小鼠visfatin抗体的制备及应用

目的: 制备高效价抗visfatin抗体, 探测visfatin在前脂肪细胞成脂分化过程中在空间上表达情况.方法: 克隆鼠内脂素visfatin基因的蛋白编码区全长序列, 构建其原核表达载体pET28a-visfatin, 然后在E.coli(BL21)中诱导大量以包涵体形式表达, 提取包涵体并用Ni-NTA 亲和层析柱纯化蛋白, 并以此为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.以纯化后的抗血清为一抗, Western blot检测小鼠肝、肌肉等组织中visfatin的分布.结果: SDS-PAGE及Western blot显示原核表达载体pET28a-visfatin在大肠杆菌中诱导表达, 融合蛋白能够被抗his mAb识别.免疫新西兰大白兔获得抗体效价在1∶ 25 600以上.结论: 用制备得到的抗体对小鼠心、肝、肺、脾、脂肪、肌肉组织样品做Western blot鉴定, 结果表明visfatin在各组织中均有表达, 其中脾和脂肪组织中表达量高于其他组织.     

人抗凝血酶Ⅲ的表达及其抗血清的制备

目的 用大肠杆菌系统表达重组的抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ),制备其抗血清并测定效价.方法 利用基因克隆技术获得AT-Ⅲ基因片段,构建原核表达质粒pET32a(+)-AT-Ⅲ,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达、蛋白纯化并免疫兔,间接ELISA、Western blot法检测抗血清.结果 SDS-PAGE、Western blot法检测原核表达蛋白结果显示,在相对分子质量(Mr)77 000附近出现特异性条带.对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备AT-Ⅲ抗血清,间接ELISA方法检测抗血清的最高效价可达到1∶12 800,Western blot分析表明抗血清可与293T、CHO细胞表达的AT-Ⅲ蛋白及AT-Ⅲ蛋白纯品特异性结合.结论 成功制备了人抗凝血酶Ⅲ抗血清.     

兔抗人Bit1抗血清的制备及其纯化

目的：利用大肠杆菌中表达的人Bitl(hBitl)蛋白，制备兔抗人Bitl抗血清并对其进行纯化。方法：在大肠杆菌中诱导表达人Bitl融合蛋白：以其免疫家兔，制备兔抗人Bitl抗血清，用非特异性去除法纯化抗体，并以Western blot对所纯化的兔抗人Bitl抗血清进行鉴定。结果：大肠杆菌中表达的人Bitl蛋白占菌体总蛋白的40％。用纯化的抗血清可特异地检出大肠杆菌表达的人Bit融合蛋白。结论：人Bitl融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达，并成功地制备并纯化了兔抗人Bitl抗血清。     

植原体免疫主导膜蛋白A的原核表达载体构建、表达及其抗血清制备

目的 构建植原体免疫主导膜蛋白A (IdpA)的原核表达载体,表达并纯化目的蛋白,制备抗血清.方法 以重组克隆质粒pMD18-T-IdpA为模板PCR扩增IdpA基因片段,经酶切连接将IdpA基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),PCR和双酶切进行鉴定.IPTG诱导重组菌表达IdpA蛋白,并进行纯化和鉴定,以纯化获得的IdpA蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并采用ELISA和Western blot法检测抗血清的效价和特异性.结果 成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-IdpA,并在大肠杆菌中能稳定表达IdpA蛋白,经纯化获得了纯度大于90％的高纯度目的蛋白,用纯化的IdpA蛋白免疫BALB/c小鼠,获得了效价高于1:320 000的强特异性抗IdpA蛋白抗血清.结论 成功进行了IdpA的原核表达并制备了抗血清.     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白表达、纯化及抗血清制备

目的 表达人乳头瘤病毒16型(HPV16) E2蛋白,并制备小鼠抗HPV16 E2血清.方法 采用PCR技术扩增HPV16E2基因,构建入pET21b载体,重组表达载体pET21 b-HPV16E2经鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),诱导表达并鉴定表达产物.经纯化、变性和复性方法,制备可溶性HPV16 E2蛋白.免疫BALB/c小鼠制备抗血清,检测小鼠IFN-γ、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4/CD8比值和抗血清滴度变化.结果 酶切和测序结果表明pET21b-HPV16 E2构建成功.表达蛋白相对分子质量(Mr)为42 000,Western blot法证明具有较高特异性.小鼠抗血清效价升高,CD4+T细胞数量和CD4/CD8比值升高,小鼠IFN-γ无升高.结论 成功制备可溶性HPV16 E2蛋白和小鼠抗HPV16 E2高效价的抗血清.     

人乳头瘤病毒16型E4蛋白表达、纯化及抗血清制备

目的 表达人乳头瘤病毒16型(HPV16) E4蛋白,并制备小鼠抗HPV16 E4血清.方法 将HPV16 E4基因克隆入pQE30,重组质粒pQE30-HPV 16E4经鉴定后转化大肠埃希菌M15(PREP4),诱导表达并鉴定表达产物.因纯化、变性和复性方法,制备可溶性HPV16 E4蛋白.免疫Bal B/C小鼠制备抗血清,检测小鼠IFN-γ水平、CD4/CD8比值和抗血清滴度变化.结果 酶切和测序结果表明pQE30-HPV16F4构建成功.表达分子相对分子量(Mr)为10 000,Western blot法证明具有较高特异性.小鼠抗血清效价升高,CD4/CD8无升高,小鼠γ干扰素(IFN-γ)无升高.结论 成功制备可溶性HPV16 E4蛋白和小鼠抗HPV16 E4高效价的抗血清.     

人胆固醇酯转运蛋白的eDNA克隆、原核表达及抗血清制备

目的:克隆人胆固醇酯转运蛋白(CETP)eDNA序列,利用大肠杆菌表达人CETP,制备兔抗人CETP的多克隆抗血清.方法:采用RT-PCR方法,将人CETP基因克隆到pET-30b( )上,构建CETP原核表达载体并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,切胶纯化蛋白后免疫家兔,制备CETP抗血清,以ELISA、Western blot、细胞免疫荧光方法对抗血清效价及特异性进行鉴定.结果:SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CETP基因在大肠杆菌BL21(DE3)的包涵体中高效表达,最佳诱导表达时间为4 h.将切胶纯化的蛋白免疫家兔,ELISA法测定的抗血清效价为1∶5.12×105.Western blot及细胞免疫荧光检测结果显示,抗血清可以与CETP原核及真核表达蛋白特异结合.结论:成功地将CETP进行了原核表达并制备了高效价、高特异性的兔抗人CETP抗血清,为进一步研究CETP的结构与功能奠定了基础.     

钙整合素结合蛋白CIB的原核表达及多克隆抗体的制备与亚细胞定位

目的:构建钙整合素结合蛋白(calcium-and intesrin-binding protein,CIB)的原核表达载体,制备小鼠抗人CIB的多克隆抗体并探讨其亚细胞定位.方法:采用RT-PCR方法从人脑组织扩增CIB的cDNA片段,利用DNA重组技术构建原核表达载体pET32a-CIB,转入BL21(DE3)中,以IPTG诱导BL21(DE3)表达CIB融合蛋白,SDS-PAGE鉴定融合蛋白CIB的表达.用含CIB融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒为抗原免疫小鼠制备抗血清,抗血清分别经Protein G、抗原亲和层析后用Western blot及免疫组化方法进行鉴定.结果:通过重组表达获得CIB抗原蛋白,免疫小鼠并纯化抗血清得到特异性的抗CIB抗体,该抗体能检测细胞内源性CIB蛋白的表达;同时免疫组化结果显示:CIB在SHG44、Hhu7细胞株中主要定位于细胞质.结论:成功克隆CIB基因并制备了特异性的小鼠抗人的CIB多克隆抗体,对进一步研究CIB的功能奠定了基础.     

小鼠GITRL融合蛋白的表达、纯化及免疫原性的研究

目的:构建含小鼠GITRL基因原核表达载体,经转化E.coli以表达GITRL融合蛋白,纯化蛋白并制备相应的抗血清.方法:将GITRL-pMD18-T重组质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切回收目的基因,与原核表达载体PET32a连接,应用电转法转化BL21(DE3)菌.阳性克隆经鉴定后用IPTG诱导GITRL蛋白表达,经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE、Western blot进行特异性鉴定,CD4+CD25+T细胞免疫抑制试验验证其生物学功能.采用弗氏完全佐剂常规免疫方案,制备抗GITRL抗血清,抗血清的效价和特异性测定采用双向琼脂免疫扩散法.结果:经酶切鉴定和测序分析证实原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在40 kD处呈现单一蛋白条带,该蛋白具有阻断CD4+CD25+T细胞免疫抑制功能的作用,双向免疫扩散结果显示兔抗小鼠GITRL抗血清效价为1∶16.结论:成功构建GITRL原核表达质粒,制备和纯化的GITRL融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,制备并获得特异性抗血清,可用于GITRL融合蛋白生物学活性的进一步研究.     

兔抗多疣壁虎Hoxc10抗血清的制备及鉴定

目的:制备兔抗多疣壁虎Hoxc10抗血清并进行特性鉴定.方法:构建pGEX-4T1 -g-Hoxc10质粒,转化大肠杆菌BL21后,在异巯基-1-硫代-β呋喃半乳糖(IPTG)诱导下,表达谷胱甘肽S-转移酶( GyST) -g-Hoxc 10蛋白.用亲和层析纯化的融合蛋白免疫大白兔,制备Hoxc10抗血清.用Western blot和免疫组化染色法检测Hoxc10抗血清的特性.结果:构建的多疣壁虎Hoxc10基因的原核表达质粒pGEX-4T1 -g-Hoxc10,在大肠杆菌中获得高效表达.表达产物经亲和层析纯化后得到高纯度的Hoxc10融合蛋白,以其免疫大白兔获得较高效价的Hoxc10抗血清.Western blot及免疫组化染色法检测显示,所得抗血清具有较高的效价及特异性.结论:利用原核表达的多疣壁虎GST-g-Hoxc10融合蛋白制备的Hoxc10抗血清效价高,特异性良好,为进一步深入研究Hoxc10的功能提供了重要的制剂.     

昆虫抗冻蛋白DAFP的原核表达、纯化和抗血清制备

目的:制备昆虫抗冻蛋白DAFP特异性的鼠抗血清。方法:根据GenBank已发表的Dendroides canadensis抗冻蛋白基因序列(gi:2737939),人工合成加拿大拟步甲虫(Dendroides canadensis)的抗冻蛋白基因(dafp),并克隆到原核表达载体pGEX-4T-1和pMAL-p2x中,在大肠杆菌中进行表达。表达的融合蛋白经Glutathione Sepharose4B纯化后,免疫小鼠制备抗DAFP的抗血清,抗体的效价及特异性分别采用ELISA和Western blot进行检测。结果:SDS-PAGE检测表明,人工合成的dafp基因在大肠杆菌中可表达相对分子质量(Mr)为38000的可溶性融合蛋白。以该融合蛋白免疫小鼠所制备的抗体,其ELISA滴度为1∶5000,Western blot证实BL21/pGEX-4T-1-dafp菌和TB1/pMAL-p2x-dafp菌的表达产物可特异性地与该抗体结合。结论:在大肠杆菌中成功地表达了DAFP的融合蛋白并制备出抗融合蛋白的鼠抗血清,为进一步研究DAFP的特性奠定了基础。     

GST-GP302融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其抗血清的制备

目的 :在大肠杆菌中表达血小板糖蛋白GPIbα之vWF结合区(GP30 2 )与谷胱甘肽S 转移酶GST的融合蛋白并制备其抗血清。方法 :将GP30 2片断插入GST融合表达载体 pGEX 4T 1,重组载体酶切鉴定后 ,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST GP30 2融合蛋白 ,SDS PAGE分析表达产物。包涵体经变性复性后免疫新西兰白兔 ,制备抗血清 ,ELISA、Westernblot检测重组抗原的免疫活性。结果 :重组质粒酶切鉴定表明 ,GP30 2基因已正确插入到 pGEX 4T 1中 ,经IPTG诱导后 ,表达出相对分子质量 (Mr)约为 5 90 0 0的融合蛋白 ,获得了ELISA效价为 1× 10 -5的多克隆抗体。Westernblot证明所制备的多抗可以与血小板糖蛋白特异性结合。结论 :GP30 2片断在大肠杆菌中的成功表达及制备得到的多克隆抗体 ,为检测血小板糖蛋白GPIbα及其在其他体系中的表达提供了一种检测途径     

Preparation and characterization of the polyclonal antibody against pig integrin beta6 subunit LBD as FMDV receptor

AIM: To induce the expression of FMDV receptor integrin beta6 subunit ligand-binding domain in E.coli and prepare the rabbit polyclonal antibody against it. METHODS: The fragment coding beta6 ligand-binding domain was amplified by PCR and doubly digested with BamH Iand Xho I. Then it was cloned into expression vector pGEX-4T-1 to obtain recombinant plasmid pGEX-4T-1-beta6LBD. After pGEX-4T-1-beta6LBD was transformed into E.coli BL21(DE3) and induced by IPTG, the expression of fusion proteins was identified by SDS-PAGE, with inclusion body prepared and fusion protein purified. Then new Zealand rabbits were immunized to prepare polyclonal antibody against beta6LBD. GST-beta6LBD antiserum was obtained and the specificity of polyclonal antibody was detected by Western blot. RESULTS: SDS-PAGE demonstrated that the fusion protein GST-beta6LBD was expressed with the expected molecular weight at 42 000. A single clear band of GST-beta6LBD fusion protein appeared in SDS-PAGE gel after purification. The titer of the polyclonal antibody was above 1:12 800 and it is of high specificity. CONCLUSION: The successful preparation of rabbit anti pig beta6LBD polyclonal antibody with high affinity and specificity will lay a foundation for further research into the function of integrin beta6 in FMDV infection.     

人LIGHT胞外区基因的克隆及融合蛋白的表达

目的：克隆人LIGHT胞外区基因（hsLIGHT），构建其原核表达质粒，并诱导其在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法：采用RT-PCR方法从HL60细胞中扩增hsLIGHT，将其克隆人原核表达质粒pGEX-4T-2，构建其重组表达质粒pGEX-4T-2／hsLIGHT，以不同浓度IPTG诱导表达，于不同时间经SDS-PAGE和Western blot分析、鉴定。结果：经RT-PCR扩增获得的hsLIGHT序列与Genebank报道的LIGHT基因胞外区序列完全一致；SDS-PAGE和Westernblot分析证实重组质粒可表达出相对分子量为47000的蛋白，与GST-hsLIGHT融合蛋白分子量一致。结论：成功完成了人LIGHT胞外区基因的克隆及其原核表达质粒的构建，在大肠杆菌E-coli BL21中经IPTG诱导表达了融合蛋白GST-hsLIGHT，为进一步探讨LIGHT的抗肿瘤生物学活性、探索肿瘤免疫治疗新方法奠定了基础。     

候选hEra结合蛋白A19/GST的融合表达及其抗体的制备

目的:在大肠杆菌中表达候选人Era结合蛋白A19/GST融合蛋白,并制备兔抗A19抗体。方法:利用人Era蛋白全长作为诱饵,进行胎肝cDNA文库的酵母双杂交筛选。将得到的候选人Era结合蛋白A19的编码基因序列克隆入pACT2载体中,构建pACT2A19。用PCR扩增A19蛋白的编码基因序列,克隆入融合表达载体pGEX4T3中,构建A19的表达菌,并经IPTG诱导表达A19蛋白。用SDSPAGE分析及薄层扫描检测目的蛋白的含量。用A19蛋白免疫家兔制备抗血清,以Westernblot鉴定抗体的特异性并检测抗体的效价。结果:大肠杆菌中表达的A19蛋白占菌体总蛋白的30.2%。Westernblot分析显示,抗血清具有较高的特异性,其效价约为1∶4000。结论:成功地获得了候选的人Era结合蛋白A19,制备了兔抗A19抗血清,为后续Era功能的研究奠定了基础。     

兔抗STAT5抗体的制备及其在乳腺癌诊断中的应用

目的：制备并纯化兔抗小鼠脾信号转导和转录激活因子5(STAT5)的抗体，分析其在乳腺癌细胞以及良恶性乳腺组织中的表达。方法：应用重组小鼠STAT5蛋白，常规免疫雄性新西兰兔制备抗STAT5抗体，并用盐析法和离子交换层析技术进行纯化。用免疫印迹法(Western blot)检测抗STAT5抗体的纯度和特异性，以及乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231中STAT5蛋白的表达；用免疫组化SP法检测STAT5在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达。结果：以重组小鼠STAT5蛋白免疫新西兰兔6wk后，用间接ELISA法检测静脉血中STAT5抗体的效价为1：204800(A450=1．07)。将STAT5经SDS-PAGE分离，可见1条相对分子质量(Mr)为90000～95000的蛋白带，与文献[3]的报道相符。用抗STAT5血清做Western blot分析显示，在Mr为90000～95000处也有1条明显的带，证明是抗STAT5的特异性抗体。将人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-23的细胞浆和细胞核蛋白，与所制备的抗STAT5抗体均可起反应。人乳腺组织切片用抗STAT5抗体做免疫组化染色显示，在正常乳腺组织细胞浆中可见棕黄色颗粒，而在乳腺癌组织的细胞浆和细胞核中可见棕黄色颗粒。结论：制备了高效价、特异性的兔抗STAT5抗体。用该抗体检测证实，STAT5只在正常乳腺组织的细胞浆中表达，而在乳腺癌细胞STAT5的细胞浆和细胞核中均有表达，提示发生乳腺癌后，STAT5可由细胞浆易位人细胞核中表达。可作为乳腺癌临床诊断的参考指标。     

脂肪细胞新蛋白My027原核表达、纯化及生物活性研究

目的通过原核表达获得大量脂肪新蛋白质My027,并在体外初步研究其生物活性。方法RT-PCR法扩增出My027片段,插入原核表达载体pGEX-4T-2,构建质粒pGEX-My027。转化BL-21菌,IPTG低温诱导表达融合蛋白,经亲和层析法获得融合蛋白,利用SDS-PAGE、Western印迹及质谱进行鉴定。在还原性谷胱甘肽存在的条件下,将纯化得到的融合蛋白作用于乙二醛酶Ⅰ的底物甲基乙二醛,通过分光光度法检测产物乳酸谷胱甘肽的生成。结果融合蛋白以水溶形式分泌于大肠埃希菌BL-21胞浆中,纯化后的目的蛋白SDS-PAGE、Western印迹及质谱证实高效表达,氨基酸序列正确。结论人脂肪细胞新蛋白质My027在pGEX-4T-2原核表达载体中可获高效表达,所纯化蛋白具有类似于乙二醛酶Ⅰ的作用。     

人IKKγ基因重组载体的构建及在原核体内的表达纯化

目的构建重组原核表达载体pGEX-5X-1-IKKγ,诱导GST-IKKγ融合蛋白的表达并以GST-pulldown方法得到纯化的融合蛋白。方法应用PCR技术,以M6P8载体为模板扩增得到IKKγ全长序列,并亚克隆至带有GST标签的pGEX-5X-1载体中。经酶切、测序鉴定后,重组载体转化至原核细胞中并进行诱导表达,以SDS-PAGE凝胶电泳染色鉴定融合蛋白的表达。融合蛋白经GSTbeads沉降后,Western blot分析、鉴定融合蛋白的表达及纯化情况。结果将人IKKγ亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-1,酶切、测序鉴定无误。经诱导得到高表达的融合蛋白,经SDS-PAGE电泳染色后可见高表达条带。Westernblot鉴定经GSTbeads沉降后的蛋白,在74kD鉴定出融合蛋白的特异性条带。结论成功构建了原核表达载体pGEX-5X-1-,并在原核细胞内表达,融合蛋白可以经GSTbeads沉降用于GST-pulldown实验。     

胃癌抗原相关基因MPS-1的融合表达及兔抗GST-MPS-1抗体的制备

目的在大肠杆菌中表达GST-MPS-1融合蛋白并制备兔抗GST-MPS-1抗体。方法将MPS-1全长cDNA克隆至pGEX-5X载体内,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导GST-MPS-1融合蛋白的表达。以分离纯化表达的蛋白免疫新西兰兔,制备抗GST-MPS-1抗体。用Western blot和细胞免疫荧光染色法,检测兔抗GST-MPS-1抗体的特异性。结果经测序和酶切鉴定确认,MPS-1基因以正确的方式插入到载体中。此重组表达载体经IPTG诱导后,可高效表达相对分子质量(Mr)为36000的GST-MPS-1融合蛋白。以融合蛋白免疫兔获得的抗血清,经ELISA检测效价达到1×105。Western blot和细胞免疫荧光染色证实,该多克隆抗体能与MPS-1蛋白特异性结合。结论兔抗MPS-1特异性抗体的获得,为进一步检测MPS-1蛋白的表达和功能分析奠定了基础。     

降钙素原抗原的表达及其抗体的制备与初步鉴定

目的:构建降钙素原(PCT)原核表达载体, 制备其多克隆抗体(pAb)和单克隆抗体(mAb), 并进行特性鉴定.方法:以甲状腺癌细胞cDNA文库为模板, 构建重组表达质粒pGEX- 4T-1-PCT和PET-32a-PCT, 在大肠杆菌中分别表达GST-PCT和His-PCT融合蛋白, 用His-PCT免疫家兔和BALB/c小鼠制备兔pAb和鼠mAb.通过ELISA法测定抗人PCT抗血清效价;用Western blot、 间接免疫荧光鉴定pAb的特异性.使用间接ELISA法筛选分泌特异性抗PCT的杂交瘤细胞株, 采用Western blot和间接免疫荧光鉴定mAb的特异性. 结果:构建了重组表达质粒pGEX- 4T-1-PCT和PET-32a-PCT, 并在大肠杆菌中表达、纯化.经ELISA法测得抗人PCT抗血清效价是1∶ 256 000.制备的抗PCT兔多克隆抗体可特异地识别重组和天然的PCT蛋白.获得8株可稳定分泌抗PCT的杂交瘤细胞株, 可识别重组人PCT蛋白, 其中有4株可特异性结合TT细胞质中的天然蛋白. 结论: 成功地制备出兔抗人PCT抗血清和8株抗PCT的mAb, 为进一步研究PCT在严重的细菌感染和脓毒症中的病理及生理作用奠定了基础.