鼠疫耶尔森菌基因组研究进展

鼠疫耶尔森菌的全基因组序列已测定完成 ,在染色体上有 4 0 0 0多个编码序列和 14 9个假基因 ,并含有大量的插入序列 ,3个毒性质粒上也含有诸多与致病性有关的基因。本文主要就鼠疫耶尔森菌的染色体及质粒p YV/ p CD1、p Fra/ p MT1和 PST/ p PCP1的基因结构、组成特征和已知的毒性基因定位等方面的研究作一综述     

准噶尔盆地鼠疫耶尔森菌的基因组型分析

目的 对我国新发现的准噶尔盆地大沙鼠鼠疫自然疫源地的鼠疫菌株进行基因组差异性区段的比较分析,确定该鼠疫疫源地鼠疫菌株的基因组类型.方法 按常规方法提取鼠疫菌染色体DNA,依据已证实的鼠疫菌22个差异性区段(DFR)设计引物,采用PCR技术检测鼠疫菌基因组差异性基因片段的构成.结果 准噶尔盆地鼠疫菌株的差异性区段结构类型为缺失DFRO1、04、06、07、10、13和DFR15～18,不同于其他鼠疫疫源地鼠疫菌株的结构类型.为我国新的鼠疫菌基因组型.结论 准噶尔盆地大沙鼠鼠疫疫源地鼠疫菌株的基因组结构类型为我国新的基因组类型.     

准噶尔盆地大沙鼠鼠疫自然疫源地鼠疫耶尔森菌质粒谱的研究

目的 了解和掌握准噶尔瓮地大沙鼠鼠疫自然疫源地鼠疫菌质粒谱类型.方法 提取新疆地区不同鼠疫自然疫源地及青藏高原喜玛拉雅旱獭鼠疫自然疫源地、昆仑山喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地和内蒙古长爪沙鼠鼠疫自然疫源地的39株鼠疫菌质粒DNA,采用琼脂糖凝胶电泳法对其进行质粒谱图型分析.结果 在检测的26株准噶尔盆地大沙鼠鼠疫自然疫源地鼠疫菌中,有23株质粒谱为6×106、45×106、65×106,3株为6×106、45×106和72×106.结论 准噶尔盆地大沙鼠鼠疫自然疫源地鼠疫菌质粒谱分为两个类型:一为6×106、45×106、65×106质粒谱型,是该疫源地的主要质粒谱型,与邻近的北天山灰旱獭.长尾黄鼠鼠疫自然疫源地及内蒙占长爪沙鼠鼠疫自然疫源地、昆仑山喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地和青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地的鼠疫菌主要质粒谱型一致;二为6×106、45×106和72×106质粒谱型,为少数型,在我国系首次发现.     

鼠疫耶尔森菌与表面抗体相互作用的原子力显微镜观测研究

目的 以原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)观察比较鼠疫耶尔森菌EV76株与正常兔血清以及兔抗F1抗体反应后微观形态变化,探讨以原子力显微镜为工具的鼠疫耶尔森菌的免疫检测方法.方法 用兔抗F1抗体及正常兔血清处理鼠疫耶尔森菌菌液,并与对照菌一起制样后在原子力显微镜下观察鼠疫耶尔森菌的表面结构的改变,并对其主要指标,包括Ra、Rq改变进行测量比较.结果 正常菌体组细胞呈椭圆形,两端钝圆,长为1.1～1.3 μm,宽为0.8～1.0 μm,阶高为0.04～0.06 μm,细胞形状规则,表面相对比较光滑;对照抗体及F1抗体加入组,细菌阶高均明显增高;F1抗体结合株菌体形状不规则,表面粗糙度明显增加.结论 获得原子力显微镜下的鼠疫耶尔森菌形态特征;表面抗体与鼠疫耶尔森菌结合后,对鼠疫耶尔森菌的表面超微结构有显著的影响,其中粗糙度可以作为原子力显微镜免疫检测的指标.     

鼠疫耶尔森菌中国分离株菌体脂肪酸成分分析

目的 探讨利用脂肪酸组织对中国鼠疫耶尔森菌菌株进行分型的可能性,获得中国鼠疫耶尔森菌菌株脂肪酸组成的本底资料。方法 选择历年来从我国不同疫源地分离到的58株鼠疫耶尔森菌进行了菌体脂肪酸成分分析。并利用STATISTICA统计软件进行实验菌株的聚类分析。结果 中国鼠疫耶尔森菌菌株的主要脂肪酸分为16：0酸,环式17：0酸,3-羟基14：0酸和ω7c16:1酸以及十八碳单烯酸,与MIDI公司Sherlock系统的菌库中的数据存在一些差异。结论 实验菌株的脂肪酸成分极为接近,聚类图不能充分体现分离株在分离时间,地点以及生物型别上的差异。表明脂肪酸分析目前不适于鼠疫耶尔森菌的分型,根据实验结果,建立了中国鼠疫耶尔森菌菌株的脂肪权组成数据库。     

应用抑制削减杂交技术进行鼠疫耶尔森菌的比较基因组研究

目的确定古典型鼠疫耶尔森菌的特有序列，为建立和完善该菌基因组分型系统提供可靠数据。方法通过抑制削减杂交技术发现差异片段并应用PCR验证。结果发现了5个在不同生物型鼠疫菌问存在差异的DNA片段，其中一个383bp的片段在来自天山山地灰旱獭、长尾黄鼠鼠疫自然疫源地的30株鼠疫菌全部阳性，而来自其它鼠疫自然疫源地的菌株全部阴性，5株假结核耶尔森菌中有2株(生物Ⅰ型和Ⅱ型)阳性。结论该383bp片段为天山山地灰旱獭、长尾黄鼠鼠疫自然疫源地的鼠疫菌所特有，此疫源地的菌株可能是我国较古老的鼠疫菌。     

新疆山地鼠疫自然疫源地鼠疫耶尔森菌基因组分化和演变

目的比较来自我国新疆4大片山地鼠疫自然疫源地的144株鼠疫菌的基因组组成的差别,研究新疆山地鼠疫自然疫源地鼠疫菌的基因分型和进化规律。方法根据已经证实的22个差异区段(DFR)设计引物,每株鼠疫菌的每个DFR都采用PCR技术进行验证。结果新疆4大片山地鼠疫自然疫源地的144株鼠疫菌的基因型DFR图谱可归类为14种,分为7个主要基因组型和7个次要基因组型。西天山北坡灰旱獭-长尾黄鼠鼠疫疫源地存在3个主要基因组型和5个次要基因组型,西段以01型基因组型为主,占种群体的91.7%,02型占8.3%;中段以03型为主,占68.8%,01型占4.2%,02型占20.85%,另有02M1和02M3(02型的突变型)占2.1%,03M1型(03型的突变型)占2.1%;东段以02型为主,89.8%,01型、02M2、02M3和02M4型(02型的突变型)各占2.0%。南天山灰旱獭鼠疫疫源地存在2个主要基因型和1个次要基因型,以4型为主,占66.7%,02型占16.7%, 04M1型(04型的突变型)占16.7%。帕米尔高原-阿赖山红旱獭鼠疫疫源地仅存在04型1种基因型。昆仑山喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地分为中昆仑和东昆仑鼠疫自然疫源地,中昆仑山存在2种鼠疫基因组型,以11型为主,占群体的90%,12型占10%;东昆仑山存在3种鼠疫基因组型,以05型为主,占66.7%,02型和11型分别占16.7%。结论新疆山地鼠疫自然疫源地鼠疫菌基因组的演化由3个演化路线组成。西天山北坡鼠疫自然疫源地的鼠疫菌基因组,自西向东在不同的生态地理环境和宿主媒介作用下发生适应性进化和演变,由较为古老的01型基因组逐渐演化为02和03型,最后南下至青海和东昆仑演变为05型,并且在这条演化路线上存在许多演变过程中发生的基因组地域交叉和次要基因组型;南天山和帕米尔高原-阿赖山鼠疫自然疫源地的鼠疫菌的04型基因组型是由01型直接演化而来,并在这一区域形成主要鼠疫基因组型;中昆仑山鼠疫自然疫源地的鼠疫菌基因组型可能是由西藏冈底斯山喜马拉雅旱獭鼠疫源地的鼠疫菌的10型基因组演化而来,形成以11型为主,12型为辅的鼠疫基因组构型特点。     

云南、福建和贵州省鼠疫耶尔森菌基因分型研究

云南省位于我国西南边陲，存在滇西山地齐氏姬鼠大绒鼠鼠疫自然疫源地（野鼠鼠疫疫源地）和滇西山地闽广沿海居民区黄胸鼠鼠疫自然疫源地（家鼠鼠疫疫源地），除了剑川地区属于野鼠鼠疫疫源地外，云南省的西北部疫区均属于家鼠鼠疫疫源地。福建省位于我国东南沿海，其境内的鼠疫自然疫源地也属于家鼠鼠疫疫源地。贵州省兴义市位于云南和广西省交界处，也属于家鼠鼠疫疫源地。为了比较家鼠及野鼠疫源地鼠疫耶尔森菌（以下简称鼠疫菌）基因组成的差别，采用PCR技术对分离自三省的69株鼠疫菌进行了基因分型研究。     

鼠疫耶尔森菌F1抗原的纯化方法改进及其免疫原性的评价

目的 建立从减毒鼠疫菌培养物中提取天然F1抗原的方法,评价F1抗原对鼠疫的免疫保护效果.方法 通过用玻璃珠裂解菌体替代有机溶剂的方法,结合饱和硫酸铵沉淀和凝胶过滤的方法从鼠疫菌培养物中纯化出天然F1抗原.将F1抗原吸附到25%氢氧化铝佐剂中,肌肉注射免疫BALB/c小鼠,于初次免疫后第18周皮下攻毒104 CFU活鼠疫菌141强毒株.结果 一次免疫的两个剂量组之间产生的抗体滴度差异无统计学意义,而加强免疫的两个剂量组中,F1-40 μg剂量组产生的抗体滴度明显高于F1-20μg剂量组.F1抗原免疫的小鼠全部存活,而且健康状况良好,对照组小鼠全部死亡.结论 本研究提供了一种简单、有效和便于大规模提取F1抗原的方法.提取的F1抗原具有较高的免疫原性,可作为鼠疫亚单位疫苗的重要抗原组分用于鼠疫亚单位疫苗的研制.     

Virulence markers of LCR plasmid in Indian isolates of Yersinia pestis

Presence of 10 important yop genes in Yersinia pestis isolates (18 in number) of Indian origin from 1994 plague outbreak regions of Maharashtra (6 Rattus rattus & Tetera indica rodents) and Gujarat (11 from human patients, 1 from R. rattus) and from plague endemic regions of the Deccan plateau (8 from T. indica) was located by PCR and specific enzyme immunoassay. PCRs were standardized for six effector yops (YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO and YopT), three translocator yops (YopB, YopD and YopK) and a regulator LcrV gene. Amplification of all the 10 yop genes was observed in isolates recovered from pneumonic patients and in 5 of 7 rodents from outbreak regions. Among these, amplification of the yopD gene was absent in all eight isolates, and that of yopM in all except one (10R). One of the isolates from rodents of the Deccan plateau (24H) was consistently negative for all the yops. Cloning and expression of truncated yopM (780 bp), yopB (700 bp) and lcrV (796 bp) genes in pQE vectors with SG13009 host cells yielded recombinant proteins for generation of monoclonal antibodies for further use in enzyme immunoassay. Ten stable reactive clones for YopB, nine for YopM and six for LcrV were obtained, all of them exhibiting specific reactions only to Y. pestis. Testing of 26 Y. pestis isolates by monoclonal antibody dot-ELISA and Western blotting provided results identical to PCR, suggesting that the isolates that failed to show PCR amplification also had no expression of their respective proteins. The Y. pestis isolates of outbreak regions had their virulence factors intact in the LCR plasmid. Yersinia pestis isolates recovered from rodents of the Deccan plateau were relatively heterogeneous. It appears that a long residency of Y. pestis of nearly 100 years in the enzootic plague foci has resulted in shedding of virulence genes in the LCR plasmid region in a fairly large proportion of the organisms, possibly due to natural recombination.     

抗醛糖还原酶单克隆抗体的制备与特性鉴定

目的:制备抗醛糖还原酶(AR)的单克隆抗体(mAb),并与本室制备的抗醛糖还原酶相似蛋白(ARL-1)mAb进行比较。方法:经RT-PCR获得AR基因,将基因插入pGEX-4T-1(His)6C中,构建重组质粒pGEX-4T-1(His)6C-AR,以重组质粒转化E.coliRosetta诱导表达GST-AR蛋白。以纯化的GST-AR蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb。应用间接ELISA和Western blot方法对mAb进行筛选和鉴定。使用Clustalx和Antheprot软件,比较AR与ARL-1的同源性,表达GST-dAR[80~142氨基酸(aa)],与ARL-1差异较大;并分析AR的抗原性,表达GST-dA1(1~79aa)、GST-dA2(80~99aa)、GST-dA3(111~142aa)、GST-dA4(143~316aa)。利用AR全长及截短蛋白,采用Western blot分析制备的抗AR mAb识别AR抗原的部位。结果:获得3株稳定分泌抗AR mAb的杂交瘤细胞系ARB3、AR7B3G4和ARF10。3株抗GST-AR的mAb均为IgG1(κ型),腹水mAb效价为1∶4×105,细胞培养上清mAb效价为1∶1×104,3株mAb均可与胎盘组织中的AR蛋白起反应,而与GST-ARL-1和GST蛋白无交叉反应。它们分别为抗GST-dA1、GST-dA3和GST-dA4蛋白的mAb。结论:成功地制备了3株特异性抗AR mAb,可分别识别AR的1~79、111~142、143~316位氨基酸。将它们与抗ARL-1mAb联合应用,将有助于进一步研究AR与ARL-1蛋白的功能,并为深入探讨AR、ARL-1与相关疾病的关系及进行大规模的流行病学调查提供了有力的工具。     

鼠疫F1蛋白原核分泌性表达及鉴定

目的构建重组质粒,在大肠杆菌中表达鼠疫菌F1抗原。方法用PCR方法扩增出带有信号肽的F1基因,将其克隆到表达载体pET30a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3);用IPTG诱导目的基因表达,层析方法纯化F1蛋白,测定其分子量、等电点、N末端氨基酸序列,用Westernblot法检测其抗原性。结果根据双酶切和DNA测序结果显示,F1基因成功连接到表达载体pET30a(+)中,F1蛋白主要为分泌性可溶表达。测定纯化后F1蛋白的相对分子量约为15.6kD,等电点为4.15,N末端氨基酸序列与理论序列一致。经Westernblot鉴定,能被兔抗鼠疫菌EV株血清识别。结论成功克隆并构建了F1蛋白分泌性原核表达系统,所表达的重组F1蛋白具有较好的抗原性,为新型鼠疫疫苗研制提供基础。     

抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定

目的:制备抗人DcR3单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性.方法:纯化的His-DcR3融合蛋白免疫小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人DcR3 mAb并进行纯化,纯化后的抗体经Western blot和ELISA方法鉴定其特异性、Ig亚型和效价.结果:获得5株稳定分泌抗DcR3 mAb的杂交瘤细胞,均属IgG1亚型,其腹水抗体效价为1×10-5 ～1×10-7,Western blot显示5株细胞分泌的mAb均可识别DcR3蛋白,其中1株(1B1)可与SW480细胞成分反应.结论:成功建立稳定分泌抗人DcR3 mAb的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体特异性强、效价高,为研究DcR3在组织中的表达、分布及研制ELISA试剂盒奠定基础.     

抗人粘膜地址素-1单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的制备抗人ＭＡｄＣＡＭ－１单克隆抗体（ｍＡｂ）。　方法以重组人ＭＡｄＣＡＭ－１胞外区蛋白免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，采用杂交瘤技术制备ｍＡｂ。结果获得１０株可分泌特异性ｍＡｂ的杂交瘤细胞，其腹水ｍＡｂ的效价为３．２×１０５～１．９×１０６，ｍＡｂ的Ｉｇ亚类均为ＩｇＧ１，其中，８株ｍＡｂ的轻链属κ型，２株为λ型。应用于免疫组化染色法，检测表明，正常成人小肠、附睾及前列腺组织中存在ＭＡｄＣＡＭ－１阳性表达的血管内皮细胞。结论　成功地研制出抗人ＭＡｄＣＡＭ－１的ｍＡｂ，为进一步研究ＭＡｄＣＡＭ－１在肠道黏膜免疫中的作用提供了有用的试剂。     

抗凋亡抑制蛋白——survivin单克隆抗体的制备

目的制备抗 survivin蛋白单克隆抗体。方法以大肠杆菌表达的 survivin融合蛋白为抗原 ,免疫 Balb/c小鼠 ,通过细胞融合 ,建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。结果获得了 6株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。 6株单克隆抗体均能特异识别和结合大肠杆菌表达的 survivin融合蛋白 ,但其中仅有 3株能够结合肿瘤细胞系表达的天然 survivin蛋白 ,并与某些肿瘤细胞系中 5 0 0 0 0 u±分子量的未知蛋白存在交叉反应 ,与正常人外周血淋巴细胞样本未见任何反应。结论通过单克隆抗体的免疫印迹反应 ,可以观察 survivin特定分子量蛋白的表达 ,为深入研究该蛋白的细胞凋亡调控功能提供了工具。此外 ,这些单克隆抗体对于肿瘤诊断也具有一定应用价值。     

人成纤维细胞生长因子-21单克隆抗体的制备及抗原表位的确定

目的 制备小鼠抗人成纤维细胞生长因子(hFGF)-21单克隆抗体(mAb),通过细菌展示确定该mAb的抗原表位.方法 用hFGF-21作为检测和免疫抗原,间接ELISA筛选分泌抗人hFGF-21 mAb的杂交瘤细胞株;用FITC标记该mAb,并克隆hFGF-21的不同片段到展示载体Apex上,通过流式细胞仪筛选其抗原表位.结果 成功筛选出1株抗hFGF-21抗体的细胞株,其分泌抗体重链的亚型为IgG 2b,轻链为Kappa链;该杂交瘤细胞株腹水的效价为1:4.096×106;传30代及液氮中保存3个月,该细胞株能稳定分泌抗hFGF-21 mAb,且效价稳定;Western blot法检测证明该抗体与人FGF-21有很好的特异性;该mAb与小鼠FGF-21有交叉反应;通过流式细胞仪对抗原表位的筛选,该mAb可与hFGF-21下游的第107～121个氨基酸反应.结论 成功的制备出特异性、高稳定性的小鼠抗hFGF-21 mAb,确定了该mAb的抗原表位在第107～121位氨基酸.     

小鼠肝炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

[目的]制备并鉴定小鼠肝炎病毒(MHV)N蛋白的单克隆抗体(mAb).[方法]以Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达的重组N蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,应用常规杂交瘤技术将免疫小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤进行融合,用间接ELISA方法筛选分泌N蛋白mAb的杂交瘤细胞系.并用Western blot和IFA方法对所获得的mAb进行鉴定.[结果]共获得4株稳定分泌抗N蛋白mAb的杂交瘤细胞系,其亚类鉴定2株为IgG2a,1株为IgG2b,1株为IgG1,轻链均为k型.经鉴定4株mAb均能与重组N蛋白发生特异性反应.[结论]成功获得了特异性抗MHV N蛋白的mAb,为进一步研究N蛋白的结构功能及建立诊断学方法奠定了基础.     

抗ARL-1单克隆抗体的制备及初步应用

目的: 制备抗醛糖还原酶相似蛋白(aldosereductaselikeprotein, ARL- 1)的单克隆抗体 (mAb)并进行初步应用。方法: 用纯化的ARL- GST蛋白免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备mAb。间接ELISA法、Westernblot及免疫组织化学染色法, 对mAb进行鉴定及初步应用。结果: 获得 1株可稳定分泌抗ARL -1蛋白mAb的杂交瘤细胞系。mAb的Ig亚类为IgG2b, 轻链属于κ型。腹水mAb的效价为: 1∶4. 096×105。Westernblot的结果表明, ARL 1蛋白在被检测的肝癌组织中呈高表达, 而在相应的癌旁组织中不表达。免疫组织化学染色的结果表明, ARL -1蛋白在肝癌组织中呈高表达且主要定位在胞质内。结论: 成功地制备 1株抗ARL -1蛋白的mAb。初步应用的结果表明, ARL- 1蛋白在肝癌组织中呈高表达, 为进一步研究ARL -1蛋白的功能, 以及其与肝癌的确切关系奠定了基础。