肿瘤抗原MAGE-12的B细胞新表位多重抗原肽的免疫原作用研究

 目的 在已设计合成肿瘤抗原MAGE-12的B细胞新表位多重抗原肽基础上对其进行免疫原作用研究.方法 在预测MAGE-12的B细胞表位序列为LEQRSQHCKPEE(3～14)的基础上,采用4分支多重抗原肽(MAP)结构设计合成抗原肽,免疫C-57BL/6小鼠,产生多克隆抗体,应用ELISA实验及免疫组化实验检测多克隆抗体是否为人的抗原肽的特异性抗体.结果 免疫C-57BL/6小鼠后可产生MAGE-12的抗原特异性的多克隆抗体,抗体效价最高达1:256,免疫组化实验阳性证明为人MAGE-12抗原肽的特异性抗体.结论 MAGE-12的B细胞新表位多重抗原肽有免疫原作用.     

SARS-CoV S蛋白抗原表位多肽的设计合成与免疫反应

目的通过生物信息学与合成多肽方法,寻找SARS-CoV S 蛋白的抗原表位,为抗SARS多肽疫苗的深入研究提供试验依据.方法利用网络共享软件对与S蛋白抗原性相关的参数进行预测分析,从而设计S蛋白的抗原表 位多肽;将合成的抗原表位多肽免疫家兔,用ELISA法检测产生的抗体.结果 ELISA法检测发现,设计合成的2个抗原表位多肽片段(残基348-380,434-470)在家兔体内均能诱导抗体产生.结论设计合成的2个抗原表位多肽片段中包含SARS-CoV S蛋白的抗原表位,免疫家兔后能产生特异性抗体.     

鼠抗人纤维蛋白抗体单链Fv片段的三维结构模建

用Ｂｉｓｙｍ公司开发的计算机辅助分子设计系统模建了鼠人纤维蛋白抗体Ｆｖ片段的三维结构。Ｆｖ是由重链可变区和轻链可变区两个结构域组成的具有抗原结合能力的最小抗体片段。先分别模建了Ｖｈ和Ｖ１两个结构域，然后搭建出Ｆｖ片段的整体三维结构，并对模建的结构进行了分子力学和动力学优化。     

抗人Toll样受体4合成肽单克隆抗体的制备与鉴定

在对Toll样受体4（TLR4）B细胞优势表位预测的基础上，合成该B细胞表位多肽，并以此为抗原免疫BABL／C小鼠，经鼠－鼠杂交，ELISA筛选，有限稀释克隆化，得到一株分泌抗TLR4合成肽的杂交瘤细胞株B4，腹水效价为1：100000。其免疫球蛋白为IgG2,k型。ELISA鉴定表明该抗体能识别TLR4^ 性细胞，Western blot分析显示在分子量约90kD处呈现单一免疫色带。     

基于蛋白芯片对不同方法预处理疫苗的抗原性评价

目的分别对4种疫苗（A群脑膜炎球菌多糖疫苗、吸附白喉破伤风联合疫苗、麻疹减毒活疫苗、炭疽芽孢杆菌疫苗株裂解液）进行不同的预处理,使其能作为抗原检测所诱导的抗体。方法分别用饱和碳酸钠溶液、重铬酸钾与稀盐酸混合液、80%乙醇处理A群脑膜炎球菌多糖疫苗,用饱和碳酸钠溶液、重铬酸钾与稀盐酸混合液处理吸附白破联合疫苗和麻疹减毒活疫苗,PAGE纯化炭疽杆菌疫苗株裂解液中的抗原,以蛋白芯片比较其抗原性。结果比较了不同方法预处理4种疫苗的效果,初步验证了所处理的疫苗具有良好的抗原性。结论运用恰当的处理方法对疫苗进行预处理,可使其在检测相应抗体时表现出良好的抗原性,为以疫苗作为抗原检测相应抗体打下了基础。     

小鼠单克隆抗体HAb25可变区的人源化计算机辅助设计

目的：对一株肝癌特异性小鼠单克隆抗体ＨＡｂ２５可变区进行人源化设计，通过人源化降低其免疫原性。方法：进行抗体结构同源模建，以计算机分析为主要手段，结合多重序列比较，进行人源化设计，结果；预测了ＨＡｂ２５可变区的立体结构，分析了决定抗体互补决定区初始构象的可能残基，提出了ＨＡｂ２５可变区的人源化替代方案。结论：立体结构信息结合计算机辅助分析为人源化设计提供了极大的影响。     

新型人源化抗CD20单克隆抗体的表达和活性检测

目的：制备新型人源化抗CD20单克隆抗体并检测其与CD20抗原的亲和力和抗肿瘤活性。方法通过计算机模建技术,在蛋白质结构数据库中找到与利妥昔单抗（ rituximab）空间结构最相近的人IgG1为骨架,将利妥昔单抗的互补决定区（ complementarity determining region ,CDR）进行移植和改造,通过重叠PCR方法,扩增出目的基因片段。分别将轻链（L）、重链（H）基因片段克隆到载体pcDNA3．3、pOptiVEC质粒上。瞬时转染至293F细胞,收取细胞上清,用rProteinA亲和层析法纯化目的抗体,并用十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检验抗体的纯度和表达量,采用Fortebio技术检测抗体与抗原的结合能力,最后通过裸鼠移植瘤生长抑制实验检测抗体的抗肿瘤活性。结果构建了3种抗CD20人源化抗体。抗体在还原SDS-PAGE中表现为两条相对分子质量约为25×103和55×103的条带,与预计条带大小相符;Fortebio实验结果表明,3组抗体与抗原具有良好的亲和活性：利妥昔单抗、L4H7抗体、L5H5抗体和L5H7抗体的Kd值分别为6．48×10－9、1．91×10－9、7．35×10－10和1．91×10－9 mol／L。裸鼠移植瘤生长抑制实验表明,L5H7抗体的抗肿瘤活性优于利妥昔单抗。结论成功构建并表达了3种抗CD20人源化抗体,其中L5H7抗体具有良好的抗原结合能力和抗肿瘤活性。     

抗HBsAg人VH基因中异常序列对抗体活性影响的研究

目的:我们曾从噬菌体抗体库中克隆到一株VH第3骨架区中含有异常序列的抗HBsAg人Fab基因,本工作拟探讨该VH基因中异常序列对抗体活性的影响.方法:采用重叠PCR方法去除这段异常序列,构建表达载体,转化大肠杆菌表达出抗HBsAg噬菌体抗体和可溶性Fab,测定了它们与抗原的结合活性.结果:与原抗体比较,改造后的抗体与抗原的结合活性明显下降,分子模建提示这段异常序列对VH CDR_1和CDR_2的部分氨基酸残基的位置有一些影响,测定改造前Fab的亲和力约为0.55×10~9M~(-1),改造后Fab因抗原结合活性过低,无法检测其亲和力.结论:提示这段异常序列在体内就可能存在于该VH之中.     

吗啡全抗原的制备及其免疫效果的评价

目的　制备吗啡及琥珀酰吗啡的全抗原 ,评价二种抗原诱导小鼠产生抗体效价的差异及其对吗啡致依赖的戒断症状的影响。方法　采用混合酸酐法制备琥珀酰吗啡 ,将吗啡及琥珀酰吗啡与BlueCarrier(BC)蛋白交联 ,与福氏佐剂等比例混合免疫小鼠 ;用ELISA法检测小鼠血清中抗体滴度 ;竞争性抑制实验检测抗体与吗啡的体外结合能力 ;观察免疫小鼠对吗啡的依赖能力。结果　二种交联物免疫小鼠第 9周血清中平均抗吗啡抗体滴度均超过 1∶80 0 0 ,其中M 6 S BC组效价强度较M BC组高 ,且效价维持时间较久 ;M BC组及M 6 S BC组与吗啡依赖组比较 15min内体重减轻、跳跃次数及潜伏期均有显著性差异 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 1)。二组抗体对吗啡的抑制率能达 5 0 %以上。结论　二种载体蛋白交联物都能诱导小鼠产生高滴度的抗吗啡抗体 ,并使免疫小鼠对吗啡的成瘾性降低     

抗平颏海蛇短链神经毒素全人源单克隆抗体的筛选、制备及生物活性研究

目的 重组表达3种平颏海蛇短链神经毒素,利用噬菌体抗体库筛选制备全人源抗毒素单克隆抗体并评估其生物活性.方法 以重组表达纯化的神经毒素蛋白作为抗原,从自主构建的噬菌体抗体库中筛选获得噬菌体抗体,经序列测定确定其抗体类型后构建完整抗体.利用真核表达系统表达纯化抗体后鉴定其抗原结合活性、生化特性及药代动力学特性.在体内验证抗体药物的抗毒素作用.结果 经过4轮筛选,获得2株能同时结合3种神经毒素的噬菌体单链抗体,并将其制备成完整的抗体,进一步证实所获得的抗体可特异性结合3种抗原.2株全人源抗体均可拮抗神经毒素对昆明小鼠的致死作用.结论 利用重组神经毒素和噬菌体抗体库技术成功获得了特异性抗平颏海蛇短链神经毒素的全人源治疗性抗体.     

SARS冠状病毒多聚酶区抗原在感染诊断中的作用探讨

目的原核表达严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-COV）非结构蛋白RNA多聚酶表位区,了解其在SARS-COV感染诊断及作为病毒复制指标方面的意义。方法通过PCR扩增获得RNA多聚酶表位区基因,与原核表达载体pET32a＋连接,转化大肠杆菌BL-21表达获得重组融合蛋白。经切胶透析纯化后,应用ELISA检测SARS患者及动物模型血清标本的IgG抗体。结果获得原核表达的RNA多聚酶表位区。ELISA检测正常人血清均阴性,SARS患者血清阳性率为95％;检测SARS病毒感染实验动物血清阳性率100％,灭活纯化病毒接种恒河猴均为阴性。结论RNA多聚酶表位区具有很好的免疫原性,可用于感染诊断的检测及作为病毒复制的指标。     

东部马脑炎病毒E2基因的克隆与表达

目的 :克隆表达东部马脑炎病毒 (easternequineencephalomyelitisvirus ,EEEV)E2基因 ,研究重组蛋白的抗原性 ,为研制东部马脑炎病毒基因工程诊断试剂奠定基础。方法 :由病毒感染的鼠脑制备总RNA ,利用RT_PCR技术扩增EEEVE2基因全长序列 ,并将其克隆至pGEM_Teasy载体测序 ,再将E2基因克隆至谷胱甘肽转移酶 (GST)融合表达载体pGEX_5x_2中表达。采用免疫印迹试验 (Westernblotting)和ELISA法分析表达的重组蛋白的抗原性。结果 :经过RT_PCR扩增和测序 ,证明得到的E2基因片段的序列是正确的 ,并且在原核载体中得到表达 ,目的蛋白占总菌体蛋白的 2 4 .5 % ,主要以包涵体形式存在。Western印迹分析表明GST_E2蛋白有良好的抗原性 ;包涵体经Tri tonX_10 0 ,1mol L和 2mol L尿素洗涤 ,初步纯化后 ,用表达的E2融合蛋白作为包被抗原初步建立了间接ELISA法 ,结果表明与兔抗EEEV血清起特异反应 ,但与兔抗WEEV血清无交叉反应。结论 :东方马脑炎病毒的E2基因在大肠杆菌中得到稳定表达 ,表达的GST_E2蛋白具有良好的抗原性和特异性 ,为从分子水平上对EEEVE2蛋白的功能性研究和发展EEEV基因工程诊断试剂奠定了基础     

HCV包膜蛋白E2的表达及其抗原性的检测

为研究丙型肝炎病毒（HCV）包膜蛋白E2在原核细胞和真核细胞中的表达，并对表达蛋白的抗原性进行检测。将HCV E2区N端的一段基因分别克隆入原核表达载体pQE30和真核表达载体pEF1/HisC中进行E2蛋白的表达，采用ELISA和WB对表达蛋白的抗原性进行检测。结果在原核细胞和真核细胞中均表达了预期大小的蛋白，能同HCV感染者血清发生特异性反应。提示该段E2基因在原核表达系统和真核表达系统均能表达出具有抗原活性的蛋白，其中真核细胞表达的蛋白可被糖基化。     

结核分枝杆菌Rv3873抗原表位预测及其蛋白片段抗原性研究

目的对结核分枝杆菌Rv3873进行生物信息学分析及抗原表位预测,原核表达Rv3873基因21～235位氨基酸蛋白片段,命名为Rv387321～235重组蛋白,初步分析其抗原性。方法 PCR扩增结核分枝杆菌Rv3873 21～235位氨基酸的基因片段,构建其原核表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）,获得重组蛋白并纯化;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）对Rv387321～235重组蛋白进行抗原性检测。结果具有优势抗原表位的Rv3873蛋白片段在大肠杆菌中高效表达;ELISA结果显示,Rv387321～235重组蛋白在结核病检测中的敏感性为28%,特异性94.6%。结论生物信息学预测Rv3873基因抗原表位,为寻找有价值的抗原靶点提供了参考;具有优势抗原表位的重组蛋白片段在结核病诊断中具有潜在应用价值,可作为联合诊断的备选抗原之一。     

我国登革2型病毒株E蛋白B抗原区基因的表达与鉴定

目的和方法：通过对登革２型病毒Ｅ蛋白Ｂ区基因片段的表达,研究Ｂ区蛋白的抗原性。首先采用ＰＣＲ方法扩增了编码Ｂ区蛋白的基因片段,并将其插入到ｐＭａｌ－Ｃ２原核载体进行融合表达。采用蛋白质印迹法和ＥＬＩＳＡ法对表达产物进行特异性鉴定。结果与结论：在构建的重组质粒Ｂ１６５－ｐＭａｌ中,Ｅ蛋白Ｂ区与大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白（ＭＢＰ）基因以融合形式高效表达。该融合蛋白可与登革１￣４型病毒的鼠腹水抗体起特异反     

Radiolabeled peptides in the diagnosis and therapy of oncological diseases.

There has been an exponential growth in the development of radiolabeled peptides for diagnostic and therapeutic applications in oncology. Peptides have fast clearance, rapid tissue penetration, low antigenicity and can be produced easily and inexpensively. However, peptides have problems with in vivo catabolism, unwanted physiological effects, and chelate attachment. The approved 111In-DTPA-OctreoScan, a somatostatin receptor binder, is well established for diagnosis of neuroendocrine tumors. NeoTect, an approved, 99mTc-labeled, somatostatin-receptor-binding analogue has good specificity for lung cancer detection. The receptors for Vasoactive Intestinal Peptide, Cholecystokinin-B/gastrin, Bombesin, Epidermal Growth Factor, and Alpha Melanocyte Stimulating Hormone and the Integrin, alpha(v)beta(3), are under active investigation as targets. Octreotide and its analogues labeled with 111In, 90Y, 64Cu or 177Lu are under study for the treatment of patients with promising results.     

乙型肝炎病毒多表位嵌合蛋白的表达、纯化和鉴定

目的：构建含乙肝病毒表达抗原前S1，S2（HBV preS1,preS2)优势B细胞表位与乙肝病毒核心抗原（HBcAg)的嵌合蛋白，探索其作为兼具预防和治疗HBV感染作用的新型疫苗的可能性。方法：利用分子克隆技术先后将HBV preS1(21-47AA.),preS2(133-145AA.)表位基因插入HBcAg基因中，得到HBV C144，CS1，CS1S2融合基因，分别克隆到原核表达载体pQE-30中，大肠杆菌（E.coli)M15中进行表达，用Ni^2 固相化的螯合Sepharose Fast Flow亲和层析纯化重组蛋白，最后进行抗原性的鉴定。结果：构建了HBV嵌合型颗粒蛋白表达载体，并在E.coli中高效表达出可溶性病毒样颗粒蛋白C144,CS1,CS1S2，经Ni-NTA亲和层析 化后，蛋白纯度达80％,Western印迹及ELISA证明蛋白各表位都具有抗原性。结论：本研究为进一步深入研究新型HBV治疗性疫苗的功能和应用奠定了基础。     

肝癌特异性结合肽的筛选及鉴定

目的探讨利用噬菌体随机肽库筛选肝癌细胞特异性结合多肽或肝癌细胞优势结合多肽的可行性。方法①利用噬菌体随机十二肽库，对人肝癌细胞系HepG2和人正常肝细胞系L02进行4轮差异筛选、富集，获得与肝癌细胞亲和的噬菌体克隆。②用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定其与肝癌细胞、正常肝细胞的亲和力，进一步筛选出高度亲和肝癌细胞的特异性阳性噬菌体克隆。比较其与其他肿瘤细胞的亲和力。③提取阳性噬菌体DNA并进行DNA序列测定，获得与肝癌细胞亲和的多肽序列。④用免疫荧光共聚焦成像进一步确定展示阳性多肽序列的噬菌体与肝癌细胞的结合部位。⑤根据筛选的多肽序列合成十六肽WH16，利用竞争抑制实验鉴定其与肝癌细胞的结合。结果筛选及ELISA结果示得到与肝癌细胞特异性结合并内化入肝癌细胞的噬菌体克隆，测序结果示56．67％的被检噬菌体展示相同的多肽序列FLLEPHLMDTSM，推测FLEP是肝癌细胞特异性结合肽的基序。免疫荧光共聚焦成像进一步确定展示序列FLLEPHLMDTSM的噬菌体与肝癌细胞特异性结合并内化入细胞内。竞争抑制实验示WH16能有效抑制展示序列FLLEPHLMDTSM的噬菌体克隆与肝癌细胞的结合。结论利用噬菌体随机肽库获得能与肝癌细胞特异性结合的多肽序列FLLEPHLMDTSM，据此合成的十六肽WH16与肝癌细胞有亲和力。     

A型肉毒毒素多表位串联体的设计、表达、纯化及鉴定

目的:设计、表达两个A型肉毒毒素多表位串联体.方法:从文献报道的A型肉毒毒素(botulinum neurotoxin type A,BoNT/A)的表位及生物信息学方法预测得到的B细胞表位中遴选表位,并加入适当的辅助性元件,设计多表位串联体A、B.对其基因进行优化后,经重叠PCR方法合成串联体A、B的全长基因.分别插入原核表达载体pQE-30,再转化E.coli M15[pREP4]感受态细胞中进行诱导表达,以金属螯合亲和层析法纯化重组蛋白,并进行鉴定.结果与结论:成功设计并构建了两个多表位串联体A、B,并在E.coli中以包涵体形式获得高效表达.Ni-NTA法纯化后分别获得纯度大于92.2%、99%的重组串联体A、B蛋白,并经透析复性法复性.Western印迹和间接ELISA显示纯化、复性后的重组蛋白与抗天然BoNT/A马血清有特异性结合反应.