西洋参PqERF1基因的克隆和生物信息学分析

乙烯响应因子(ethylene response factor,ERF)是具有PETALA2(AP2)结构域的转录因子。本研究通过西洋参(Panax quinquefolius L)的转录组高通量测序结果分析获得75条具有AP2结构域的转录因子序列,并克隆到一条开放阅读框为933对碱基的基因序列,定名为PqERF1。基因表达分析结果表明PqERF1基因受茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导,这与人参皂苷含量的受诱导模式相同。蛋白结构预测结果表明PqERF1是定位于细胞核的具有完整保守的AP2结构域的转录因子,InterproScan蛋白功能结构域分析结果表明PqERF1很可能为发病机制相关蛋白;序列比对和进化关系分析结果也显示PqERF1与发病机制相关蛋白(烟草NtERF4)、次生代谢产物相关合成蛋白(野胡萝卜DcERF1)和花衰老相关蛋白(矮牵牛PhERF12)的相似性高,且系统进化关系较近。因此,推测PqERF1基因可能是参与西洋参次生代谢产物合成调节、抗病性和衰老相关的重要基因。     

野生金荞麦高黄酮含量愈伤组织中一个类异黄酮还原酶（IRL）基因的克隆与分析(英文)

木脂素是重要的植物防御物质之一, 具有优良的生物学活性。为研究传统抗肿瘤良药野生金荞麦的 药用次生代谢, 用RACE与文库结合的方法, 从野生金荞麦高黄酮含量愈伤系cDNA文库中快速克隆了一个类异黄酮还原酶 (isoflavone reductase-like, IRL) 基因FcIRL的全长cDNA (accession no. EU116032)。FcIRL cDNA全长1 217 bp, 含有1个942 bp的开放阅读框 (open reading frame, ORF), 编码313个氨基酸, 其5′ UTR区含有2个终止子TAG, 3′ UTR区含有推测的加尾信号ATAAA和polyA尾, 对应基因组序列不含内含子。FcIRL蛋白N端含有1个N-乙酰化作用位点 (M₁-K₅) 和1个保守的NADPH结合位点 (G₁₀-G-T-G₁₃-Y-I-G₁₆), 具有1个保守的NmrA结构域 (V₆-N₂₄₄) 和多个重要的磷酸化位点, 以及1个保守的N-糖基化作用位点 (N₂₁₄)。序列同源性比较、系统发生分析以及蛋白质高级结构预测分析均表明, FcIRL属于松脂醇-落叶松脂醇还原酶 (pinoresinol- lariciresinol reductase, PLR) 类,推测具有PLR的生物活性, 是8−8′连接木脂素 (8−8′-linked lignans) 合成途径中的关键酶,催化松脂醇和落叶松脂醇,还原生成开环异落叶松脂 (secoisolariciresinol), 参与金荞麦药用次生代谢与植物的防御。     

白木香细胞色素P450还原酶基因的克隆、表达与功能鉴定

细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase, CPR)是细胞色素P450酶电子传递链的组成部分,在生物体内起着重要的电子传递作用。本研究从白木香(Aquilaria sinensis)愈伤组织细胞中克隆得到1个CPR基因(Ascpr1), Ascpr1含有一个2 124 bp的开放阅读框,编码707个氨基酸残基,其蛋白分子质量为78.82 kD。系统进化分析显示, AsCPR1为Ⅱ型CPR蛋白,与来源于可可树(Theobroma cacao)的CPR蛋白亲缘关系较近。跨膜预测结果显示该蛋白的第52～71位氨基酸为跨膜区,在大肠杆菌Transetta (DE3)中成功表达了N-端缺失67个氨基酸残基的融合蛋白,经亲和色谱纯化后获得对细胞色素C具有还原能力的融合蛋白AsCPR1。本研究结果为进一步研究P450酶参与的白木香防御物质合成及CPR在白木香防御反应中的作用奠定基础。     

多发性骨髓瘤患者PHF19基因表达水平及其与预后的关系

目的：探讨多发性骨髓瘤(MM)患者PHF19基因表达水平及其临床意义。方法：通过实时荧光定量PCR方法检测69例初诊MM患者、20例难治复发MM患者及正常对照PHF19基因表达,分析其表达水平与临床特征、疗效及预后之间的关系。结果：初诊患者PHF19水平明显高于正常对照(0.0206 vs 0.0008,P=0.000);相比于初诊患者,难治复发患者PHF19水平显著升高(0.0206 vs 0.0798,P=0.022)。在初诊患者中,以PHF19基因表达水平中位数作为分界值,分为低表达与高表达组,PHF19基因表达水平与患者性别、年龄、免疫球蛋白亚型及疾病负荷无相关;不同DS、ISS分期患者PHF19基因表达水平无统计学差异(P>0.05);中位随访22个月,PHF19基因低表达组OS率及PFS率优于高表达组。结论：PHF19基因表达与患者疗效和预后存在一定相关性,PHF19高表达患者预后不良。     

高原藏系绵羊EPAS1基因的克隆以及组织表达研究

采用Trizol法从高原藏系绵羊肺脏中提取总RNA,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行cDNA扩增并克隆测序,获得长度为517bp的EPAS1部分片段cDNA序列,应用荧光定量PCR分析EPAS1基因mRNA的组织表达量进行分析。     

食管组织中代谢酶相关基因的异常表达与食管癌的发病关系研究

目的研究与环境致癌物活化、解毒有关的相和相代谢酶的mRNA水平与食管癌发病的关系。方法收集93例淮安地区食管癌新发病例的食管癌组织及远端癌旁组织,应用SYBRGreen实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测CYP2E1、GSTP1、MTHFR和NQO1等基因的mRNA水平;应用t检验和logistic回归分析评价基因的表达水平与食管癌的关系。结果CYP2E1和MTHFR的mRNA水平在癌组织和配对癌旁组织之间有显著差异;条件logistic逐步回归分析结果显示CYP2E1、MTHFR表达水平异常与食管癌发病风险升高有关联[OR值(95%CI)分别为1.890(1.439~2.481)和1.362(1.107~1.677)]。结论CYP2E1和MTHFR的表达水平改变与食管癌发病风险密切相关,在食管癌的高危人群筛查和早期诊断中具有重要意义。     

sMICA基因的克隆表达及其纯化

目的构建重组MICA原核表达载体并探讨MICA对NK细胞毒效应的影响。方法经RT-PCR从Hela细胞获取MICA基因,经适当酶切后构建表达载体pBV220-MICA,转入大肠杆菌DH5α进行表达。重组MICA蛋白经纯化后与NK92细胞孵育观察对NK细胞毒效应的影响。结果带有重组质粒pBV220-MICA的大肠杆菌经热诱导后,以可溶性形式表达重组MICA蛋白,纯化后的重组MICA蛋白纯度为95%。经重组MICA处理的NK92细胞对MICA表达阳性的肿瘤细胞的杀伤作用明显降低。结论构建了pBV220-MICA重组质粒,并在大肠杆菌中获得可溶性表达,为研究MICA与NK细胞受体的相互作用机制奠定了基础。     

Neprilysin在肾肿瘤细胞系和组织中的表达及其临床意义

目的检测Neprilysin在肾肿瘤细胞系和组织中的表达,并分析其表达水平与临床病理特征如年龄、、临床分期、骨转移、肿瘤分化程度的关系。方法通过实时荧光定量PCR检测Neprilysin基因在肾肿瘤细胞系及39例肾癌和16例肾正常组织中mRNA的表达情况。Western blot检测以上标本Neprilysin蛋白的表达水平。使用统计软件SPSS 13.0采用Spearman相关分析Neprilysin基因的表达水平与临床病理特征的关系。结果 Neprilysin基因在肾肿瘤细胞系中相对于正常组织表达下调,这与基因芯片的结果相类似。相对于正常组织,本实验中100%的肾癌患者组织中NEPRILYSIN mRNA及蛋白表达均显著下调。统计分析表明,Neprilysin的表达水平与cTNM分期及骨转移有关,而与年龄及肿瘤分化程度无显著关系。结论 Neprilysin表达低能够促进肾癌的发生。但需要更进一步的研究去阐明Neprilysin的调控机制以及Neprilysin在细胞生理和肿瘤发生中的作用。     

实时荧光定量PCR检测沙门菌flor基因和sul2基因方法的建立

目的 建立一种flor基因和sul2基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,为检测沙门菌的耐药性以及耐药基因分子流行病学调查奠定基础.方法 以氟苯尼考、复方磺胺甲噁唑抗性的沙门菌菌株为材料,根据GenBank中登陆的沙门菌flor和sul2基因序列,设计并合成引物,建立基于SYBR Green Ⅰ染料技术的Real-Time PCR检测体系,绘制出标准曲线并对其溶解曲线进行分析.结果 以pMD 18-T为载体构建的标准品的Ct值与样品的浓度的对数在一定范围内呈现良好的线性关系,两基因的检测域值较小,flor基因可以检测到102 copies/μL的样品,sul2基因可以检测到103 copies/μL的样品,经耐药性与基因表达量相关分析,耐药性较高的菌株其flor基因、sul2基因表达量也较高.结论 建立的检测沙门菌中flor因和sul2基因的荧光定量PCR方法具有很好的灵敏性、特异性和重复性,可以广泛用于临床中lor和sul2两种基因的检测以及沙门菌耐药分子流行病学的调查.     

HPLC测定金荞麦中的金丝桃苷

目的 测定金荞麦中金丝桃苷的含量.方法 采用HPLC法,色谱柱为Shimadzu C18(150 mm ×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-0.2%H3PO4溶液(45:55),流速为1.0 ml·min-1,检测波长为350 nm,柱温为室温,用标准曲线法定量,测定金荞麦中金丝桃苷的含量.结果 金丝桃苷0.5～2.5 μg与峰面积的线性关系良好(r=0.9998),回收率为95.01%,RSD=2.94%.结论 所建方法简便、快速,适用于金荞麦中金丝桃苷的测定.     

金荞麦中具抗菌活性内生真菌的筛选和鉴定

目的 研究药用植物金荞麦的抗菌活性内生真菌.方法 采用PDA培养基,从金荞麦的块根、茎、叶中分离到20株内生真菌,鉴定其抗菌活性,并对抗菌活性菌株进行形态学特征和分子鉴定.结果 发现其中1株内生真菌FD12对金黄色葡萄球菌有抗菌活性,但对大肠杆菌、黑曲霉无抑制作用;经形态学特征和分子鉴定,确定菌株FD12为黑肉座菌Hypocrea nigricans.结论 文中结果可为保护金荞麦野生资源,寻找和开发新型抑菌生物制剂开辟了一条新途径.     

金荞麦的化学成分研究

目的研究中药金荞麦中的化学成分。方法运用多种色谱方法分离化学成分 ,依据理化性质、波谱 (NMR、EI- MS)数据分析鉴定化合物结构。结果从金荞麦中初步分离得到 5个化合物 ,分别鉴定为赤杨酮 (glutinone ,Ⅰ )、赤杨醇 (glutinol,Ⅱ )、棕榈酸单甘油酯 (glycerolmonopalmitate ,Ⅲ )、木犀草素 (luteolin ,Ⅳ )、正丁醇 - β- D- 吡喃型果糖苷 (n butyl -β- D fructopyronoside ,Ⅴ )。 结论 5个化合物均为首次从荞麦属植物中分离得到。     

金荞麦蒸馏产物的GC／MS分析

目的:鉴定中药金荞麦挥发油的化学成分。方法:用水蒸气蒸馏法对金荞麦根进行了挥发性成分提取,采用 GC/MS 分析法进行了分析鉴定。色谱柱 SE54(30 m×0.32 inln),柱温采取程序升温,起始温度40℃,保持1 min,升温速率8℃·min~(-1),终点温度220℃。结果:用 GC/MS 分离鉴定了43种化合物,质量分数用面积归一化法获得。43种物质中,13个烃类,30个烃类氧化物,主要物质十六酸10.34%,(Z,Z)-9,12-十八二烯酸6.44%,1,4,4a,5,6,7,8,8a-八氢-2,5,5,8a-四甲基-1-萘烯甲醇3.27%,樟脑0.871%,萘0.84%,[1ar-(1a.α,4a.α,7.β,7a.β,7b.α)]-脱氢-1,1,7-三甲基-4-亚甲基-1H-环丙[e]奠-7-醇0.513%,正壬醛0.434%,芳樟醇0.172%。结论:本方法分离效果良好,鉴定组分准确,对金养麦的深入研究有一定价值。     

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及其表达

目的获得大量高纯度、具有生物学活性的人胰岛素样生长因子 1(hIGF 1) ,构建hIGF 1原核表达载体 ,并进行表达与纯化。方法以pUCIGF质粒为模板 ,PCR扩增了hIGF 1基因。经适当酶切后 ,构建表达载体pRSET IGF ,转入大肠杆菌BL2 1(DE3)进行表达 ,并经阴离子交换色谱、疏水色谱和凝胶过滤纯化。结果带有重组质粒pRSET IGF的大肠杆菌经IPTG诱导后 ,以可溶性形式表达 7.8kD大小的蛋白 ,其表达量占菌体总蛋白量的10 %～ 2 0 % ,纯化后目的蛋白纯度达 95 %以上 ,Western印迹表明重组蛋白具有hIGF 1抗原活性。结论构建了pRSET IGF重组质粒 ,并成功地在大肠杆菌中获得可溶性表达 ,为获得大量基因工程产品奠定了基础     

Quantitative gene expression analysis in a nonhuman primate model of antibiotic-induced nephrotoxicity

Gene expression patterns using microarrays have been described for rodent models of nephrotoxicity. To determine if significant gene expression changes previously identified have application across multiple species, we studied quantitative gene expression changes in the kidneys of female cynomolgus monkeys after exposure to two nephrotoxicants. Animals were dosed with the aminoglycoside gentamicin (10 mg/kg), the experimental oligosaccharide antibiotic everninomicin (30 or 60 mg/kg), or a combination of gentamicin (10 mg/kg) and everninomicin (30 mg/kg) for 7 days. Monkeys receiving these drugs in combination developed renal lesions as early as Day 1. By Day 7, monkeys dosed with 60 mg/kg everninomicin alone also developed renal lesions, while the group exposed to both compounds had more extensive renal damage. The modulation of several genes previously reported to be associated with nephrotoxicity in rodent models was confirmed using quantitative real-time PCR. Among these, waf-1, matrix metalloproteinase-9, and vimentin exhibited changes consistent with the definition of a genomic indicator of toxicity. In addition, we identified three early gene biomarkers that may be predictive of drug-induced nephrotoxicity: clusterin, osteopontin, and hepatitis A virus cellular receptor-1. Logistic regression demonstrated a high degree of correlation between changes in gene expression and the probability of the development of histopathologic lesions. These results are the first confirming rodent gene expression changes associated with nephrotoxicity in a nonhuman primate model and provide preliminary evidence for identifying early gene expression changes predicting the onset of drug-induced renal tubular damage in cynomolgus monkeys.     

大鼠血栓调节蛋白基因的克隆及在原核细胞中的表达

目的研究大鼠血栓调节蛋白基因的扩增、克隆及在原核细胞中的表达。方法以大鼠基因组DNA为模板,进行PCR扩增,用pMD18-Tsimple vector进行T克隆并测序。经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,将目的基因克隆到pET-28a(+)表达载体质粒中,转化E.coliBL21(DE3)表达重组蛋白,通过SDS-PAGE分析表达产物。结果含有大鼠血栓调节蛋白基因的PCR产物约为1850bp。重组pMD18-Tsimple vector质粒和重组pET-28a(+)质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后,有相应大小的目的片段,测序结果正确。经IPTG诱导,重组pET-28a(+)质粒在E.coliBL21(DE3)中有相对分子质量约为72000的融合蛋白表达。结论成功克隆了大鼠血栓调节蛋白基因,并成功表达了该基因编码的蛋白。