人CD3ζRNAi逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的:利用RNAi表达载体法构建并筛选携带针对CD3ζ基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞克隆。方法:利用DNA重组技术,设计3条60 bp能转录产生靶向CD3ζ小发卡RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,以pSUPER.retro.neo+gfp质粒作为空载体经限制性核酸内切酶酶切后与RNAi序列进行重组,构建CD3ζ-pSUPER retroRNAi逆转录病毒载体,脂质体法转染包装细胞系PA317,建立产生逆转录病毒的细胞克隆。结果:重组载体经限制性核酸内切酶酶切、PCR和测序鉴定表明CD3ζ-pSUPER retroRNAi重组质粒构建成功;脂质体法将重组载体转染包装细胞系PA317,表达绿色荧光蛋白,表明包装成功。结论:成功地构建了特异性沉默CD3ζ基因的pSUPER retroRNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞系,为后续研究CD59与CD3ζ在T细胞内信号转导的相互作用提供理论和实验依据。     

胰岛素样生长因子-1基因真核表达载体的构建

目的构建胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因重组逆转录病毒,为将IGF-1基因应用于神经系统疾病的治疗打下基础。方法质粒pcDNA3.1-IGF-1经EcoR I和Xho I双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建成重组逆转录病毒表达载体pLXSN-IGF-1,采用酶切及测序对重组体进行鉴定。而后脂质体转染pLXSN-IGF-1至包装细胞pA317,检测培养上清病毒滴度。结果重组真核基因表达载体pLXSN-IGF-1经EcoR I和Xho I双酶切后,得到了400 bp和6.0 kb两条带;以重组体为模板进行PCR检测,400 bp的目的基因片段呈阳性;重组体测序结果与预期结果完全一致;建立了细胞系PA317-IGF-1,其培养上清平均病毒滴度为6.5×105CFU/ml。结论成功构建了IGF-1基因重组逆转录病毒。     

GDNF基因逆转录病毒表达载体的构建及转染神经干细胞的研究

应用基因重组技术将大鼠GDNF cDNA克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,经酶切及PCR对重组质粒进行鉴定.将重组体包装到PA317细胞中,并感染增殖旺盛的大鼠神经干细胞,通过免疫细胞化学、RT-PCR和western-blot等方法鉴定转染效率.结果显示GDNF cDNA正确地克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,该真核细胞表达载体成功转染增殖旺盛的神经干细胞并有效表达.因此本研究成功构建了GDNF真核细胞表达载体,并成功转染到神经干细胞中.为移植替代和基因治疗神经系统疾病提供了实验基础.     

NT-3基因逆转录病毒表达载体的构建

目的:分离大鼠神经营养素-3(NT-3)基因, 构建pLEGFP-NT3逆转录病毒表达载体.方法:利用RT-PCR技术钓取大鼠NT-3基因, 克隆到测序载体pMD18-T中, 测序后再亚克隆到逆转录病毒载体pLEGFP-C1中, 通过Lipofectamine 2000导入包装细胞PA317.结果:RT-PCR产物为776 bp, 经测序鉴定虽与GenBank中NT-3基因的序列相差1个碱基, 但不影响NT-3蛋白质的表达;构建的pLEGFP-NT3重组载体经酶切鉴定,证实NT-3基因片段正确插入pLEGFP-C1载体中.转染包装细胞后, 激光共聚焦显微镜下观察导入NT-3基因的PA317细胞发绿色荧光.结论:分离得到了大鼠NT-3基因成功构建了pLEGFP-NT3表达载体.     

植烷酸氧化酶真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的构建小鼠植烷酸氧化酶（Phyh）真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到Phyh编码序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染NIH3T3细胞;使用细胞免疫化学技术对重组质粒pcDNA3/HA-Phyh在NIH3T3细胞中的表达及蛋白定位进行分析。结果 PCR、双酶切和测序鉴定表明,pcDNA3/HA-Phyh真核表达质粒构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞质中。结论成功构建了带HA标签的小鼠Phyh真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步研究Phyh的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。     

重组大鼠ΔNΔC/VEGF-C/Cys152Ser逆转录病毒载体的构建及表达

目的:构建重组大鼠ΔNΔC/VEGF-C/Cys152Ser(ddVEGF-C)逆转录病毒载体,建立稳定表达ddVEGF-C的PT67包装细胞株,并验证其表达。方法:利用PCR从pSecTag-ddVEGF-C中获取大鼠ddVEGF-C基因,克隆到pLPCX逆转录病毒载体,经PCR、双酶切和测序验证,转染PT67包装细胞,嘌呤霉素筛选出稳定表达目的基因的包装细胞株,用反转录PCR(RT-PCR)和Western blot方法验证其在RAW 264.7细胞中的表达。结果:构建的pLPCX-ddVEGF-C逆转录病毒载体经双酶切和PCR鉴定正确,测序结果与ddVEGF-C序列一致,病毒滴度为2×107CFU/mL,RT-PCR和Western blot结果提示重组病毒感染RAW264.7细胞能正确表达ddVEGF-C。结论:成功构建了pLPCX-ddVEGF-C逆转录病毒载体,并建立了稳定表达ddVEGF-C的PT67包装细胞株,为以VEGF-C基础的实验研究提供了新工具。     

反义HLA-A2和GDNF共表达逆转录病毒载体的构建和鉴定

为构建GDNF和反义HLA -A2共表达的逆转录病毒载体,将人GDNF酶切片段(XhoI/SalI)克隆于逆转录病毒载体pLNCX2 的XhoI位点,再将HLA A2cDNA片段反向克隆于上述重组载体的HindIII/SalI位点,对其作酶切鉴定和测序后转染PA317包装细胞系进行病毒的包装。收获重组病毒感染的NIH3T3并进行病毒滴度的测定,GDNF及HLA- A2表达的RT -PCR检测,进一步感染人胚肺成纤维细胞,观察GDNF分泌情况。结果表明:GDNF和反义HLA -A2两片段的序列和插入方向完全正确,包装后获得的重组病毒的平均滴度为5×105 CFU/ml。RT PCR显示:在小鼠源性的PA317细胞中有人GDNF和HLA A2的表达,ELISA法测得病毒感染人胚肺成纤维细胞上清液中GDNF含量为450pg/ml。通过本实验,我们获得能共表达GDNF和反义HLA -A2的重组逆转录病毒,其转染的人成纤维细胞具有合成GDNF的能力。     

三种反义c-myc逆转录病毒表达载体的纯化、病毒包装、滴度测定及整合检测

为了增强逆转录病毒构建体对靶细胞的转染能力 ,本实验使用 Wizard TMDNA纯化系统对构建成功的三种反义 c- myc逆转录病毒表达载体进行了纯化 ,并经脂质体介导包装 PA317细胞 ,使用 NIH 3T3细胞测定了 PA317抗性细胞克隆的病毒滴度 ,用 neo基因 PCR扩增检测外源基因的整合情况。结果显示纯化后的DNA达到了真核细胞转染的要求 ,但其包装滴度的高低还受靶细胞生长状态、 PA317抽样量的高度影响 ,而neo基因 PCR检测是一种敏感、经济和可靠的基因整合检测法     

HSP70基因的克隆与表达

目的 构建HSP70真核表达质粒以用于肾脏缺血预适应中HSP70作用及机制研究。方法用肝癌细胞系HepG2,用RT-PCR方法扩增HSP70cDNA,并利用T载体作为过渡,将HSP70基因克隆到真核表达载体pAAV-MCS中。重组质粒转染NIH3T3细胞,Western-blot法鉴定重组质粒HSP70／pAAV-MCS能在哺乳动物细胞中正确表达。结果RT-PCR方法正确地扩增出了全长HSP70基因。限制性内切酶酶切和测序结果证实HSP70基因克隆完全正确。重组质粒转染哺乳动物细胞系NIH3T3后,ECL-Western-blottimg法证实了目的基因能在其中正确表达。结论成功地克隆真核表达重组质粒HSP70／pAAV-MCS,为下一步研究HSP70在肾脏缺血预适应的作用及其机制打下基础。     

GDNF基因逆转录病毒表达载体的构建与鉴定

应用基因重组技术将大鼠 GDNF c DNA克隆到逆转录病毒载体 p L XSN中 ,用限制性内切酶酶切分析重组质粒p L XSN-GDNF中 GDNF基因的插入方向 ,用 PCR、斑点杂交和 Southern杂交对重组质粒作进一步鉴定。结果表明 :GDNF c D-NA已正确地克隆到逆转录病毒载体 p L XSN中而构建成重组逆转录病毒载体 ,成功构建的真核细胞表达载体可作为基因治疗的高效基因转移载体。本研究为进一步开展 GDNF基因治疗 Parkinson' s disease和 Alzheimer' s disease等中枢神经系统疾病提供了资料。     

hTrx基因重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的 :构建携带人Trx(硫氧还蛋白 )基因的逆转录病毒载体。方法 :用DNA重组技术 ,将人Trx基因定向克隆入逆转录病毒载体pLXSN ,用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切鉴定。以磷酸钙转染法 ,将重组的逆转录病毒载体转染入包装细胞系PA317,并用G4 18筛选的方法测定转染细胞上清中病毒的滴度。结果 :构建了重组逆转录病毒载体 ,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切 ,电泳出现两个条带 ,分别为 0 .3kb和 5 .9kb。转染细胞上清中病毒滴度为 5 .5× 10 9cfu/L。提示构建携带人Trx基因的逆转录载体成功。结论 :携带人Trx基因的逆转录病毒载体成功构建为Trx基因的治疗、实验研究奠定了基础     

DOC-1R基因重组表达载体构建及其在HeLa细胞中的表达

目的 构建人DOC-1R基因重组逆转录病毒表达载体,实现该基因在体外培养细胞中的大量表达,从而研究表达蛋白的功能。方法 通过重组技术将含有FLAG标签序列的DOC-1R cDNA编码区全长克隆至逆转录病毒载体pLXSN,菌落PCR鉴定、限制性内切酶双酶切及测序验证重组载体的构建。将重组载体转染至GP-293细胞进行病毒包装并以所包装的病毒感染HeLa细胞,通过Western blot及间接免疫荧光染色检测重组DOC-1R蛋白的表达及细胞内定位。结果 测序结果表明重组载体中插入的重组片段序列及开放阅读框架正确,逆转录病毒表达载体pLXSN-FLAG-DOC-1R成功构建。Western blot及间接免疫荧光染色结果证实,逆转录病毒介导的重组DOC-1R蛋白在HeLa细胞中高效表达,表达效率明显高于真核表达载体介导的重组蛋白表达。结论 DOC-1R基因逆转录病毒表达载体成功构建,重组蛋白在体外培养细胞正确高效表达。     

人RUVBL2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建带有绿色荧光蛋白的RUVBL2真核表达载体pEGFP-N1-RUVBL2,并鉴定其在HeLa细胞中的表达。方法:以pGADT7-RUVBL2质粒为模板,PCR扩增RUVBL2基因,首先克隆至T载体中,进一步亚克隆至p-EGFP-N1,并对重组表达载体进行酶切及测序鉴定。采用脂质体转染法将重组质粒瞬时转染HeLa细胞系,应用荧光显微镜观察绿色荧光融合蛋白的表达,并用Western blot法检测RUVBL2-GFP融合蛋白的表达。结果:经限制性酶切鉴定及测序分析证实pEGFP-N1-RUVBL2载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的HeLa细胞中有绿色荧光蛋白的表达,Western blot法证实转染细胞中能表达RUVBL2-GFP融合蛋白。结论:pEGFP-N1-RU-VBL2表达载体构建成功,并在HeLa细胞内成功表达。     

乙型肝炎病毒C基因重组逆转录病毒的构建和在真核细胞的表达

目的　构建含HBVC基因的重组逆转录病毒以用于慢性乙型肝炎的免疫治疗。方法　用PCR法扩增HBV的C基因片段 ,定向插入逆转录病毒质粒载体pLXSN中 ,重组质粒用脂质体转染包装细胞PT67,G418筛选抗性细胞 ,用抗性细胞培养上清液中的重组病毒感染NIH3T3、EL4和鼠骨髓来源的树突状细胞 (DC) ,用PCR检测目的基因的插入 ,用间接免疫荧光和流式细胞仪检测目的基因的表达 ,基因修饰的DC免疫C57BL 6鼠观察其诱导细胞免疫的能力。结果　含HBVC基因重组质粒载体经PCR、酶切和序列分析鉴定为阳性 ,转染PT67后经G418筛选获得抗性细胞 ,抗性细胞培养上清液中含有重组逆转录病毒 ,病毒效价达 3× 10 5CFU ml,感染NIH3T3和EL4细胞后PCR鉴定含目的基因 ,间接免疫荧光、流式细胞仪鉴定有HBcAg表达 ,基因修饰后的DC免疫C57BL 6鼠能诱导特异性CTL应答。结论　构建的HBVC基因重组逆转录病毒可将目的基因转移至真核细胞并得到有效表达     

胶质瘤的白细胞介素-4免疫基因治疗实验研究

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤。本研究通过逆转录病毒载体将白细胞介素 4 (IL 4 )基因导入逆转录病毒包装细胞 ,注入到脑内荷瘤大鼠肿瘤组织中 ,观察其对胶质瘤的治疗作用。首先构建和鉴定携带IL 4基因的逆转录病毒载体Pbabe IL 4 ,将其导入逆转录病毒包装细胞PA317,通过G4 18抗性筛选 ,得到携带目的基因的包装细胞 ;应用NIH3T3细胞测定抗性细胞克隆上清的病毒滴度 ,扩增培养高滴度产毒细胞克隆 ,命名为PA317IL 4 ;常规提取PA317IL 4细胞基因组总RNA ,通过RTPCR鉴定IL 4基因的整合 ;ELISA法检测PA317IL 4细胞培养上清的I…     

含稳定整合pMCLacI/Neo质粒的NIH3T3细胞体外突变研究模型的建立

目的　建立一个用于比较研究哺乳动物细胞内表达基因和沉默基因的突变机理的实验模型。方法　以脂质体转染法将线性化的 p MCL ac I/Neo质粒导入 NIH3T3细胞 ,用 G418筛选 ,选择一个药物抗性细胞克隆进行扩增 ,用基因组 Southern杂交 ,RT- PCR及 RT- PCR Southern杂交进行分子鉴定。结果　 (1)在此细胞克隆的基因组中整合有 p MCL ac I/Neo质粒 ;(2 )该质粒上的两个 lac I靶基因中 ,有一个在 NIH3T3细胞内处于转录表达状态 ;(3)可以通过酶切环化的方法从阳性细胞克隆的基因组 DNA中回收出结构完整、功能正常的 p MCL ac I/Neo质粒。结论　建立了在基因组中整合有 p MCL ac I/Neo质粒的NIH3T3细胞系 ;两个 lac I靶基因可分别模拟哺乳动物细胞内表达基因和沉默基因的功能状态 ;可以将该细胞系用作研究哺乳动物细胞内表达基因和沉默基因的不同突变机理的实验模型。     

ErbB-3 结合蛋白 Ebpl 对 NIH3T3 细胞生长增殖的影响

目的:探讨 erbB-3 结合蛋白 Ebpl 对 NIH3T3 细胞生长增殖的影响.方法:将真核表达质粒 pEGFP-C1 和 Ebpl 基因经双酶切后用 T4 连接酶连接,并经鉴定序列正确后,用脂质体转染剂 Lipofectin Reagent 稳定转染 NIH3T3 细胞,免疫细胞化学显色,在激光共聚焦扫描显微镜下观察 Ebpl 蛋白的表达和定位;通过平板集落形成率观察细胞生长增殖能力的改变.结果:重组质粒鉴定正确,成功构建 Ebpl 稳定表达的 NIH3T3 细胞系,并在显微镜下可见绿色荧光,免疫细胞化学显色可见 Ebpl 蛋白表达;转染目的基因的细胞克隆形成率明显升高.结论:成功构建 Ebpl 稳定表达细胞系,Ebpl 融合蛋白表达于胞质,呈不均匀颗粒状、环状分布;Ebpl 在体外能增强 NIH3T3 细胞生长增殖.     

趋化因子受体CCR5反义RNA在真核细胞中的表达

目的 构建趋化因子受体CCR5反义RNA真核表达载体并获取重组假病毒颗粒以用于抗HIV-1研究，方法 用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞（PBMCs)中获得趋化因子受体CCR5翻译起始区的基因片段，并以正、反两个方面定向插入到真核表达载体pLXSN上，重组载体用脂质体转染剂（lipofectAMINE)转染PA317包装细胞，抗-G418克隆的细胞上清经逆转录后用荧光定量PCR（FQ-PCR）测定假病毒滴度，进一步感染NIH/3T3细胞。结果 CCR5正、反义RNA的真核表达载体。经PA317细胞包装形成的假病毒颗粒已成功地感染NIH/3T3细胞，目的基因在该细胞中得到整合与表达。结论 从PBMCs中获得的趋化因子受体CCR5基因片段通过逆转录病毒载体可转移至真核细胞中并得到表达，为进一步研究CCR5反义RNA的抗HIV-1作用奠定了基础。     

Septin8红色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的septin8红色荧光蛋白融合表达载体（pmCherry—C2／septin8），并观察其在细胞内的表达和定位情况。方法采用PCR的方法从人脑胶质细胞瘤eDNA文库中扩增获得septin8基因编码区序列，将其克隆至红色荧光蛋白载体pmCherry—C2上，重组质粒经PCR、酶切以及序列分析正确无误后转染NIH3T3细胞，并利用Westernblotting和细胞免疫化学技术分析重组蛋白在细胞内的表达和定位。结果重组pmCherry—C2／septin8融合蛋白在NIH3T3细胞中得到高量表达且主要分布于细胞浆。结论成功构建了pmCherry—C2／septin8融合表达载体，该载体能在哺乳动物细胞NIH3T3中表达，为进一步研究septin8细胞内生物学功能打下了良好的基础。