人角质形成细胞蛋白质双向电泳技术的建立和优化

目的 建立和优化人角质形成细胞蛋白质组研究样品制备方法和双向电泳技术条件.方法 体外无血清培养人角质形成细胞,以裂解液成分、上样量的选择和等电聚焦参数为侧重点,通过比较分析不同条件下电泳图谱,建立最佳双向电泳技术条件.结果 成功建立了人角质形成细胞总蛋白制备方法,优化了人角质形成细胞双相电泳技术,获得了重复性和分辫率都较理想的角质细胞总蛋白质双向电泳图谱.结论 优化后的双相电泳条件为人角质形成细胞蛋白质组学分析奠定基础.     

GSFs细胞蛋白质组双向电泳图谱的建立

目的：建立GSF细胞蛋白质组双向电泳图谱。方法：用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养GSF细胞，胰酶消化后收集细胞，加入细胞裂解液使细胞充分裂解，离心后取上清液进行第一向等电聚焦电泳和平衡，再进行第二向SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）和银染显色及图像扫描与分析。结果：通过对GSF细胞蛋白提取液进行双向电泳，在17cm pH5～8IPG胶条上可得到重复性及分辨率均较好的蛋白位点。结论：GSF细胞蛋白质组双向电泳图谱的建立。为其蛋白质组学的进一步研究奠定了基础。     

白藜芦醇对HeLa细胞蛋白质组影响的研究

[目的]应用双向电泳及质谱技术研究白藜芦醇(Resveratrol,Res)对宫颈癌HeLa细胞蛋白质组的影响。[方法]经磺基罗丹明B(sulforhodamine B ,SRB)法筛选对宫颈癌HeLa细胞有效的白藜芦醇浓度,流式细胞仪检测有效白藜芦醇浓度对HeLa细胞周期和凋亡的影响。HeLa细胞经白藜芦醇处理后,提取细胞总蛋白,应用双向电泳技术建立蛋白质组图谱,筛选白藜芦醇处理前后差异在2倍以上的蛋白质作为差异蛋白,进行质谱鉴定和生物信息学分析。[结果]50μmol/L以上浓度白藜芦醇24小时对HeLa细胞的活性产生影响,将细胞阻滞在S期,诱导HeLa细胞的早期凋亡,并呈剂量依赖性。通过差异蛋白质组分析筛选出12个差异蛋白质,包括原肌球蛋白、细胞核糖核蛋白C、锌指蛋白、钙连接蛋白、微管蛋白β、热休克蛋白70、α烯醇化酶、丙酮酸激酶、雌激素受体β、氨基甲酰磷酸合成酶,HeLa细胞经白藜芦醇处理后这些蛋白表达量均增加。[结论]白藜芦醇可能通过参与调节细胞的转移分化、凋亡、能量代谢等过程而起到抗肿瘤作用。     

血清蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立

目的：建立血清蛋白质组双向凝胶电泳（2-DE）技术。方法：对血清蛋白质2-DE的各种条件进行调整、优化。结果：建立了稳定的2-DE技术。结论：已建立的血清蛋白质2-DE技术，将为进一步开展疾病的血清蛋白质组学研究奠定基础。     

血清蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立

目的建立血清蛋白质组双向凝胶电泳(2-DE)技术.方法对血清蛋白质2-DE的各种条件进行调整、优化.结果建立了稳定的2-DE技术.结论已建立的血清蛋白质2-DE技术,将为进一步开展疾病的血清蛋白质组学研究奠定基础.     

胃腺癌组织蛋白质双向电泳图谱分析

目的　利用蛋白质组学方法建立分辨率高和重复性好的人胃腺癌组织及其正常胃黏膜组织的双向凝胶电泳图谱 ,并分析其差异表达的蛋白质 ,以期用于早期诊断。方法　采用固相pH梯度(immobilizedpHgradient,IPG)双向凝胶电泳 (two -dimensionalgelelectrophoresis ,2 -DE)分离人胃腺癌组织及正常胃黏膜组织的总蛋白质 ,凝胶经银染显色后 ,ImagingMaster 2D图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质。结果　 ( 1 )得到了分辨率较高、重复性较好的人胃腺癌组织和正常胃黏膜组织的双向凝胶电泳图谱 ,癌组织和正常胃黏膜组织凝胶的平均蛋白质点数分别为 1 0 4 9± 67和 1 0 97± 73,平均匹配的点数分别为 835± 48和 95 3± 5 6,匹配率分别为 79.6%和 86.7% ;同一组织凝胶在蛋白质点位置上有较好的重复性 ,不同凝胶间蛋白质点在等电聚焦 (isoelectricfocusing ,IEF)方向的偏差是 0 .873±0 .1 2 5mm ,在十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sodiumdodecylsulfate -polyacrylamidegelelectrophore sis ,SDS -PAGE)方向上的偏差为 1 .0 2 5± 0 .2 1 3mm。 ( 2 )通过比较分析 5例胃腺癌组织及正常胃黏膜组织的双向凝胶电泳图谱 ,得到平均匹配蛋白质点数为 769± 45 ,差异表达蛋白质点数为 81 ,其中 1 7个点仅     

人肝癌细胞株QGY-7701亚细胞蛋白质组双向电泳技术的建立

目的优化人肝癌细胞株QGY-7701的蛋白质样品制备方法,建立其亚细胞蛋白质组双向电泳技术。方法分步提取人肝癌细胞株QGY-7701细胞质、细胞膜和细胞核蛋白,采用不同的方法除盐、浓缩样品,然后分别采用2种不同的水化上样缓冲液重悬样品,进行双向凝胶电泳。结果使用三氯乙酸/丙酮的除盐效果好,样品损失少;采用上样缓冲液(7mol/L尿素 2mol/L硫脲 4%CHAPS 40mmol/L Tris 65mmol/L DTT 2%两性电解质)有利于蛋白的溶解,获得更多的蛋白信息,检出的细胞质蛋白点数可达(995±53),细胞膜蛋白点数可达(1035±58),细胞核蛋白点数可达(893±45)。结论获得了清晰的人肝癌细胞株QGY-7701亚细胞蛋白质组双向电泳图谱。     

双向电泳分析精索静脉曲张不育患者精浆蛋白质的表达差异

目的:初步观察精索静脉曲张不育患者与正常成人精浆中蛋白质的差异表达,为进一步探讨精索静脉曲张导致不育的分子机制奠定基础.方法:应用蛋白质组学的双向电泳技术,对精索静脉曲张患者与正常成人精浆蛋白质表达进行比较,观察其差异点.结果:得到分辨率和重复性均好的精索静脉曲张患者与止常成人精浆蛋白的双向凝胶电泳图谱,发现二者之间在表达上有明显差异,差异表达蛋门质点数共38个.结论:精索静脉曲张患者导致不育可能与精浆中某些蛋白质的表达和修饰改变有关,对这些差异蛋白质点的进一步分析有助于揭示精索静脉曲张导致男性不育的分子机制.     

低浓度三氯乙烯诱发L-02肝细胞蛋白质组异常表达

【目的】研究低剂量三氯乙烯对人L-02肝细胞蛋白质表达谱的影响，以助于阐明三氯乙烯引起细胞早期应答反应的分子机制。【方法】L-02肝细胞暴露于低剂量（3μmol／L）三氯乙烯24h后，提取细胞总蛋白，双向电泳分离蛋白质，软件分析凝胶图像，基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-TOF-MS）对相关异常变化斑点进行鉴定。【结果】和对照组比较，低剂量三氯乙烯处理后L-02肝细胞蛋白质表达发生改变，初步鉴定出7个差异蛋白。低剂量三氯乙烯刺激后，上调的蛋白有核糖体样蛋白（similar to ribosomal protein）和SET protein，下调的蛋白有异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，NADP）和腺苷二磷酸-核糖基化因子鸟苷酸因子6（ADP-ribosylation factor guanine nucleotide factor 6），微管-肌动蛋白交叉连接因子1（microtubule-actin crosslinking factor 1）特异表达，肽基脯氨酰顺-反异构酶PPI（peptidyl pmlyl cis／tralls isomerase）缺失。【结论】低剂量的三氯乙烯处理后，L-02肝细胞中的蛋白表达谱发生明显变化，这为三氯乙烯毒作用机制的进一步研究提供了线索。     

人睾丸胚胎性癌蛋白质组的双向电泳分析及质谱鉴定

目的 应用双向电泳和质谱技术研究人睾丸胚胎性癌蛋白质组.方法 利用固相PH梯度双向凝胶电泳技术进行分离,凝胶经银染显色后,用PDQuest 7.30软件分析2-DE图谱.选择在睾丸胚胎性癌图谱中高表达的3个蛋白点酶解,应用基质辅助激光解析电离飞行时间/飞行时间(MALDI-TOF/TOF)仪器进行串联质谱(MS/MS)鉴定.结果 双向电泳成功有效筛选出差异蛋白点,并成功鉴定3种蛋白质.结论 双向电泳和质谱技术可有效研究睾丸胚胎性癌总蛋白质,为从蛋白质组水平研究睾丸胚胎性癌蛋白质的表达改变提供了新的方法和途径.

Abstract：

Objective To separate and identify human testicular embryonal carcinoma proteomics using two-dimensional electrophoresis (2-DE) and mass spectrometry. Methods Immobilized pH gradient two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis was used to separate the total proteins of the samples. After silver staining, PDQuest 7.30 image analysis software was applied to analyze the 2-DE images. Three of the proteins highly expressed in human testicular embryonal carcinoma were identified by matrix-assisted laser adsorption/ionization-time of flight-tandem mass spectrometry (MALDI-TOF-MS/MS). Results 2-DE effectively screened the differentially expressed proteins in the carcinoma tissues.Three proteins highly expressed in the carcinoma were successfully identified. Conclusion The proteins of human testicular embryonal carcinoma can be effectively separated and analyzed using 2-DE and mass spectrometry. Proteomic analysis offers a new means for further study of this carcinoma.     

结核病患者和正常人血清蛋白质双向凝胶电泳差异比较

目的 初步探讨结核病患者与正常人之间血清蛋白质的差异,以期筛选出新的结核病实验诊断标志物。 方法 对10例菌阳肺结核（+组）、10例菌阴肺结核（－组）、10例肺外结核（肺外组）及10例正常人（正常组）分组混合血清应用17cm pH4-7 IPG胶条进行双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）,每组平行电泳3块胶条。电泳结束后对2-DE胶条进行考马斯亮蓝染色,染色后用Umax powerlook2000扫描仪以投射方式、300dpi分辨率扫描获取2-DE图谱,然后用2-DE分析软件ImageMaster 2D Platium5.0进行分析。 结果 在正常组、＋组、-组、肺外组中,分别平均可以检测到310±64、307±33、296±54、267±23个清晰可见的蛋白质点。正常组与＋组、-组、肺外组的匹配率分别为(74±2)%、(76±2)%和(68±5)%。通过对4组2-DE图谱比较,＋组与正常组间有21个差异蛋白质点（其中9个上调）,-组与正常组间有18个差异蛋白质点（其中8个上调）,肺外组与正常组间有24个差异蛋白质点（其中7个上调）。将＋组、-组、肺外组合并为结核组与正常组比较有3个差异蛋白质点（其中2个上调）。 结论 结核病患者和正常人血清蛋白质存在差异,有望从血清中筛选出新的结核病实验诊断标志物。本研究建立了两者间血清蛋白质组差异蛋白质的初步模型,但有待进一步验证并进行差异蛋白质鉴定。     

双向凝胶电泳分析脾脏蛋白组学的方法研究

目的优化双向凝胶电泳的实验步骤,总结一套适用脾脏组织的双向凝胶电泳技术。方法对双向电泳实验中的关键环节：蛋白沉淀方法;胶条PH的选择;聚焦条件等进行研究与优化,考马斯亮蓝染色后进行凝胶图像比较。结果Cleaningup沉淀蛋白,聚焦电压达到11000伏小时（110kvhs）,可以得到多达1000个蛋白点的2Dgel（two—dimensionalpolyacrylamidegel）。结论建立了脾脏双向电泳的具体方法,得到分辨率高重复性好的2Dgel,为脾脏的蛋白质组学研究奠定了基础。     

结肠癌蛋白质双向电泳技术的建立

目的:建立结肠癌双向电泳技术.方法:利用不同体积的裂解液提取结肠癌中的蛋白质,并通过不同的蛋白质上样量(1mg,2mg,3mg),不同样品制备方式,进行双向电泳,考马斯亮蓝染色,图谱分析.结果:在等电点3～10,分子量6.5～200ku范围内分离得到蛋白质斑点为,1mg蛋白质上样量为658个蛋白质斑点,2mg为820个,3mg为845个斑点.2mg蛋白质上样量的双向电泳图谱更清晰,分离更好.制备方式2可以满足双相电泳的需要.结论:成功建立了结肠癌蛋白质的双向电泳技术.     

双向电泳技术分析大鼠快慢肌蛋白的表达差异

目的：建立骨骼肌蛋白分离的双向电泳（2-DE）技术体系，分析趾长伸肌与比目鱼肌中快慢肌蛋白的表达。方法：提取大鼠趾长伸肌和比目鱼肌的总蛋白，定量，然后进行第一向等电聚焦0EF）和第二向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术分离总蛋白，GS-800获得凝胶图像，并测量不同凝胶间蛋白斑点在IEF和SDS-PAGE方向上的位置偏差，使用PDQuest7．3软件对凝胶图像进行分析，找出趾长伸肌与比目鱼肌蛋白表达的差异。结果：在趾长伸肌和比目鱼肌组织的蛋白表达谱上，分别检测到680±19和660±27个蛋白点，平均匹配点数为590±13和580±17，匹配率达86．7％和87．8％，不同凝胶间蛋白质点在IEF方向的偏差为（0．51±0．48）mm，在SDS-PAGE方向上的偏差为（0．53±0．42）mm，对比分析趾长伸肌和比目鱼肌组织的2-DE图谱，发现有27个点存在明显的表达差异，在比目鱼肌中高表达的点有12个，在趾长伸肌中高表达的点有15个。结论：建立了骨骼肌蛋白分离的双向电泳技术体系，发现成年大鼠趾长伸肌和比目鱼肌的双向电泳图谱相似，但是有部分蛋白质点存在表达差异．这些差异表达的蛋白，可能与快慢肌本身的生理特性相关。     

子宫肌瘤蛋白质组研究中二维电泳方法的建立

目的:建立并优化用于子宫肌瘤蛋白质组分析的二维电泳技术,提高其分辨率和重复性.方法:以固相pH梯度等电聚焦为第一向,采用垂直十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳为第二向,并对关键步骤如样品的溶解、上样量、电泳参数和染色方法进行一系列的优化.结果:获得质量较好的子宫肌瘤和正常肌层的二维电泳图谱.结论:采用蛋白溶解度增强的裂解液分步提取组织的蛋白质,有利于二维电泳图谱的完整性;RC DC蛋白定量方法是二维电泳较为理想的蛋白定量方法,直接关系到上样量;质谱兼容银染法并不降低蛋白斑点的分辨率;窄范围(pH 4～7)的IPG胶条较宽范围(pH 3～10)的IPG胶条具有较高的分辨率.     

白念珠菌总蛋白质组二维电泳条件的建立和优化

目的:建立并优化白念珠菌总蛋白质组分析的二维电泳条件.方法:以白念珠菌国际标准菌株SC5314为材料,制备其总蛋白质组样品.以真菌细胞破碎方法、裂解液成分、上样量、固相pH梯度胶条的选择为侧重点,通过不同条件下电泳图谱的比较建立最佳二维电泳技术条件.结果:成功建立白念珠菌总蛋白质制备方法,优化了白念珠菌蛋白质组分析的二维凝胶电泳技术,获得重复性和分辨率都较理想的白念珠菌总蛋白质二维电泳图谱.结论:优化后的二维电泳条件符合白念珠菌的特点,为白念珠菌蛋白质组分析奠定基础.     

同型半胱氨酸刺激大鼠动脉平滑肌细胞增生功能蛋白质组的初步研究

目的：通过同型半胱氨酸(Hcy)刺激前后大鼠动脉平滑肌细胞中蛋白质表达的变化，探讨Hcy引起动脉平滑肌细胞增生的机制。方法：对大鼠动脉平滑肌细胞进行原代培养，取Hcy刺激前后的细胞提取蛋白质，利用二：维电泳的方法得到细胞蛋白质电泳图谱，通过计算机图像分析系统进行分析。结果：Hcy刺激前后，大鼠动脉平滑肌细胞中有28种蛋白质发生了改变，其中有11种在刺激后表达量增加，1种表达量减少，4种刺激后消失，12种在刺激后新出现。结论：Hcy刺激后大鼠动脉平滑肌细胞中蛋白质的表达发生改变，考虑这些蛋白质与平滑肌细胞增生有关。     

儿童微小病变型肾病综合征尿蛋白组的双向电泳及PDQuest图像初步分析

目的:建立儿童微小病变型肾病综合征尿蛋白组分析所需的固相pH梯度等电聚焦双向电泳及相关技术.方法:冷丙酮萃取肾病综合征患儿尿蛋白,去除白蛋白等高丰度蛋白、除盐,以固相IPG pH梯度等电聚焦为第一向,均一SDS胶聚丙烯酰胺凝胶(T=10%)为第二向,银染后PDQuest软件进行分析.结果: 成功得到儿童微小病变型肾病综合征尿蛋白双向电泳图谱.尿蛋白用17 cm,pH3-10L(线性)的IPG胶条进行二维电泳时上样量100 μg,60 000 Vh的等电聚焦是恰当的.PDQuest7.3软件进行图像分析,检测到400个蛋白点.结论:用尿蛋白组学对儿童微小病变型肾病综合征的尿液进行研究是可行的.为今后从更高的水平来寻找肾脏疾病的功能蛋白和特异性蛋白质,阐明肾脏疾病发生发展的网络机制等后续研究提供了可能性.     

大肠侧向发育型肿瘤细胞株双向电泳技术成功建立

目的:建立侧向发育型肿瘤细胞(LST)株双向电泳技术.方法:提取LST细胞株总蛋白质,采用不同pH范围IPG胶条进行LST细胞株总蛋白质双向电泳,并对实验步骤进行一系列的调整优化.结果:获得了较为清晰的LST细胞株双向电泳图谱,采用pH 3～10线性IPG胶条分离出1356±43个蛋白质斑点;pH 4～7 IPG胶条两种上样量(250μg和150μg)分别分离出了1285±51和989个蛋白质斑点.结论:通过相关条件的调整优化,成功建立了双向电泳技术,为研究LST特殊性生物学行为相关蛋白质奠定了坚实的基础.