由基的作用,加之骨髓间充质干细胞的多向分化潜能及其自体移植的优越性,可能为神经退行性疾病的治疗提供新的方式.目的:探讨黄芪诱导后大鼠骨髓间充质干细胞的分化特点.设计:细胞学体外观察.材料:清洁级6周龄雄性大鼠1只,购自中国医科院实验动物中心.黄芪注射液批号060105,为大理药业有限公司产品.方法:全骨髓法体外分离培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代时,按4×108L-1密度接种于置有盖玻片的12孔板内,制备细胞爬片.盖玻片上细胞达80%～90%融合后全量换液,加入含200 g/L黄芪注射液、体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基连续诱导6 d;对照组DMEM培养基中不加入黄芪注射液.主要观察指标:倒置显微镜观察诱导前后骨髓间充质干细胞的形态变化,诱导后免疫细胞化学染色鉴定特异性标志物的表达.结果:原代培养的骨髓间充质干细胞多呈圆形,扩增至第4代后细胞形态多呈梭形或成纤维细胞状,诱导后细胞形态发生改变,自胞体长出突起,随诱导时间延长,长出突起的细胞数量逐渐增多,部分突起末端呈分叉状,可见网络状连接.免疫细胞化学染色结果显示,诱导第3天巢蛋白阳性细胞、神经元特异性烯醇化酶阳性细胞和神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞较多,诱导第6天微管相关蛋白2阳性细胞较多.结论:黄芪首先诱导骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化,然后促进其向神经元或神经胶质细胞的非特异性分化,并能够使已分化细胞的进一步成熟、老化.     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导

背景：骨髓间充质干细胞作为良好的种子细胞,将其复合于生物支架治疗骨缺损取得了良好的进展,是当今研究的一大热点。目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向成骨样细胞分化的效果。方法：采用贴壁筛选法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分为2组,对照组细胞仅用DMEM/F12培养基培养;实验组以含成骨诱导剂的DMEM/F12培养基培养。结果与结论：全骨髓贴壁法培养的原代骨髓间充质干细胞呈梭形或多角形贴壁生长;经成骨诱导剂诱导后骨髓间充质干细胞呈圆形或卵圆形贴壁生长,碱性磷酸酶活性明显强于对照组（P〈0.01）;茜素红染色出现阳性的钙化结节;Western blotting检测Ⅰ型胶原蛋白表达较对照组有明显增加（P〈0.01）;骨钙素ELISA定量分析较对照组明显升高（P〈0.01）。提示全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞方法简单、实用,所培养的骨髓间充质干细胞在成骨诱导后表现了成骨细胞的形态学和生物学特性。     

肝衰竭大鼠血清诱导间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的 观察肝衰竭大鼠血清诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的作用,探讨大鼠骨髓间充质干细胞分离培养、体外扩增及其向肝细胞分化的体外培养条件和方法.方法 从股骨胫骨分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,体外扩增培养、鉴定,并采用肝衰竭大鼠血清血清诱导培养,分别在诱导培养0、7、14、24、28天时留取细胞,观察细胞形态的变化,并采用免疫细胞化学方法检测肝特异性标记物(AFP、Alb、CK-18)、用PAS进行糖原染色实验,以验证诱导分化结果.结果 诱导后5天间充质干细胞表现为肝细胞样,随着诱导培养时间的延长,肝特异性标记物逐渐出现和成熟.AFP在7天时高表达,培养14、21、28天表达逐渐减弱;白蛋白、CK-18和糖原随着诱导时间的延长,表达逐渐增强.结论 密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,是一种较为有效的分离纯化方法.肝衰竭大鼠血清者血清能诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞.     

急性肝衰竭大鼠血清诱导骨髓间充质干细胞表达甲胎蛋白和白蛋白

背景:研究发现肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4和表皮细胞生长因子等可诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化,关于肝衰竭大鼠血清对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用尚未见报道.目的:观察急性肝衰竭大鼠血清对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用.方法:采用密度梯度离心法从SD大乳鼠股骨、胫骨分离培养骨髓间充质干细胞,体外扩增培养.采用急性肝衰竭大鼠血清诱导培养骨髓间充质干细胞,以常规培养液诱导为对照,观察细胞形态的变化,诱导培养14 d采用免疫细胞化学方法检测甲胎蛋白、白蛋白的表达.结果与结论:急性肝衰竭大鼠血清诱导培养14 d, 可见骨髓间充质干细胞发生明显的形态学改变,镜下观察细胞变得稍大而扁平,呈类上皮样细胞,甲胎蛋白和白蛋白表达阳性率分别为(54.8±7.64)%和(45.9±9.68)%;对照组细胞未发生形态学改变,无甲胎蛋白和白蛋白的表达.证明了急性肝衰竭大鼠血清对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用,可诱导骨髓间充质干细胞表达甲胎蛋白和白蛋白.     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞的研究与进展

骨髓间充质干细胞既具有自我更新的能力,也具有在合适的微环境里向多系横向分化的潜能,在体外可以被诱导分化为肝细胞,理论上可提供丰富的肝细胞来源.随着骨髓间充质干细胞研究的兴起,利用干细胞及器官重建治疗肝脏疾病成为一种新的治疗模式,其中寻找合适的体外诱导培养体系是当前骨髓间充质干细胞研究的焦点之一.文章较全面的总结了骨髓间充质干细胞在多种微环境下向肝细胞诱导分化的特点,各种诱导条件的优势以及存在的问题.     

骨髓间充质干细胞诱导分化特征

骨髓间充质干细胞现阶段研究方向主要包括生物学特性、诱导分化和调控机制等内容，对其生物学特性和成骨成脂诱导方面研究比较成熟，在培养分化过程中展示出贴壁性、可塑性、异质性、自我更新能力、快速形成克隆能力、可移植性等生物学特征，贴壁法联合密度梯度离心法在骨髓间充质干细胞的分离、纯化过程中被广泛采用。而在神经诱导方面争议颇多，功能性神经元不仅要具有典型神经元的形态、特异性标记，还要求具有可兴奋性、能和其他神经元形成突触联系、产生突触电位等，所以对于骨髓间充质干细胞是否能诱导出真正具有功能的神经元存在很大分歧。此外，由于其调控机制还有很多未知因素，所以临床应用上仍存在许多安全性问题。     

骨髓间充质干细胞的研究

骨髓间充质干细胞(MSCs)是骨髓中的非造血细胞,构成造血微环境,支持造血,具有向成骨细胞、软骨细胞、成肌/心肌细胞、脂肪细胞、神经元等分化的潜能,表达多种表面标记物,但不具特异性.骨髓、外周血的MSCs是一循环的整体,具有其自身代谢、更新的循环,终末分化可能跨越胚层界限.MSCs应用前景广阔.     

经皮电神经刺激对周围神经再生的影响

目的　探讨经皮电神经刺激 (TENS)对周围神经再生的影响。方法　将 18只健康白兔按术后取材时间的不同随机分为A、B、C 3组 ,将各组白兔双侧腓总神经切断后与同侧外膜开窗的胫神经作端侧缝合。白兔左后肢为实验侧 ,术后给予TENS ,每天 1次 ,右后肢不给予电刺激 ,作为对照侧。 3组白兔分别于术后 3、6、16周取材 ,进行大体观察、神经组织学、透射电镜和电生理检查。结果　A、B、C组白兔实验侧腓总神经有髓纤维数 ,C组实验侧运动神经传导速度、肌肉复合电位波幅均高于相应各组对照侧 (P <0 .0 5 ) ,各组白兔实验侧腓总神经髓鞘成熟程度优于对照侧。结论　TENS具有促进周围神经再生 ,提高神经侧支萌出率的作用     

脉冲电磁场促进周围神经再生的实验研究

目的：探索脉冲电磁场对周围神经再生的影响及其作用机理。方法：用ＳＤ雄性大鼠２４只,在距梨状肌下缘约１ｃｍ处切断坐骨神经后原位吻合,随机分成１／２、１、２月３组,每组又分成对照和实验组,实验组用微电脑电磁脉冲发生器进行治疗,两组均在不同时间通过肉眼观察、肌电图检测及取材组织学检测。结果：实验组较对照组Ｗａｌｅｒｉａｎ变性明显、加速、血管增生明显、纤维组织增生轻、神经再生及传导速度加快。结论：脉冲电磁场治疗能促进周围神经再生     

毫米波促进周围神经损伤轴突再生的实验研究

目的探讨毫米波对周围神经损伤后轴突再生的影响。方法将48只SD雄性大白鼠制作成左侧坐骨神经部分损伤模型，随机分为治疗组和对照组。治疗组在神经损伤24h后，用毫米波辐射损伤部位，每周5次，每次30min，直至取材的前一天。组织学观察毫米波对大鼠坐骨神经部分损伤后轴突再生的影响。结果治疗组在术后2，4，6周有髓纤维横截面积均显著大于对照组。电镜观察，治疗组在术后4周和6周的神经再生数目和成熟度均优于对照组。结论毫米波能够促进周围神经损伤后轴突的再生。     

乙醇诱导大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡机制

背景：有研究表明乙醇可诱导骨髓间充质干细胞凋亡并引起成骨细胞和破骨细胞数量减少,但乙醇对骨髓间充质干细胞凋亡的影响以及作用机制目前尚不十分清楚。目的：观察乙醇对大鼠骨髓间充质干细胞凋亡、线粒体功能的影响及bcl-2、Caspase-3表达的变化。方法：应用全骨髓培养法分离培养SD大鼠骨髓间质干细胞,置于0,100,200,300,400,500,600,700,800,900mmol/L乙醇中作用24h,MTT法进行细胞毒性药物实验;置于0,100,200,300,400,500mmol/L乙醇中作用6,12,24h,AnnexinV/PI双标记法流式细胞仪检测细胞凋亡和线粒体膜电位变化情况;置于0,427mmol/L乙醇中作用24h,RT-PCR法检测与凋亡有关的基因bcl-2和Caspase-3mRNA表达水平。结果与结论：MTT检测结果显示427mmol/L是乙醇对大鼠骨髓间充质干细胞生长的半数抑制浓度;AnnexinV/PI检测结果表明,与0mmol/L组比较,随作用时间的延长与乙醇浓度的增加,骨髓间充质干细胞凋亡率及线粒体跨膜电位的破坏水平明显升高（P〈0.05）。与0mmol/L组比较,乙醇作用24h后427mmol/L组bcl-2mRNA表达水平下降,Caspase-3mRNA表达水平增加（P〈0.05）。说明乙醇能诱导大鼠骨髓间充质干细胞凋亡,凋亡的发生可能与线粒体膜电位破坏、线粒体功能障碍、bcl-2和Caspase-3激活有关。     

乙醇诱导大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡机制

背景:有研究表明乙醇可诱导骨髓间充质干细胞凋亡并引起成骨细胞和破骨细胞数量减少,但乙醇对骨髓间充质干细胞凋亡的影响以及作用机制目前尚不十分清楚。目的:观察乙醇对大鼠骨髓间充质干细胞凋亡、线粒体功能的影响及bcl-2、Caspase-3表达的变化。方法:应用全骨髓培养法分离培养SD大鼠骨髓间质干细胞,置于0,100,200,300,400,500,600,700,800,900mmol/L乙醇中作用24h,MTT法进行细胞毒性药物实验;置于0,100,200,300,400,500mmol/L乙醇中作用6,12,24h,AnnexinV/PI双标记法流式细胞仪检测细胞凋亡和线粒体膜电位变化情况;置于0,427mmol/L乙醇中作用24h,RT-PCR法检测与凋亡有关的基因bcl-2和Caspase-3mRNA表达水平。结果与结论:MTT检测结果显示427mmol/L是乙醇对大鼠骨髓间充质干细胞生长的半数抑制浓度;AnnexinV/PI检测结果表明,与0mmol/L组比较,随作用时间的延长与乙醇浓度的增加,骨髓间充质干细胞凋亡率及线粒体跨膜电位的破坏水平明显升高(P<0.05)。与0mmol/L组比较,乙醇作用24h后427mmol/L组bcl-2mRNA表达水平下降,Caspase-3mRNA表达水平增加(P<0.05)。说明乙醇能诱导大鼠骨髓间充质干细胞凋亡,凋亡的发生可能与线粒体膜电位破坏、线粒体功能障碍、bcl-2和Caspase-3激活有关。     

周围神经损伤后修复再生的研究进展

周围神经损伤是手显微外科的常见病,其治疗及功能恢复一直都是手显微外科的难题。周围神经缺损后如何促进再生修复,提高神经缺损的治疗效果,使患者功能恢复较好,一直是临床研究的重点、热点、难点。近年来随着基础研究的不断深入,人们对周围神经解剖及其再生微环境的认识,周围神经损伤治疗方法已经由药物治疗、手术治疗发展到基因工程等,为周围神经损伤患者的治疗提供了更好的治疗思路。本文就周围神经缺损后周围神经修复的方法作一综述。     

新型神经导管复合材料与骨髓间充质干细胞的相容性

背景：理想的神经修复材料要有良好的生物相容性、生物可降解性、可塑性以及一定的机械强度. 目的：观察自行研制的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚（羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料与大鼠骨髓间充质干细胞的细胞相容性. 方法：将从SD大鼠骨髓中分离纯化的第3代骨髓间充质干细胞与精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚（羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料或浸提液共同培养作为实验组,并以含体积分数10%胎牛血清的培养液培养骨髓间充质干细胞作为对照组.观察细胞在复合材料上的生长、存活及凋亡情况. 结果与结论：MTT检测结果显示,共培养5,7 d,实验组吸光度值高于对照组（P〈0.05）;流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法结果显示,实验组细胞凋亡率显著低于对照组（P〈0.05）;扫描电镜观察见骨髓间充质干细胞在精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚（羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料表面生长良好,胞体发出多个突起,并交织成网状,呈典型的神经元样细胞表现.可见精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚（羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料与骨髓间充质干细胞具有良好的细胞相容性,可作为优良的载体用于构建人工仿生神经.     

诱导剂共培养：谁更适宜骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化？

背景：目前骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的方法较多,采用不同诱导方法对骨髓充质干细胞分化成神经细胞的比例是不同的。目的：比较化学诱导法和共培养法诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的差异。方法：大鼠全骨髓血细胞分离纯化法培养骨髓间充质干细胞,分为化学诱导组和共培养组,分别采用加入化学诱导剂β-巯基乙醇和Transwell小室共培养方法诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。结果与结论：诱导培养1周后从化学诱导和共培养组的骨髓间充质干细胞出现突起,且呈辐射生长,2周后均可见神经元特异性烯醇化酶阳性细胞。共培养组中第四五天可见星级神经细胞状结构,并形成更多的突起,神经元特异性烯醇化酶染色阳性率为（70.82±2.46）%。而在第六七天化学诱导组中神经细胞形态样细胞形成,并有连接,神经元特异性烯醇化酶染色阳性率为（52.37±1.83）%。提示细胞微环境在骨髓间充质干细胞分化成神经细胞发挥主导作用,且化学诱导法诱导效率低于共培养法。     

BMP-2重组质粒转染骨髓间充质干细胞及表达的检测

目的 pEGFP-N1/BMP-2真核表达质粒转染骨髓间充质干细胞,并检测其在靶细胞中的表达。方法脂质体将pEGFP-N1/BMP-2真核表达质粒转染入BMSCs,荧光显微镜下观察绿色荧光,计算转染率,利用ELLISA法检测目的基因在靶细胞中的表达,免疫组化染色检测成骨特异性生化指标(I型胶原、ALP及骨钙素)。结果本实验成功的利用脂质体将质粒转染入BMSCs,目的基因可以持续高表达,并促进细胞向成骨方向分化。结论为进一步利用BMP-2基因修饰组强Ⅰ程骨促进成骨提供实验基础。