LeftyA真核表达载体的构建及其对转化生长因子-β1诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 构建pcDNA3.1-LeftyA真核表达载体,观察其对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化(EMT)的影响.方法 基因克隆技术构建pcDNA3.1-LeftyA真核表达载体,将其瞬时转染HK-2细胞,TGF-β1(10μg/L)刺激后,观察细胞形态变化,检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因及蛋白的表达.结果 TGF-β1刺激后HK-2细胞内E-cadherin mRNA和蛋白时间依赖性表达下调,α-SMA mRNA和蛋白时间依赖性表达上调,同时E-cadherin表达变化早于α-SMA;LeftyA蛋白可以显著抑制E-cadherin蛋白的下调表达(P＜0.05),其表达比同时间点单纯刺激组高17.6%;同时可逆转α-SMA蛋白的上调表达(P＜0.05),其蛋白表达比单纯刺激组低14.0%.结论 LeftyA蛋白可以抑制TGF-β1所致的EMT.

Abstract：

Objective To construct the eukaryotic expression vector for LeftyA and study the effects of LeftyA on epithelial to mesenchymal transition of human proximal tubular epithelial cells induced by transforming growth factor-β1 ( TGF-β1 ). Methods The pcDNA3. 1-LeftyA was constructed by recombinant DNA technique. After transfection with pcDNA3. 1-LeftyA HK-2 cells were stimulated by TGF-β1( 10 μg/L). The morphological changes, and the expression of E-cadherin, α-SMA and LeftyA mRNA and protein were observed and detected, respectively. Results TGF-β1 could markedly decrease the expression of E-cadherin mRNA and protein in HK-2 cells induced, and dramatically increase the expression of α-SMA mRNA and protein in a time-dependent manner. Forced expression of exogenous LeftyA led to a blockage of TGF-β1 -induced E-cadherin ( 17.6% ) suppression and α-SMA induction ( 14. 0% ). Conclusion Disruption of cell adherence is the beginning stage of EMT, and overexpression of LeftyA can suppress EMT induced by TGF-β1, which suggests a alprostadil role for LeftyA in TGF-β1-induced tubular EMT and renal fibrosis.     

Numb基因在大鼠肾小管上皮细胞转分化过程中的作用

目的 探讨Numb在大鼠肾小管上皮细胞转分化过程中的作用。 方法 重组人转化生长因子β1（TGF-β1）刺激大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E细胞),不同浓度TGF-β1 （0、1、5、10、15、20 μg/L）作用48 h与TGF-β1 10 μg/L作用不同时间(0、24、48、72 h)后,采用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光染色分别检测NRK52E细胞内E钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Numb 的表达。采用RNA干扰技术下调Numb表达,Western印迹观察改变Numb水平对E-cadherin、α-SMA蛋白水平的影响。 结果 TGF-β1以剂量及时间依赖的方式诱导NRK52E细胞E-cadherin 蛋白表达下调,α-SMA 蛋白表达增高。Numb蛋白的表达随TGF-β1浓度的增加而增高,在5、10、15和20 μg/L时分别为0 μg/L时的1.33倍（P = 0.024)、1.39倍（P = 0.035）、1.45倍（P = 0.025）和1.51倍（P = 0.000)。而Numb蛋白和mRNA的表达亦随TGF-β1作用时间的延长而增高,作用24 h、48 h、72 h,Numb蛋白分别为0 h的1.48倍（P = 0.046)、1.54倍（P = 0.011）、1.79倍（P = 0.028）,Numb mRNA分别为0 h的1.56倍（P = 0.012)、1.82倍（P = 0.008）、1.82倍（P = 0.002）;同时Numb的分布也发生了改变,大量聚集在胞质中。下调Numb表达可以显著抑制TGF-β1诱导的α-SMA表达上调（为Numb表达正常时的18.1%,P = 0.004）、E-cadherin表达下调（为Numb表达正常时的2.19倍,P = 0.004）。 结论 Numb可以促进肾小管上皮细胞发生转分化。     

虫草多糖对转化生长因子β1诱导人近端肾小管上皮细胞间充质转分化的影响

目的 探讨虫草多糖（Cp）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导人近端肾小管上皮细胞间充质转分化的影响。 方法 用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测不同浓度的Cp(0、0.01、0.1、1、5、10 g/L)对人近端肾小管上皮细胞(HK-2) 增殖的作用。用不同浓度的 TGF-β1（0、0.1、0.5、1、5、10 μg/L）作用HK-2细胞48 h及5 μg/L的TGF-β1作用不同时间（0、12、24、48和72 ｈ），以实时定量PCR和Western印迹方法检测α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、钙黏蛋白（E-cadherin）、纤连蛋白（FN）的表达。用递增浓度的Cp(1、5、10 g/L)预处理HK-2细胞24 h后，观察其对TGF-β1效应的干预作用。 结果 Cp以剂量依赖方式促进HK-2细胞增殖（P < 0.05）。TGF-β1无论在转录水平还是蛋白水平皆能诱导HK-2细胞 α-SMA、FN表达上调，而下调E-cadherin表达。分别用1、5、10 g/L Cp预干预24 h后，同单独5 μg/L TGF-β1刺激组相比，上述因子表达被不同程度逆转。在转录水平，α-SMA mRNA表达被抑制率分别为37.98%、68.08%、84.36%；FN mRNA表达被抑制率分别为46.97%、63.82%、81.85%；E-cadherin mRNA表达分别增加0.67倍、2.69倍、5.43倍（均P < 0.05）。在蛋白水平，α-SMA蛋白表达被抑制率分别为33.40%、47.75%、68.50%；FN蛋白表达抑制率分别为16.26%、65.92%、80.30%；E-cadherin蛋白表达分别增加1.33倍、3.19倍、4.29倍（均P < 0.05）。Cp能明显拮抗 TGF-β1 诱导的HK-2细胞的表型改变。 结论 Cp能有效阻止TGF-β1诱导的人近端肾小管上皮细胞发生转分化。     

黏着斑激酶在转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的 观察转化生长因子（TGF）β1诱导的正常人近端肾小管上皮细胞（HK-2）转分化（EMT）过程中黏着斑激酶（FAK）的表达及下调FAK的表达后对TGF-β1诱导的HK-2细胞转分化进程的影响。 方法 应用TGF-β1（10 μg/L）刺激HK-2细胞,采用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光方法分别检测E钙黏蛋白（E-cadherin）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、FAK mRNA和蛋白的表达及磷酸化（p）-FAK（Tyr397）的蛋白表达。应用Lipofectmine2000将FAK siRNA转染HK-2细胞,采用Western印迹观察下调表达FAK对上述指标的影响。 结果 TGF-β1刺激后,HK-2细胞α-SMA蛋白和mRNA水平上调,E-cadherin蛋白和mRNA表达下调。FAK蛋白和mRNA随时间的延长表达逐渐增多,48 h达到高峰。p-FAK（Tyr397）蛋白表达趋势与FAK相同。脂质体转染siRNA后FAK的mRNA和蛋白分别下调了50%和41%,下调表达FAK后可以显著抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞α-SMA蛋白的上调表达,逆转 E-cadherin蛋白的下调表达。 结论 在TGF-β1诱导的HK-2细胞转分化进程FAK蛋白表达上调,敲低FAK蛋白表达后可以部分减轻EMT的程度,提示FAK在TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和肾脏纤维化中发挥一定的作用。     

NADPH氧化酶在转化生长因子β1诱导大鼠肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的探讨NADPH氧化酶在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）转分化中的作用。方法用TGF-β1（10μg/L）刺激NRK-52E细胞不同时间,观察α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI- 1）及Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）的表达。部分实验中细胞在TGF-β1刺激前用NADPH氧化酶抑制剂DPI预处理1 h。用激光共聚焦显微镜观察细胞内活性氧（ROS）的产生。用RT-PCR方法检测NADPH氧化酶p22phox、gp91phox、p47phox和p67phox亚单位mRNA的表达。α-SMA、E-cadherin、PAI-1及Col-ⅠmRNA及蛋白的表达分别采用RT-PCR、Western印迹和细胞免疫化学检测。结果TGF-β1可显著上调NADPH氧化酶p67phox亚单位mRNA的表达,8 h及24 h时分别为对照组的2.43倍及3.59倍（P〈0.01）。TGF-β1可显著促进细胞ROS的产生,5 min时已是对照组的2.5倍（P〈0.05）。DPI预处理同时可显著逆转TGF-β1诱导NRK-52E细胞ROS的产生（P〈0.05）、α-SMA的表达上调、E-cadherin的表达下调以及PAI-1和Col-Ⅰ的表达上调。结论TGF-β1可促进NRK-52E细胞增加ROS的产生。ROS介导了TGF-β1诱导NRK-52E细胞的转分化,促进肾脏纤维化。     

Erbin在肾间质纤维化中的表达和作用

目的 探讨Erbin在肾脏间质纤维化中表达量的变化及上调Erbin对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E）转分化的影响。 方法 体内实验采用SD大鼠5/6肾切除法建立肾纤维化动物模型,收集并检测各组血清中Scr、BUN水平;Masson染色观察肾间质纤维化程度;免疫组化及Western印迹检测Erbin的分布与表达。 体外实验采用TGF-β1（10 μg/L）刺激NRK52E细胞72 h建立上皮细胞-间充质转分化（EMT）细胞模型;免疫荧光及Western印迹法检测E钙黏蛋白（E-cadherin）和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达变化;RT-PCR及Western 印迹法检测Erbin的表达变化。用脂质体2000将质粒 Prk5-myc-Erbin瞬时转染至NRK52E细胞,Western印迹法观察上调Erbin表达后对上述各种指标的影响。 结果 （1）假手术组大鼠肾功能正常[Scr（33.96±7.28） μmol/L、BUN（8.11±2.55） mmol/L],Masson染色未见肾间质纤维化,Erbin在肾小管表达较少;模型组大鼠Scr [（140.52±61.11） μmol/L]、BUN[（34.23±7.66） mmol/L] 均显著高于假手术组（均P < 0.05）,肾间质可见明显纤维化,Erbin 在肾小管表达也明显增加,是假手术组的2.9倍（P < 0.01）。（2）正常NRK52E 细胞表达E-cadherin,少量表达Erbin和α-SMA。TGF-β1刺激后,NRK52E细胞E-cadherin表达显著减少,Erbin和α-SMA则表达增加（均P < 0.05）;而转染质粒Prk5-myc-Erbin可逆转TGF-β1诱导的NRK52E细胞E-cadherin表达下调,并可抑制α-SMA表达上调（均P < 0.05）。 结论 Erbin在肾间质纤维化中表达增加,上调Erbin表达可抑制TGF-β1诱导NRK52E发生EMT, 提示Erbin在肾脏纤维化中可发挥保护作用。     

核因子κB反义寡核苷酸对转化生长因子β1诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 探讨在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导下，核因子κB（NF-κB）反义寡核苷酸对体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2）转分化的影响。 方法 采用脂质体介导的方法将NF-κB反义寡核苷酸（AS-ODN）导入细胞，以TGF-β1（10 μg/L）刺激HK-2细胞24 h后，用RT-PCR方法检测细胞中NF-κB mRNA及α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA表达，用荧光光谱法分析α-SMA蛋白的表达，并以倒置相差显微镜观察细胞转分化过程的形态变化。 结果 TGF-β1诱导24 h后，HK-2细胞中NF-κB mRNA的表达显著上调，为空白对照组的8倍以上（P < 0.01）。NF-κB反义寡核苷酸导入细胞后，可显著抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞的 NF-κB mRNA表达，比TGF-β1组减少75％（P < 0.05），同时，α-SMA mRNA和蛋白表达亦较TGF-β1组均明显下调（P < 0.05）。 结论 NF-κB反义寡核苷酸可抑制TGF-β1诱导肾小管上皮细胞NF-κB的表达，抑制肾小管上皮细胞转分化，可能有利于肾间质纤维化的防治。     

灯盏花素治疗糖尿病大鼠血清对近端小管上皮细胞钠钾ATP酶活性的影响

目的：观察灯盏花素（Bre）治疗糖尿病大鼠血清对近端小管上皮细胞（PTEC）钠钾ATP酶活性的影响.方法：实验分为模型组（DM组）、灯盏花素治疗组（BR组）和正常对照组（NC组）.前两组以链脲佐菌素（STZ,65 mg/kg）腹腔注射建立糖尿病大鼠模型.BR组在模型建立成功后连续4周予腹腔注射灯盏花素20 mg·kg-1·d-1,NC组和DM组则在相同的时间腹腔注射同体积的溶酶.4周后分别取大鼠血清培养PTEC,作用72 h.检测血糖及血、尿的肌酐水平,放免法测定尿微量白蛋白、尿β2-微球蛋白（β2-MG）.液闪法测定PTEC钠钾ATP酶活性.结果：DM组显著高于NC组[（3 799.89±440.40） vs （2 221.52±459.89） pmol·mg-1·h-1,P〈0.05];BR组与DM组比较明显降低[（2 193.56±552.57） vs （3 799.89±440.40） pmol·mg-1·h-1,P〈0.05],与NC组比较无明显差异.BR组的血糖水平明显高于NC组,而与DM组差异无统计学意义,除此之外,其尿量、尿β2-MG、尿白蛋白排泄率（UAER）和肌酐清除率（Ccr）都与DM组有相同性质的变化,但变化幅度都小于DM组（P〈0.05）.结论：灯盏花素治疗糖尿病大鼠血清对PTEC钠钾ATP酶活性的升高有明显的抑制作用;其对DN的防治作用可能部分通过抑制PTEC钠钾ATP酶活性实现.     

CIP4对转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化的影响

目的 观察骨架调节蛋白CIP4（Cdc42 interacting protein 4）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化（EMT）的影响,并探讨其产生的机制。 方法 10 ?滋g/L TGF-β1刺激72 h诱导人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）向间充质转分化。Western印迹法检测各组细胞内E-cadherin和α-SMA蛋白的表达。倒置显微镜观察细胞形态的变化。根据GenBank人CIP4的完全cDNA序列,设计1条特异性干扰CIP4表达的RNA片段（CIP4-siRNA）和含野生型CIP4的重组真核表达质粒（pcDNA3.1-hCIP4）,利用lipofactamine 2000将其转染HK-2细胞。Western 印迹法检测对照组、TGF-β1刺激组、CIP4-siRNA转染组、pcDNA3.1-CIP4转染组细胞内CIP4、E-cadherin和α-SMA蛋白的表达,共聚焦显微镜观察 E-cadherin和α-SMA蛋白的分布改变;用PI3K-Akt特异性抑制剂渥曼青霉素（wortmannin） 1 μmol/L干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,Western 印迹法检测对照组和干预组CIP4表达的变化。 结果 TGF-β1干预后HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,细胞形态由典型的上皮细胞向肌成纤维细胞转变,表明TGF-β1诱导肾小管上皮细胞EMT模型成功。CIP4-siRNA抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞表达CIP4后,E-cadherin蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,部分逆转了上述TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT。pcDNA3.1-hCIP4转染使CIP4高表达后,HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,诱导了肾小管上皮细胞EMT。用渥曼青霉素干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,CIP4可能蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）。 结论 TGF-β1通过PI3K-Akt途径上调CIP4表达,CIP4可能进一步参与TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT过程。     

蛋白激酶C在高糖诱导近端小管上皮细胞细胞外基质及转化生长因子β1高表达中的作用

目的：探讨高糖作用下近端肾小管上皮细胞蛋白激酶C（PKC）活性的变化,以及PKC 激活对近端肾小管上皮细胞外细胞基质（ECM）及转化生长因子β1(TGF-β1）表达的调控作用。方法：采用LLC－PK1细胞株,将细胞分为正常对照组NG(5.5mmol/L D－葡萄糖）、高糖组HG（25mmol/L D-葡萄糖）、高渗组HM（25mmol/L甘露醇）、NG＋PKC抑制剂（PKCI）组（10μmol/L chelerythrine chloride)、HG＋PKCI组、HM＋PKCI组。分别检测各组细胞PKC活性,并运用原位杂交和免疫细胞化学法检测各组Ⅳ胶原（Co1Ⅳ）、纤连蛋白（FN）及TGF-β1mRNA和蛋白表达。结果：HG组细胞胞膜PKC活性较NG组升高3．3倍。HG组细胞Co1Ⅳ、FN及TGF－β1mRNA和蛋白水平均较NG组显著升高,HM组无此变化。高糖导致的ECM和TGF－β1高表达可被PKC抑制剂chelerythrine chloride所阻断。结论：由高糖诱导的近端小管上皮细胞ECM和TGF－β1高表达是通过激活PKC通路所介导。     

氟伐他汀对晚期糖基化终产物诱导的人近端肾小管上皮细胞转分化的影响

目的：研究氟伐他汀对晚期糖基化终产物（AGE）诱导的人近端肾小管上皮细胞（HK-2）转分化的影响及核因子（NF）-κB在其中所起的作用。方法：将培养细胞分为5组：（1）BAS组;（2）AGE-BAS组;（3）AGE-BAS＋NF-κB特异性阻断剂（PDTC）组;（4）AGE-BAS＋氟伐他汀组;（5）AGE-BAS＋氟伐他汀＋PDTC组。应用EMSA法测定NF-κB活性变化。Westernblot法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E-钙黏着糖蛋白（E-cadherin）表达。结果：氟伐他汀在一定浓度范围内,呈剂量依赖性抑制AGE-BSA诱导的HK-2细胞NF-κB活化。AGE-BSA刺激后随浓度增加,时间延长,α-SMA蛋白表达明显升高、E-adherin蛋白表达明显降低。NF-κB特异性阻断剂PDTC及氟伐他汀均能部分阻断AGE-BSA诱导的α-SMA蛋白表达升高及E-adherin蛋白表达降低。氟伐他汀＋PDTC进一步抑制AGE-BSA诱导的α-SMA蛋白表达升高及E-adherin蛋白表达降低。结论：NF-κB参与了AGE-BSA诱导的HK-2细胞转分化。氟伐他汀抑制HK-2细胞转分化除通过抑制NF-κB活化,可能还有其他机制。     

Epithelial to Mesenchymal Transition During Late Deterioration of Human Kidney Transplants: The Role of Tubular Cells in Fibrogenesis

The hallmark of failing renal transplants is tubular atrophy and interstitial fibrosis (TA/IF). Injury to tubular epithelial cells (TEC) could contribute to fibrogenesis via epithelial-mesenchymal transition (EMT). We examined the features of EMT in renal transplants that developed TA/IF. Biopsies from 10 allograft kidneys with impaired function and TA/IF and 10 biopsies from transplants with stable function were compared to their implantation biopsies. Relative to implantation biopsies, TEC in TA/IF kidneys showed loss of epithelial markers (E-cadherin, cytokeratin) with altered distribution. Some TEC also showed new cytoplasmic expression of mesenchymal markers vimentin, S100A4, and alpha smooth muscle actin (alpha-SMA) and collagen synthesis marker heat shock protein (HSP-47), both in deteriorating and atrophic tubules. Double immunostaining showed coexpression of cytokeratin and vimentin, S100A4 and HSP-47, indicating intermediate stages of EMT in TA/IF. These changes were absent or much less in transplants with stable function. EMT features in the TA/IF group correlated with serum creatinine (vimentin, S100A4, HSP-47), history of T-cell-mediated rejection (cytokeratin, S100A4) and proteinuria (cytokeratin). These findings support a model in which the TEC damage induces loss of epithelial features and expression of fibroblast features, as a common pathway of deterioration by either immunologic or nonimmunologic processes.     

Antifibrotic Effects of Pirfenidone in Rat Proximal Tubular Epithelial Cells

Objective: Renal fibrosis is a common cause of renal dysfunction with chronic kidney disease. We previously investigated the renoprotective effects of the antifibrotic agent pirfenidone in a rat model of subtotal nephrectomy. Here, we further evaluated the antifibrotic effects of pirfenidone in rat proximal tubular epithelial cells. Methods: NRK52E cells were incubated in a medium containing either transforming growth factor (TGF)-β1 (3 ng/mL) or platelet-derived growth factor (PDGF)-BB (5 Ang/mL) or both, with or without pirfenidone (0.1–1 mmol/L), for 24 h to assess mRNA expression, for 48 h to assess protein production, and for 1 h or various time (5–120 min) to assess phosphorylation of signal kinase. Results: TGF-β1, a key mediator in renal fibrosis, induced increases in the mRNA expression of various profibrotic factors and extracellular matrix, including plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1), fibronectin, type 1 collagen, and connective tissue growth factor (CTGF)—increases which pirfenidone significantly inhibited. Specifically, pirfenidone potently inhibited TGF-β1-induced increases in the mRNA expression and protein secretion of PAI-1, an effect mediated, at least in part, via the mitogen-activated protein kinase kinase (MEK)/extracellular signal-regulated kinase (ERK) signaling. Further, PDGF-BB, which has been implicated in renal interstitial fibrosis, potently activated PAI-1 expression under TGF-β1 stimulation, and pirfenidone significantly inhibited TGF-β1- and PDGF-BB-induced increases in PAI-1 expression. Conclusions: Taken together, these results suggest that TGF-β1 closely correlates with renal fibrosis in cooperation with several fibrosis-promoting molecules, such as PAI-1 and PDGF, in rat proximal tubular epithelial cells, and pirfenidone inhibits TGF-β1-induced fibrosis cascade and will therefore likely exert antifibrotic effects under pathological conditions.     

松弛素对高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化及分泌细胞外基质的影响

目的:观察人松弛素(Relaxin)对高糖培养人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化、分泌细胞外基质的影响。方法:实验分组:正常糖组:含5.5 mmol/L葡萄糖;高糖组:含30 mmol/L葡萄糖;高渗组(甘露醇组);高糖+松弛素干预组;ELISA法检测细胞上清中TGF-β1、细胞胶原(ColⅠ)、纤连蛋白(FN)的表达。免疫印迹技术(Western blot)检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达,确定肾小管上皮细胞表型转化情况。结果:与正常糖组相比,高糖组肾小管上皮细胞分泌ColⅠ、FN、TGF-β1显著增加,在高糖培养基中加入人松弛素干预后可显著抑制由高糖诱导的ColⅠ、FN、TGF-β1的高表达,降低α-SMA表达,抑制肾小管上皮细胞转分化。结论:松弛素能抑制高糖诱导HK-2细胞分泌细胞外基质,抑制HK-2细胞转分化,具有抗纤维化作用。     

雷公藤内酯醇对TNF-α诱导人PTEC补体C3的影响

目的:观察雷公藤内酯醇对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导上调的人近端肾小管上皮细胞(PTEC)补体C3表达的影响.方法:首先观察PTEC在基础状态时补体C3 mRNA表达和C3蛋白合成状况, 然后采用TNF-α对PTEC进行诱导培养.在找到TNF-α发挥最佳上调补体C3表达的浓度和时间交叉点后,加入剂量递增但作用时间相同,或同一剂量但作用时间递增的雷公藤内酯醇,以及剂量递增的CsA或FK506.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测C3 mRNA,采用酶联免疫法(ELISA)检测C3蛋白;并计算50%抑制浓度(IC50)以比较雷公藤内酯醇与CsA和FK506对C3作用的强度.结果:雷公藤内酯醇以剂量依赖方式和时间依赖方式完全抑制TNF-α诱导下的PTEC C3 mRNA表达和C3蛋白合成,其IC50分别只有4.53 ng/ml和3.99 ng/ml,而CsA和FK506即使在很大剂量也只有轻微的抑制作用,CsA的IC50为2 770 ng/ml和4 898 ng/ml,FK506为1 920 ng/ml和6 000 ng/ml.结论:(1)雷公藤内酯醇能明显抑制PTEC 在TNF-α诱导下的C3 mRNA表达和C3蛋白合成,这可能是其治疗肾病的重要免疫抑制机制之一;(2)雷公藤具有明显较CsA和FK506强的抑制PTEC C3表达的作用.     

人近端肾小管上皮细胞黏附分子CD146表达对细胞凋亡的影响

目的：探讨人近端肾小管上皮细胞（HK-2）黏附分子CD146表达与细胞凋亡的关系。方法：体外培养的HK-2N胞在不同浓度葡萄糖和不同浓度甘露醇刺激下分别作用24h、48h、72h，经流式细胞仪（FCM）检测各组HK-2细胞CD146的表达和凋亡率的变化。结果：正常糖浓度下HK2微弱表达CD146，且延长作用时间对表达无影响；随糖浓度升高，CD146表达上调，细胞凋亡率也增高，延长刺激时间可促进CD146表达和细胞凋亡（P〈0．05）；当糖浓度达到40mmol／L，刺激时间达到48h，CD,46表达显著升高（P〈0．05），HK-2细胞凋亡率也显著上升（P〈0．05）；甘露醇对HK-2细胞CD146表达和细胞凋亡的促进作用较葡萄糖的作用显著降低（P〈0．01）。结论：HK-2组成性表达CD146，高糖诱导CD146表达，甘露醇诱导作用较高糖弱；高糖诱导HK-2凋亡，其凋亡作用与CD146表达增高联系密切，提示黏附分子CD146对细胞生存有重要影响。     

肾康注射液拮抗马兜铃酸对人近端肾小管上皮细胞作用的研究

目的：探讨肾康注射液（SKI）能否拮抗马兜铃酸钠盐（AA-Na）诱发的人近端肾小管上皮细胞（HKC）的促纤维化效应。方法：AA-Na（10mg/L）加或不加SKI（8mg/ml）与HKC孵育,然后检测转化生长因子-β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）、金属蛋白酶组织抑制物-1（TIMP-1）及纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）的mRNA表达（孵育12h,RT-PCR方法检测）和蛋白质表达（孵育36h用免疫印迹法检测胞内CTGF,孵育24h用ELISA法检测上清中其他因子）。结果：AA-Na能显著上调HKC对TGF-β1、CTGF、TIMP-1、PAI-1的表达,与对照组比较,mRNA表达分别上调1.84,1.58,1.62,1.29倍,蛋白质表达分别上调1.12,1.63,1.42,1.29倍,P均〈0.05;加SKI后,上述因子的高表达均被显著抑制,与AA-Na组比较,mRNA表达的抑制率分别为41.6%,43.7%,43.8%及24.4%,蛋白质表达的抑制率分别为34.3%,43.3%,31.1%及21.9%,P均〈0.05。结论：AA-Na能刺激HKC显著上调促细胞外基质（ECM）合成因子（TGF-β1、CT-GF）及抗ECM降解因子（TIMP-1、PAI-1）的mRNA及蛋白质表达,而SKI能拮抗AA-Na的上述作用。     

慢性肾衰竭大鼠血清对P-gp和MRP2在肾小管上皮细胞中表达的影响

目的：通过慢性肾衰竭大鼠血清对肾小管上皮细胞多药耐药蛋白表达影响的研究,探讨慢性肾衰竭肾小管上皮细胞功能改变的部分分子机制。方法：体外培养小鼠原代肾小管上皮细胞,分别用含1.0%,2.5%,5.0%的5/6肾切除的慢性肾衰竭大鼠血清和正常对照大鼠血清的培养液培养,72h后收集细胞,提取膜蛋白。用Western-blotting检测多药耐药蛋白（P-glycoprotein,P-gp）、多药耐药相关蛋白2（multidrug resistance-associated protein 2,MRP2）和内参5′-nucleotidase的蛋白表达。用Bio-Rad Quantity One凝胶分析系统对条带进行半定量分析。结果：（1）血清浓度相同的情况下,慢性肾衰竭大鼠血清刺激可较对照血清增强肾小管上皮细胞P-gp的表达,在血清为1.0%时,有统计学意义;而各个浓度的肾衰竭血清刺激细胞MRP2的表达均较正常对照血清显著增高,具有统计学意义。（2）无论对照血清还是慢性肾衰竭血清,随着血清浓度的降低,两种耐药蛋白的表达均逐渐增高。P-gp表达在1.0%血清干预的细胞和5.0%、2.5%血清之间,有统计学意义;而MRP2的表达在各个浓度之间均有统计学意义。结论：血清成分或浓度可改变肾小管上皮细胞P-gp和MRP2的表达,其机制和作用有待进一步研究。     

SnoN as a Key Regulator of the High Glucose-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition in Cells of the Proximal Tubule

Background/Aims: Ski-related protein N (SnoN) suppression is essential to transforming growth factor-β1 induction and the epithelial-mesenchymal transition (EMT) in several cancer cells. The role of SnoN in diabetic nephropathy is unknown. We aimed to determine the role of SnoN in the EMT of proximal tubule cells (PTCs) maintained under high glucose conditions. Methods: Immunohistochemistry, immunocytochemistry, Western blotting, small interfering RNA gene silencing, viral transduction and RT-PCR were used to assess changes in SnoN, E-cadherin, cytokeratin-18, α-smooth muscle actin and fibronectin expression using an in vivo streptozotocin-induced rat diabetic nephropathy model, and PTCs exposed to high glucose (25 mmol/l). Results: High glucose induced EMT in vitro and in vivo. Exposure of PTCs to a high concentration of glucose suppressed SnoN expression in a time-dependent manner compared with normal glucose and high osmolarity-treated groups. SnoN gene silencing under high glucose conditions appears to enhance the transition of PTC phenotype. Conversely, ectopic expression of exogenous SnoN after transfection conferred tubular epithelial cell resistance to high glucose-induced EMT. Conclusion: SnoN plays a negative role in high glucose-induced EMT in PTCs. The effect of SnoN downregulation in vivo and in vitro suggests that SnoN may be a potential therapeutic target.     

SnoN蛋白在慢性同种移植肾病大鼠肾组织中的表达及作用

目的：观察Smad核转录共抑因子（SnoN蛋白）在慢性移植肾病（CAN）大鼠肾组织的表达及其与CAN大鼠肾脏功能改变、病理学改变、Smad泛素化调节因子2（Smurf2）之间的关系,探讨SnoN蛋白在CAN中的作用。方法：实验组采用近交系大鼠的同种异基因动物间的左肾原位移植,雄性F344大鼠40只为供体,雄性LEW大鼠40只为受体,移植手术后第10天行右肾切除术,对照组采用单肾切除术的雄性大鼠25只。分别于4周、8周、12周、16周及24周处死大鼠,做肾功能、移植肾组织学检测,并借助免疫组织化学与免疫印迹、逆转录-多聚酶联反应方法检测肾组织中snoN蛋白、snoNmRNA的表达;免疫组织化学与免疫印迹方法检测肾组织smurf2的表达,免疫印迹方法检测肾组织p-smad2/3蛋白的表达水平,逆转录-多聚酶联反应方法检测肾组织TGF-β1mRNA的表达。结果：移植组大鼠尿蛋白定量、血清肌酐水平于移植后16周时显著增高,24周时更为显著。snoN蛋白在移植组逐渐降低,24周时降至最低,为对照组的13%。snoNmRNA在移植组和对照组差异无统计学意义;p-smad2/3、smurf2在移植后随疾病进展逐渐升高,24周时达高峰。免疫组织化学结果显示snoN蛋白表达部位、表达时相与smurf2是一致的。相关分析显示,肾移植大鼠snoN蛋白表达水平与24h尿蛋白定量、血清肌酐水平、肾间质纤维化程度呈负相关（P〈0.05,P〈0.01）。与smad2/3、smurf2水平呈显著负相关（P〈0.01）。结论：SnoN蛋白表达下调在CAN发病机制中起作用,同时Smurf2介导SnoN蛋白降解可能参与了这个过程。