红霉素链霉菌遗传控制的研究 一 红霉素链霉菌无活性突变株回复突变株的筛选

利用亚硝基胍(NTG)对红霉素链霉菌(S.erythreus UV 80)活性菌株进行回复突变,获得了红霉素高产量变株。先以NTG(100μg/ml,1小时)处理母株,得无活性变株,再经诱变,得到回复突变株,其活性提高8％。进一步用NTG(1000μg/ml,1小时)诱变处理,得到了比原菌株红霉素产量高25％的变株。诱变剂的最适剂量为产生90～94％死亡率的剂量。同时还观察到红霉素链霉菌变株的培养特征和生产能力之间有相关性。     

红霉素链霉菌1—25菌株的特性研究

红霉素链霉菌14-74经一系列诱变筛选得到1-25菌株。本文报道1-25菌株培养特性,在摇瓶及生产罐中1-25菌株的生产能力比对照14-74菌株提高7％以上。发酵液中红霉素C的含量等于或小于对照菌株。高产的遗传性能稳定,对红霉素及丙醇的耐受力明显高于亲株,是一株优于14-74菌株的高产优质的抗反馈及抗阻遏的突变菌株。     

红霉素高产菌株的选育

以红霉素链霉菌0－11－26为出发菌株，经LiCl和紫外线复合诱变处理，再用含有4种不同结构类似物的培养基定向筛选，获得4株突变株，其中M－03－59摇瓶效价6876u/ml，比起始菌株（5328u/ml）提高29.1%，在10t发酵罐上连续6批验证，平均发酵效价7016u/ml，比原生产水平（5652u/ml）提高24.1%，并且质检全部合格，对生产实际具有重要意义。     

链霉菌702抗药性致死突变标志微波诱变筛选研究

目的 筛选出产抗真菌活性物质的高产链霉菌702突变株.方法 分别以链霉菌702菌株为试验材料和以庆大霉素为敏感抗生素建立链霉菌702孢子致死突变标志的微波诱变筛选模型,通过微波对链霉菌702菌株孢子进行不同时间的诱变处理,将诱变处理后的孢予悬液涂布于含致死浓度的庆大霉素的PDA平板培养基上,获得抗庆大霉素突变株,分别挑取单个抗药性突变菌株进行摇瓶初筛和复筛.生物效价测定采用一剂量法.结果 微波处理30s对菌株的致死率可达70.53%,抗药性突变率高达23.13%,获得的抗药性突变株经过摇瓶初筛和复筛,获得高产突变株20-29-47菌株,产抗真菌活件物质的摇瓶发酵单位达到1478μg/ml,比出发菌株发酵单位986μg/ml提高T49.9%.结论 采用抗药性致死突变标志的微波诱变筛选模型可以获得产抗真菌活性物质的链霉菌702高产菌株.     

红霉素链霉菌抗噬菌体菌株的选育

以红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus)Dm65为出发菌株,经紫外线诱变处理,采用不接触噬菌体的影印方法,筛选到1株抗11种噬菌体的高产菌株。通过噬菌体的侵染试验和摇瓶发酵试验证明:其对11种噬菌体的抗性十分稳定;红霉素的发酵效价比对照菌株提高44％。该菌株在红霉素生产中投入使用后,有效地控制了噬菌体的污染。     

红霉素链霉菌抗噬菌体菌株的选育

目的筛选红霉素链霉菌抗噬菌体菌株.方法以红霉素链霉菌B-27#为出发菌株,采用经过紫外诱变过的孢子悬浮液与噬菌体接触的方法进行处理.结果筛选到一株抗噬菌体高产菌株.通过噬菌体的侵染试验和摇瓶发酵生产能力验证,其抗噬菌体能力十分稳定,红霉素发酵摇瓶效价比对照有所提高.该菌株经纯化后投入生产,有效地控制和预防了噬菌体的污染.结论采用经过紫外诱变过的孢子悬浮液与噬菌体接触的方法进行处理,可以有效的获得抗噬菌体菌株.在试验中我们还发现,在紫外灯(253.7 nm、15 W、30 cm)下照射120 s,菌株出现抗噬菌体突变的几率最高.     

红霉素链霉菌抗噬菌体菌株的选育

目的筛选红霉素链霉菌抗噬菌体菌株。方法以红霉素链霉菌B-27#为出发菌株,采用经过紫外诱变过的孢子悬浮液与噬菌体接触的方法进行处理。结果筛选到一株抗噬菌体高产菌株。通过噬菌体的侵染试验和摇瓶发酵生产能力验证,其抗噬菌体能力十分稳定,红霉素发酵摇瓶效价比对照有所提高。该菌株经纯化后投入生产,有效地控制和预防了噬菌体的污染。结论采用经过紫外诱变过的孢子悬浮液与噬菌体接触的方法进行处理,可以有效的获得抗噬菌体菌株。在试验中我们还发现,在紫外灯(253.7 nm、15 W、30 cm)下照射120 s,菌株出现抗噬菌体突变的几率最高。     

卡那霉素链霉菌耐高浓度自身代谢产物的高产菌株的选育

原始的卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)菌株只能耐受100～500μg/ml浓度的自身代谢产物——卡那霉素。用1～10万伦琴的γ射线照射其孢子悬液后,在含卡那霉素的平板上,能筛选到耐2000～20000μg/ml高浓度的菌株,最高的可达6万μg/ml。经摇瓶发酵后发现,正变株出现在杀菌率较低的剂量(1～5万伦琴)范围内。从经1万仑琴γ射线照射后的33株耐高浓度卡那霉素菌株中,发现其卡那霉素的摇瓶产量提高了6～33％。其中产量最高的两株是78-5-49和78-5-52,它们的发酵单位比原始菌株分别提高33.3和28.3％,且这两株菌株都是在10000μg/ml卡那霉素平板中找到的。 上述两菌株在大罐生产条件下,试用了与原始菌株相同的发酵条件,未发现有明显的增产效果。 作者认为,这类耐高浓度自身代谢产物的高产菌株,可能是抗反馈抑制或抗阻遏型突变株。     

红霉素高产菌株的筛选

以红霉素生产菌株HD07-30为出发菌株.采用紫外线(UV)、硫酸二乙酯(DES)进行双重复合诱变选育筛选耐红霉素的高产菌株,获得红霉素抗性突变菌株,生物效价比出发菌株提高27%.     

以脂肪酶活为指标快速筛选红霉素摇瓶发酵培养基

筛选红霉素链霉菌的摇瓶培养基需要将红霉素链霉菌在摇瓶中培养 6 d,然后测定红霉素链霉菌的效价 ,使用该方法需要至少 6 d的时间。而测定红霉素链霉菌在摇瓶中 d1脂肪酶的活力 ,并与对照样品比较 ,则只使用 1d的时间就能够推测红霉素链霉菌在 6 d后的效价 ,使用这一新方法 ,我们快速筛选出红霉素链霉菌 d1的酶活力比对照培养基高的两组新培养基 ,并且确认了新培养基中 6 d后的最高效价为 9313μg/ ml,比对照培养基提高了 78.38%。     

Mutagenesis of the rapamycin producer Streptomyces hygroscopicus FC904

Rapamycin (RPM) is produced by Streptomyces hygroscopicus FC904 isolated from soil in Fuzhou, China. It is a triene macrolide antibiotic with potential application as an immunosuppressant and drug for human gene therapy. In an attempt to improve rapamycin production, mutation and screening of the parent culture have been carried out. Thousands of survivors were obtained after mutagenesis by NTG (3 mg/ml) and UV (30 W, 15 cm, 30 seconds) of spore suspensions. None showed improved production of RPM. We determined the susceptibility to antibiotics of S. hygroscopicus FC904 by two fold dilutions of antibiotics in oatmeal agar plates. It was found that the strain was resistant to penicillin, erythromycin, RPM, tetracycline and chloramphenicol, but susceptible to mitomycin C (MIC, 10 microg/ml) and aminoglycosides such as gentamicin (MIC, 0.1 microg/ml), kanamycin (MIC, 0.1 microg/ml) and streptomycin (MIC, 0.3 microg/ml). Protoplasts of strain FC904 were prepared after finding the best conditions for their formation. They were treated with gentamicin, erythromycin, mitomycin C and NTG. Surprisingly, gentamicin was especially effective for obtaining higher RPM-producing mutants. Mutant C14 was selected by exposing the protoplasts of the parent strain FC904 to 1 microg/ml of gentamicin at 28 degrees C for 2 hours. A higher RPM-producing mutant (C14-1) was obtained from the protoplasts of mutant C14 treated with gentamicin, and its titer was 60% higher than that of the parent strain FC904 by HPLC analysis. Another improved mutant (C14-2) was obtained from the spores of mutant C 14 treated with 1 microg/ml of gentamicin plus 2 mg/ml of NTG at 28 degrees C for 2 hours. Mutant C14-2 had a titer 124% higher than FC904. The possible mechanism for the effect of gentamicin by using protoplasts or spore suspensions will be discussed, i.e. the possibility of gentamicin being a mutagen or a selective agent.     

由DL-5-苯乙内酰脲酶法生产D-苯甘氨酸的菌种选育

本实验以假单孢菌Pseudomonas SP.27为出发菌株由DL-5-苯乙内酰脲发酵生产D-苯甘氨酸。野生菌产量为15.85μg/ml.首先对其进行紫外诱变处理1min,筛选出菌株Q_6,其产量为256.7μg/ml.然后用Q-6制备球形体,进行亚硝基胍诱变处理60min,得到Q_(68)菌株,其产量为453.4μg/ml.     

L-苏氨酸产生菌选育的研究

用亚硝基胍(NTG)和紫外线(UV)诱变处理出发菌株T_(6-13),定向筛选α-氨基β-羟基戊酸(AHV)和S-(2-氯基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)抗性突变株和蛋氨酸缺陷型,得一苏氨酸产生菌M_(8-31)(AHV~rAEC~rMet~-),可积累L-苏氨酸6.7mg/ml。再以M_(8-31)为出发菌株,进一步提高抗性和筛选α-氨基-4-乙硫丁酸(Eth)敏感突变株,获得一苏氨酸高产菌株ME7(AHV~rAEC~rMet~-Eth~s),在含有葡萄糖10%的培养基中发酵48h可积累L-苏氨酸17.5mg/ml。     

Effect of sterilized human fecal extract on the sensitivity of Escherichia coli ATCC 25922 to enrofloxacin

The ingestion of antimicrobial residues in foods of animal origin has the potential risk of exposing colonic bacteria to small concentrations of antibiotics and inducing resistance in the colonic bacteria. To investigate whether human intestinal contents would influence resistance development in bacteria, Escherichia coli ATCC 25922 (MIC of enrofloxacin <0.03?μg?ml(-1)) was exposed to 0.01 to 1?μg?ml(-1) of enrofloxacin in media supplemented with glucose, sucrose, sodium acetate or sterilized human fecal extract. In the first passage, only the medium containing sterilized fecal extract supported the growth of E. coli at an enrofloxacin concentration equal to the MIC. In the second and third passages following exposure to sub-inhibitory concentrations of the drug, the bacteria in media containing sterilized fecal extract grew at 0.1?μg?ml(-1) of enrofloxacin. The efflux pump inhibitors, reserpine and carbonyl cyanide-m-chlorophenylhydrazone (CCCP), increased the sensitivity of bacteria to 0.1?μg?ml(-1) of enrofloxacin in the medium containing sucrose, but their effect was not observed in the medium supplemented with 2.5% sterilized fecal extract. The proportions of unsaturated and saturated fatty acids in E. coli grown in the medium with 2.5% sterilized fecal extract differed from those grown in the medium alone. Fecal extract may contain unknown factors that augment the ability of E. coli to grow in concentrations of enrofloxacin higher than MIC, both in the presence and absence of efflux pump inhibitors. This is the first study showing that fecal extract affects the level of sensitivity of E. coli to antimicrobial agents.     

应用CLSI新的折点值标准判读儿童分离的肺炎链球菌非脑膜炎株的耐药性

目的应用美国临床和实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)新的折点值标准,比较2001—2002年和2008年儿童分离的肺炎链球菌非脑膜炎株对青霉素及其它抗生素的耐药情况。方法肺炎链球菌的药物敏感试验采用Kirby-Bauer法,青霉素最低抑菌浓度检测采用E-test法,药敏结果参照2010年CLSI M100-S20版指南判读;组间率的比较采用χ2检验。结果 2008年度83.7%的菌株对青霉素敏感,15.1%中介,1.2%耐药,青霉素MIC50和MIC90分别为1.0μg/mL和3.0μg/mL;2001～2002年97.5%的菌株对青霉素敏感,2.5%中介,无耐药株,青霉素MIC50为0.064μg/mL,MIC90为1.5μg/mL,两者耐药率有显著性差异(χ2=23.48,P<0.05)。所有菌株对万古霉素敏感。菌株对红霉素的耐药率最高,在两个时期分别达92.2%和91.4%。结论本地区2008年度分离的肺炎链球菌对青霉素的敏感率较2001～2002年明显下降,但总体敏感率仍维持在较高水平,青霉素仍可作为治疗该菌颅外感染的一线有效药物。     

高效液相色谱法测定人血中普鲁卡因酰胺及其代谢产物N-乙酰普鲁卡因酰胺

本文用高效液相色谱法测定人血中普鲁卡因酰胺(PA)及其代谢产物N-乙酰普鲁卡因酰胺(NAPA)。以正丙醇—氯仿(1:9)提取血清样品,蒸干,残渣用流动相溶解;色谱分析条件:NOVA-PAK 5μm ODS柱,醋酸(40 ml)—醋酸钠(4g)—水(1000ml)—乙腈(100ml)为流动相;定量分析以普鲁卡因为内标,样品的比率色谱图表明分离良好,PA和NAPA的线性测定范围分别为0.5～12.0μg/ml和0.5～6.0μg/ml,相关系数均优于0.99,平均回收率分别为99.4%和100.5%,平均变异系数分别为4.16%和4.36%。方法适用于血清样品分析和治疗药物监测,对病人血样的测定结果表明方法不受干扰。     

螺旋霉素产生菌螺旋霉素链霉菌遗传育种

本文是利用抗生素抗性与产量之间的相关性来进行螺旋霉素产生菌螺旋霉素链霉菌的遗传育种,旨在获得高效价菌株,从而提高螺旋霉素的生产水平。首先用正交试验法确定出发菌株最佳发酵培养基,并在此基础上通过紫外线诱变,和在螺旋霉素浓度梯度平板上筛选螺旋霉素抗性菌株。按上述方法理性化筛选得到的菌株多为正突变株。从本实验得到一株螺旋霉素抗性菌株SPM~r-248,其抗性较出发菌株提高300％,生产能力较出发菌株提高81.3％。菌株SPM~r-248的高效价生产性能遗传特性稳定。在7m~3罐做发酵放大,与出发菌株相比,发酵效价提高31.4％,发酵指数提高18.8％,具有一定的学术意义和经济价值。     

产腺苷蛋氨酸酵母菌株的选育

目的筛选产腺苷蛋氨酸(SAM)的酵母菌并进行诱变育种。方法以选择性培养基筛选酵母菌株并用高效液相色谱检测SAM。利用紫外线和γ-射线处理对菌株进行诱变。结果从34份土样中筛选到1株产SAM的酵母菌Q95菌株,经过5轮紫外线诱变和1轮γ-射线诱变,筛选到1株SAM产量显著提高的正突变株Q6-13。摇瓶发酵27 h后,其SAM产量达到1860μg/mL,与Q95相比提高了86.9%。在15 L外循环气升式生物反应器中补料发酵22 h后,Q6-13的SAM产量达到2540μg/mL。结论通过筛选和诱变,得到了1株高产SAM的酵母菌突变株,为SAM的微生物发酵法规模化生产奠定了基础。