糖尿病干细胞移植的研究进展

理想的糖尿病治疗方法就是通过外源的或内源的移植使胰腺细胞再生,胰岛移植是治疗糖尿病的有效方法,但供体数量不足限制了它的广泛应用。干细胞具有不断增值和分化的潜能而成为胰岛细胞来源的研究热点,其能够在体外特定的培养调解下分化成为胰岛素产生细胞。随着免疫学、分子生物学等相关学科不断发展,目前胰岛干细胞研究取得了相当大的进展,干细胞移植成为治疗糖尿病的新途径。文中将就研究的现状、面临的问题及其可能解决途径等进行综述。     

骨髓干细胞来源胰岛移植物的研究进展

<正>随着器官(或组织)移植技术的进步,胰腺和胰岛移植已用于治疗糖尿病。胰岛移植相比胰腺移植,操作简单、安全、不良反应轻,但大规模应用仍受限于供体不足、免疫排斥等问题[1]。体外建立功能性胰岛素分泌细胞是解决以上问题的最佳方法。随着分子生物学和细胞生物学的快速发展,以干细胞为种子细胞诱导分化为胰岛的研究取得了很大的成果,其中骨髓干细胞来源渐成为研究热点。骨髓干细胞具有多向分化潜能、高度的增殖能力,易于提取和进行体外基因操作,并且具有免疫调节能力。本文对近年来骨髓干细胞来源胰岛替代治疗糖尿病的研究进展做一综述。     

干细胞向胰岛细胞的诱导分化及其在实验性糖尿病治疗中的应用

胰岛移植是治疗糖尿病的一种有效方法，然而，供体的缺乏极大地限制了胰岛移植的临床应用。如何解决胰岛移植所需的细胞来源是当今医学研究的一个重要问题。虽然异种胰岛移植是一种可能的解决途径，但它所伴随的免疫排斥和病毒感染等问题至今还没有得到解决。干细胞具有自我增生的能力和分化成为各种组织细胞的潜能。通过体外培养干细胞并将其诱导分化成为胰岛的内分泌细胞，将有可能解决糖尿病治疗所需要的细胞来源。干细胞由于组织起源的不同在增生和分化能力上存在很大差别。将干细胞诱导分化成为胰岛的内分泌细胞并形成适合于细胞移植的胰岛样结构涉及到许多关键技术。虽然，国际上已经在此研究领域取得了一些令人鼓舞的研究结果，但将干细胞技术应用于糖尿病的治疗还有许多问题有待解决。本文就这方面的研究进展及有待解决的问题作一扼要的综述。     

糖尿病细胞治疗的研究进展

胰岛移植是治疗糖尿病行之有效的方法,但供体数量不足限制了它的广泛应用,干细胞具有不断增殖和分化的潜能而成为胰岛细胞来源的研究热点。胚胎干细胞和骨髓、胰腺、肝脏等来源的成体干细胞在体外可诱导分化为胰岛内分泌细胞。未来研究应致力于如何提高干细胞诱导分化的效率和改善分化所得胰岛细胞的成熟度。     

干细胞向胰岛细胞的诱导分化及其在实验性糖尿病治疗中的应用

胰岛移植是治疗糖尿病的一种有效方法,然而,供体的缺乏极大地限制了胰岛移植的临床应用。如何解决胰岛移植所需的细胞来源是当今医学研究的一个重要问题。虽然异种胰岛移植是一种可能的解决途径,但它所伴随的免疫排斥和病毒感染等问题至今还没有得到解决。干细胞具有自我增生的能力和分化成为各种组织细胞的潜能。通过体外培养干细胞并将其诱导分化成为胰岛的内分泌细胞,将有可能解决糖尿病治疗所需要的细胞来源。干细胞由于组织起源的不同在增生和分化能力上存在很大差别。将干细胞诱导分化成为胰岛的内分泌细胞并形成适合于细胞移植的胰岛样结构涉及到许多关键技术。虽然,国际上已经在此研究领域取得了一些令人鼓舞的研究结果,但将干细胞技术应用于糖尿病的治疗还有许多问题有待解决。本文就这方面的研究进展及有待解决的问题作一扼要的综述。     

干细胞:糖尿病β细胞的源泉

治疗糖尿病最理想的途径为重建胰岛功能,恢复生理调节.胰岛细胞移植可以达到此目的,但由于供体来源缺乏及移植排斥反应阻碍了其广泛应用.而胚胎发育时,胚胎干细胞可以分化为各种功能细胞,包括胰岛细胞,为临床应用干细胞移植取代胰岛细胞移植治疗糖尿病提供了依据.本文就近年来不同来源的干细胞诱导分化为胰岛细胞治疗糖尿病的若干基础研究和临床治疗进展进行了简要综述.     

脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的研究进展

人脐带间充质干细胞是一种从人脐带间质组织中分离出来的全能干细胞,具有自我更新、免疫缺陷和多向分化潜能。新近研究表明,人脐带间充质干细胞在体内微环境及体外细胞因子的作用下不仅能够分化为胰岛样细胞,而且具有一定的β细胞分泌功能,能够降低血糖,克服了胰岛移植治疗糖尿病所面临的供体细胞缺乏和免疫排斥反应问题,从而有望为临床糖尿病细胞治疗开辟了一条新的途径。     

诱导多能干细胞分化为胰岛β样细胞的研究进展

人类诱导多能干细胞(iPSCs)是通过体外基因转染、小分子化合物处理等方法诱导体细胞重编程而获得的类似胚胎干细胞的多能性干细胞,在体外将其诱导为有分泌胰岛素功能的具有3D结构的胰岛β样细胞进行移植治疗糖尿病,可以较好地解决既往成体胰岛移植所面临的伦理、来源受限等诸多难题。人类iPSCs诱导分化成胰岛β样细胞需内外因子体外联合调控,但目前尚无统一标准诱导方法大量并稳定的获得胰岛β样细胞,且存在致瘤风险及免疫排斥两大关键问题。因此,iPSCs来源的胰岛β样细胞移植治疗糖尿病是未来亟待解决的重点和难点问题。     

骨髓间充质干细胞治疗大鼠糖尿病肾病初探

目的 探索骨髓间充质干细胞(MSCs)经体外扩增培养后移植入糖尿病肾病大鼠体内能否改善或者治疗糖尿病肾病.方法 SD大鼠60 mg/kg STZ一次性腹腔注射,糖尿病成模后4周,成功制备糖尿病肾病大鼠被随机分为:糖尿病肾病对照组(n=12)和干细胞移植组(n=12),另选6只正常大鼠作为对照组.MSCs经体外培养、鉴定、BrdU标记后,心脏注射到干细胞移植组大鼠体内(2×106 MSCs/200 μL),一周后再次注射等量干细胞.于末次注射后1、2、8周测定大鼠血糖、体质量、24 h尿总蛋白、肌酐清除率、肾脏肥大指数,观察大鼠肾脏病理变化和标记干细胞体内作用情况.结果 MSCs体外扩增培养后表达间充质细胞的表型抗原,能多向分化为成骨、成脂细胞.在体内能趋化到受损肾脏,但在干细胞定植部位未发现增殖细胞.干细胞移植组和糖尿病肾病对照组在各观察时点血糖、尿总蛋白、肌酐清除率、肾脏肥大指数均明显高于正常对照组(P<0.05), 体质量均低于正常对照组(P<0.01).干细胞治疗后1周移植组较糖尿病肾病对照组血糖降低[(26.7±2.8) vs (29.9±1.6) mmol/L,P<0.05].在第2、8周,移植组较糖尿病肾病对照组24 h尿总蛋白降低,但差异无统计学意义.干细胞移植组肌酐清除率低于糖尿病肾病对照组,在治疗后2周两组差异有统计学意义[(8.6±1.9) vs (17.1±1.6) mL/min,P<0.05].在第2周干细胞移植组的肾脏肥大指数较糖尿病肾病对照组减少(5.5±0.1 vs 6.2±0.3, P<0.05),但高于正常对照组(3.2±0.2).结论 发现MSCs经体外培养标记后在体内能趋化到糖尿病肾病大鼠肾脏,可以暂时改善糖尿病肾病.     

胰腺干细胞对移植胰岛的保护作用

目的探讨胰腺干细胞对胰岛体外存活时间及保持胰岛功能的作用,为胰岛移植治疗1型糖尿病提供更多高质量胰岛。方法分离纯化培养SD大鼠胎鼠胰腺干细胞;不连续密度梯度分离纯化SD大鼠胰岛;实验分组:单纯胰岛培养组(以下简称单纯培养组)、胰岛与胚胎胰腺干细胞联合培养组(以下简称联合培养组),体外观察胰岛形态变化,AO/PI法观察胰岛存活率,酶联免疫吸附法(ELISA)检测胰岛素分泌量及刺激指数。体内实验分别取两组培养7d的胰岛600个移植于糖尿病大鼠左肾包膜下,术后监测血糖变化情况。结果联合培养组的胰岛存活率显著高于单纯培养组,培养7d存活率分别为70%,40%;14d时为40%,5%;均P<0.01;高糖刺激下联合培养组胰岛分泌量及刺激指数均高于单纯培养组,培养7d时高糖刺激下胰岛素分泌量分别为(571.4±42.5)ng/L和(392.8±20.2)ng/L(P<0.01),刺激指数1.95±0.24和1.51±0.13(P<0.01)。联合培养后的胰岛左肾包膜下移植大鼠血糖可于第5天降至正常,而单纯培养后的胰岛移植血糖没有降至正常。结论胎鼠胰腺干细胞与胰岛联合培养可以明显延长胰岛体外存活时间并保持良好的活性,对胰岛具有良好的保护作用。     

大鼠胰腺导管上皮细胞体外诱导的研究

目的:观察大鼠胰腺导管上皮经四步法诱导分化为胰岛样细胞团后移植治疗糖尿病的效果?方法:采用Ⅴ型胶原酶胆管内灌注消化法,经Ficoll不连续密度梯度离心后分别获得导管上皮细胞和新鲜胰岛?导管上皮细胞经原代培养及传代后取2~6代细胞开始进行四步18天的诱导,分化为胰岛样细胞团,行免疫荧光鉴定?将链脲佐菌素造模成功的18只SD大鼠采用完全随机法均分成3组,空白对照组?新鲜胰岛组?胰岛样细胞团组进行左肾包膜下移植?分别给予RMPI1640?新鲜胰岛和胰岛样细胞团,移植后隔日固定时间监测血糖?结果:经免疫荧光鉴定,分离纯化的胰腺导管细胞具有干细胞特性,诱导后的胰岛样细胞团胰岛素?胰高血糖素染色均为阳性?移植后空白对照组血糖维持在高血糖范围?新鲜胰岛组移植后血糖逐步下降至正常水平,并在2周之内基本稳定在正常范围内但略有上升?胰岛样细胞团组移植后前2天血糖不降反升,之后有所下降但始终未能降至正常范围,然后又逐渐上升?结论:胰腺导管上皮细胞经该方案诱导后分化为胰岛样细胞团,使糖尿病大鼠血糖有一定程度的下降,但下降幅度及维持时间不能令人满意,可能与移植量不够及诱导的胰岛样细胞团功能不良有关?     

胰腺干细胞和胰岛细胞在糖尿病 大鼠治疗中的疗效观察

目的 探讨大鼠胰腺干细胞与胰岛细胞移植在大鼠糖尿病治疗中的疗效。方法 通过链脲菌 素复制1 型糖尿病大鼠模型并随机分为胰岛细胞组和胰腺干细胞组。用胶原酶V 分别消化新生和成年大鼠 胰腺,Percoll 梯度离心分离胰岛细胞和胰腺干细胞。采用Bonner-Weir 法诱导胰腺干细胞分化,DTZ 染色 检测移植物纯度,AO/PI 检测移植物活性。分别记录手术前后大鼠血糖水平、胰岛素水平及移植物存活时 间;高糖刺激实验和腹腔糖耐量评价移植物功能;取各组大鼠移植部位标本行HE 染色和免疫组织化学染 色,观察组织形态学变化。结果 胰岛细胞组和胰腺干细胞组血糖分别在术后3 和5 d 恢复正常（P <0.05）, 两组大鼠术后不同时间点的血糖有差异（P <0.05）,胰腺干细胞组的降糖能力强于胰岛细胞组（P <0.05）。 两组大鼠移植后7 d 血清胰岛素水平均较术前升高（P <0.05）。高糖刺激实验表明,各组移植后15 和65 d 高糖刺激后的C 肽水平较刺激前升高（P <0.05）,胰岛细胞组移植后65 d 高糖刺激后C 肽水平低于胰腺 干细胞组（P <0.05）,胰岛素和C 肽水平监测结果表明胰腺干细胞组移植物胰岛素分泌维持时间长于胰岛 细胞组。移植后腹腔糖耐量实验结果表明移植物均功能良好。胰岛细胞组和胰腺干细胞组移植物的中位 存活时间分别为73 和88 d,Kaplan-Meier 曲线分析提示胰腺干细胞组移植物生存时间较胰岛细胞组延长 （P <0.05）。HE 染色提示肝脏门静脉移植区域可见新生血管包绕的胰岛细胞团,免疫组织化学染色证实细 胞团胰岛素阳性。结论 胰腺干细胞分化后经门静脉移植能安全有效地发挥降糖作用,疗效优于胰岛细胞 移植。     

大鼠胰岛细胞和骨髓间充质干细胞联合移植治疗糖尿病小鼠的研究

目的观察骨髓间充质干细胞诱导异种胰岛细胞移植的免疫耐受作用。方法4周龄SD大鼠作为供体,密度梯度离心法分离间充质干细胞,胶原酶消化法分离胰岛细胞,链脲佐菌素制备糖尿病模型BALB/C小鼠25只。将成模小鼠分为:A组(胰岛细胞联合骨髓间充质干细胞移植组)10只,B组(单纯胰岛细胞移植组)10只,均经门静脉注射途径注入肝脏,C组(对照组)5只,仅经门静脉注入等量生理盐水,比较各组血糖改善情况。结果两实验组均较对照组有显著差异,其中胰岛细胞联合间充质干细胞移植组效果优于单纯胰岛细胞移植组。结论骨髓间充质干细胞可以诱导小鼠对大鼠胰岛细胞的免疫耐受,延长胰岛细胞移植物的存活时间。     

骨髓基质细胞向神经细胞诱导分化的研究进展

骨髓基质细胞(BMSCs)作为一种成体干细胞,具有一定的自我更新、高度增殖和多向分化的潜能。在适宜的条件下,可以诱导分化为神经样细胞。骨髓基质细胞来源方便,取材较容易,体外培养和扩增的技术条件简便,具有向神经系细胞分化的潜能,可以考虑作为细胞移植治疗的种子细胞。     

成人自体心肌干细胞体外高效扩增及特异性鉴定

[目的]建立一种稳定、高效的成人自体心肌干细胞体外培养扩增及特异性鉴定方法。[方法]手术中取下的心脏组织标本,通过胶原酶消化的方法获得细胞,使用自体血清进行贴壁培养和传代的方法纯化细胞,细胞增殖至3代后进行RT-PCR基因表达检测,流式细胞表面标记检测及染色体核型分析的鉴定。[结果]通过本实验的方法可以在成人心肌组织中分离和纯化心肌干细胞,并在体外可大量增殖,至3代细胞可增殖至5×107。RT-PCR鉴定其具有全能干细胞因子Nanog、Oct-4、Sox-2、Rex-1的mRNA表达,及心肌转录因子Nkx2.5和GATA4的mRNA和蛋白表达;表达间质干细胞表面标记CD29、CD90、CD105;不表达造血干细胞表面标记CD45和人免疫抗原HLA-DR;且培养后46条染色体无移位和缺失等染色体突变。[结论]通过本研究确立了一种稳定、高效的成人自体心肌干细胞体外培养,扩增和特异性鉴定的方法,为自体心肌干细胞移植技术的临床应用奠定重要的基础。     

间充质干细胞在致敏受者造血干细胞移植中的作用

【目的】 本实验拟研究骨髓间充质干细胞(MSC)在致敏受者造血干细胞移植中的作用?【方法】 体外分离BALB/c小鼠骨髓细胞,通过贴壁培养方法获得MSC,应用流式细胞仪检测细胞表面分子标记?通过异基因脾细胞输注方法建立致敏动物模型;绿色荧光染料标记骨髓MSC,分别移植到非致敏及致敏受者体内,并于移植后不同时间点检测MSC的归巢情况?致敏BALB/c小鼠经照射预处理,联合应用同基因MSC与异基因骨髓细胞移植,每日观察小鼠的生存情况?【结果】 体外培养第4代MSC表现为长梭形,阴性表达造血细胞表面分子而阳性表达粘附分子?动物体内实验发现移植后第48小时,MSC在非致敏受者体内主要归巢于骨髓,而在致敏受者体内主要归巢于脾脏?造血干细胞移植实验中,致敏小鼠接受同基因骨髓MSC与异基因骨髓细胞移植,结果发现致敏小鼠在移植后第12 ~ 16天全部死亡,生存中位数时间是14 d?【结论】 成功培养小鼠骨髓MSC;移植后MSC在致敏受者体内主要归巢于脾脏组织;联合应用MSC移植并不能有效促进异基因造血干/祖细胞在致敏受者体内植入?     

自体外周血造血干细胞移植治疗1型糖尿病的临床观察

目的 探讨自体外周血造血干细胞移植治疗1型糖尿病的有效性及安全性.方法 2009年11月至2010年8月于解放军第三○九医院细胞治疗科诊治的16例1型糖尿病患者经环磷酰胺+粒细胞集落刺激因子动员造血干细胞至外周血,血细胞分离机采集外周血造血干细胞并予以冻存;患者采用环磷酰胺+猪抗人淋巴细胞球蛋白方案预处理后,经静脉回输造血干细胞.观察所有患者移植前后胰岛素注射剂量、糖化血红蛋白(HbA1c)水平、C肽水平、血糖水平,同时记录治疗过程中的不良反应.结果 自体外周血造血干细胞移植后12例患者脱离胰岛素,脱离胰岛素时间在移植后3～20 d,中位时间为9 d.中位随访28周(8～44周).12例中最长已脱离胰岛素10个月余,无患者再重新依赖胰岛素.4例患者未脱离胰岛素,此4例患者移植前均C肽水平低且病程较长,但胰岛素用量均较移植前下降,所有患者胰岛功能较前明显改善.所有患者未出现骨髓抑制等严重不良反应.结论 自体外周血造血干细胞移植治疗1 型糖尿病,初步结果显示出一定的临床有效性及安全性,远期疗效有待进一步验证.

Abstract：

Objective To explore the efficacy and safety of autologous peripherial blood hematopoietic stem cell transplantation (APBHST) in patients with type 1 diabetes mellitus. Methods Hematopoietic stem cells were mobilized with cyclophosphamide and granulocyte colony stimulating factor for 16 patients with type 1 diabetes mellitus who admitted to our department during November 2009 to August 2010. And then stem cells were collected from peripheral blood by leukapheresis and cryopreservation. The cells were infused intravenously after conditioning with cyclophosphamide and antithymocyte globulin. To compare the daily dose of exogenous insulin requirements, the serum levels of hemoglobin A1c (HbA1c), C-peptide, islet cell function during the mixed meal tolerance test were measured before and at different times after APBHST. Blood glucose was monitored 7 times a day before and after APBHST. And the adverse effects were recorded during and after APBHST. Results The median follow-up was 28 weeks (range: 8-44 weeks). Twelve of 16 patients stayed free from insulin at 3-20 days post APBHST. And islet cell function greatly improved after APBHST. Four of 16 patients required exogenous insulin but the dosage decreased. And all 4 patients had a poor level of C-peptide before APBHSCT. There were no such severe adverse effects as myelosuppression. Conclusion Very encouraging results have been obtained in the patients treated with APBHST. There is definite therapeutic effects and safety in a short term. But further follow-up is necessary to confirm the duration of insulin independence and the mechanisms of action.     

间质干细胞移植治疗1型糖尿病

1型糖尿病是由胰岛β细胞的自身免疫性破坏所致。补充胰岛素是1型糖尿病最基本的治疗,胰岛移植是治愈的根本。然而胰岛移植受供体缺乏的限制。来源于间质母细胞(MSCs)的胰岛生成细胞(IPCs)则成为一种新的有吸引力的选择。一方面,在体外,来源于胰腺、骨髓、脂肪组织、脐带血及组织的MSCs通过基因修饰能够分化成为IPCs。另一方面,MSCs可以作为人类胰岛素基因表达的载体。此外,MSCs的血管生成作用也能被用于糖尿病的治疗。总之,应用MSCs治疗1型糖尿病具有广阔前景。