膜蛋白双向电泳技术在软骨细胞相关研究中的应用

目的 探索应用双向电泳技术研究人类关节软骨细胞膜蛋白蛋白组学的可行性及膜蛋白双向电泳与总蛋白电泳技术的互补性.方法 取材膝关节软骨组织,应用Ⅱ型胶原酶/透明质酸酶DMEM溶液消化法分离软骨细胞,分别提取总蛋白和膜蛋白,进行双向电泳研究,观察膜蛋白所生成2-DE电泳凝胶的图像质量,并对比膜蛋白与总蛋白双向电泳凝胶图像之间蛋白点分布的差异和互补性.结果 膜蛋白双向电泳可获得较高质量的电泳图像,每张胶图可识别412.3±13.5个蛋白点,蛋白点主要分布在等电点PH5.0-9.0的偏碱性区域.总蛋白双向电泳凝胶可识别564.31±5.9个蛋白点,蛋白点主要分布在等电点PH3.0-7.0的偏酸性区域.结论 软骨细胞膜蛋白双向电泳可产生高质量的凝胶图像,其分离蛋白质的等电点分布区域与总蛋白双向电泳技术形成互补,可为软骨细胞为样本的相关疾病病因学研究提供更多的信息.     

利用亚细胞组分蛋白分离技术有效提取细胞骨架及其相关蛋白

目的建立一种可用于后续双向电泳研究的细胞骨架及相关蛋白的提取方法。方法采用亚细胞组分蛋白分步提取方法,
根据提取过程中细胞形态变化,提取后组分蛋白电泳图谱等优化提取条件。用双向凝胶电泳、免疫印迹分析、蛋白质点质谱鉴
定等方法验证该提取方法的重复性和各组分蛋白提取纯度。结果各组分蛋白的双向电泳蛋白图谱差异明显,具备各自特征性
的蛋白点分布,各组分标志蛋白FAK、Integrin-β1、Histone H1和cytokeratin 19分别只表达在细胞浆、细胞膜、细胞核和细胞骨架
组分。细胞骨架蛋白组分中约90%以上的蛋白质点经质谱鉴定为细胞骨架及相关蛋白。结论亚细胞组分蛋白顺序提取方法
具有较好的重复性,提取组分选择性较高,并且能够有效提高低丰度蛋白的检出效率,是一种比较理想的进行蛋白质组学研究
的样本预处理方法。
     

RASSF1A表达或缺失的两类早期肺腺癌组织差显蛋白的筛选与鉴定

目的:建立RASSFlA表达或表达缺失的两类不同早期肺腺癌组织蛋白质的双向电泳凝胶图谱.筛选并鉴定存在明显表达差异的蛋白质.方法:采用Western印迹技术,从RASSFlA转录缺失和RASSFIA转录正常的早期肺腺癌标本中筛选出RASSFlA表达和表达沉默的癌组织各5例.提取组织可溶性总蛋白,采用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离总蛋白,建立两类不同早期肺腺癌组织蛋白质的双向电泳凝胶图谱;PDQuest凝胶图像分析软件比较分析,筛选出差异表达的蛋白质点;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱获得相应蛋白质点的肽质量指纹图谱;搜索蛋白质数据库鉴定差异表达的蛋白质.结果:建立了重复性较好的RASSFIA表达或表达缺失的两类不同早期肺腺癌组织蛋白质双向电泳凝胶图谱;筛选出存在明显表达差异的蛋白质点17个,挖取其中的9个进行质谱分析,9个蛋白质点均得到了满意的肽质量指纹图谱;搜索蛋白质数据库鉴定出5种蛋白质,分别是:细胞色素b5(cytochrome b5),60S磷酸核楮体蛋白P2(60S acidic ribosomal protein P2),碳酸酐酶1(carbonic anhydrase-1),5-吡咯啉羧酸还原酶1(pyrroline-5-carboxylate reductase-1)和载脂蛋白A-I前体蛋白(apolipoprorein A-I precursor).结论:成功建立了RASSFlA表达或表达缺失的两类不同早期肺腺癌组织蛋白质的双向电泳凝胶图谱,从中鉴定出5种存在明显表达差异的蛋白质,为进一步研究RASSFIA作用的信号转导途径奠定了初步的基础.     

白藜芦醇对HeLa细胞蛋白质组影响的研究

[目的]应用双向电泳及质谱技术研究白藜芦醇(Resveratrol,Res)对宫颈癌HeLa细胞蛋白质组的影响。[方法]经磺基罗丹明B(sulforhodamine B ,SRB)法筛选对宫颈癌HeLa细胞有效的白藜芦醇浓度,流式细胞仪检测有效白藜芦醇浓度对HeLa细胞周期和凋亡的影响。HeLa细胞经白藜芦醇处理后,提取细胞总蛋白,应用双向电泳技术建立蛋白质组图谱,筛选白藜芦醇处理前后差异在2倍以上的蛋白质作为差异蛋白,进行质谱鉴定和生物信息学分析。[结果]50μmol/L以上浓度白藜芦醇24小时对HeLa细胞的活性产生影响,将细胞阻滞在S期,诱导HeLa细胞的早期凋亡,并呈剂量依赖性。通过差异蛋白质组分析筛选出12个差异蛋白质,包括原肌球蛋白、细胞核糖核蛋白C、锌指蛋白、钙连接蛋白、微管蛋白β、热休克蛋白70、α烯醇化酶、丙酮酸激酶、雌激素受体β、氨基甲酰磷酸合成酶,HeLa细胞经白藜芦醇处理后这些蛋白表达量均增加。[结论]白藜芦醇可能通过参与调节细胞的转移分化、凋亡、能量代谢等过程而起到抗肿瘤作用。     

宫颈永生化细胞和癌细胞的胞质蛋白双向电泳图谱的建立及初步分析

目的:建立HPV-16阳性的宫颈上皮永生化细胞(H8细胞株)和宫颈癌细胞(CaSKi细胞株)胞质蛋白双向电泳图谱,并初步分析找出特征性的差异蛋白点.方法:分别培养H8和CaSki细胞,用亚细胞结构蛋白质提取试剂盒提取胞质蛋白进行双向电泳,用ImageMaster 2D V2002.1图像分析软件分析电泳图谱,筛选差异蛋白点.结果:获得了分辨率和重复性均较好的宫颈永生化细胞和癌细胞胞质蛋白2-DE图谱,并分析找出了显著的差异蛋白点8个,其中3种蛋白质在宫颈癌细胞株表达上调,1种蛋白质表达明显下调,2种蛋白质在宫颈癌细胞株表达缺失,2种蛋白质在永生化细胞株表达缺失.结论:应用亚细胞蛋白双向凝胶电泳技术对HPV-16阳性的宫颈癌前和癌变的胞质蛋白分析,能有效找出蛋白质表达差异点,为进一步确定宫颈癌前病变和癌细胞的关键性差异蛋白质的结构和功能奠定了基础.     

人急性早幼粒HL60细胞双向电泳条件的优化

目的:比较不同蛋白提取方式和不同电泳条件下HI60细胞全蛋白的双向电泳结果,寻找新的针对HL60细胞省时高效的双向电泳条件.方法:分别采用标准蛋白提取,三氯乙酸/丙酮沉淀和超声破碎三种不同蛋白提取方法,在传统双向电泳和改良双向电泳条件下做对比,并做蛋白点数和凝胶重复性分析.结果:在传统等电聚焦条件下,双向电泳凝胶图谱两端均出现大量横纹和阴影,分离效果较差.采用改良双向电泳条件后,三种蛋白提取方法的蛋白分离效果均明显改善,重复性提高,并且省时、可靠.其中,标准蛋白提取优于三氯乙酸/丙酮沉淀和超声破碎两种蛋白提取方法,蛋白点数即可达到(1102±7)个,重复性为(74.8±6.4)%,基本满足后续蛋白点的筛选和比对.三氯乙酸/丙酮沉淀法可造成部分蛋白损失,仅能分离出(844±15)个蛋白点.超声破碎法虽然使得蛋白点数明显增多,但可重复性明显下降,还不足40%.结论:采用标准蛋白提取法和改良的电泳条件,可以省时、高效地分离HL60细胞全蛋白.     

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞双向电泳分析

目的 分析系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞蛋白质表达谱的变化.方法 分别抽取系统性红斑狼疮患者及健康对照者外周血,分离单个核细胞,抽提总蛋白,进行双向电泳,电泳胶银染显色,用ImageMasterTM 2D Platinum 5.0软件对获得的蛋白图谱加以分析,寻找差异表达的蛋白质.结果 对照组凝胶蛋白点匹配率为(71±4)%,SLE组匹配率为(72±4)%.对照组凝胶共检出蛋白点(791±17)个,SLE组检出(781±17)个.有11个蛋白点在SLE患者组表达上调,9个表达下调.结论 SLE患者外周血单个核细胞蛋白质表达发生了明显改变,为从淋巴细胞蛋白质谱变化的整体角度上阐明SLE发生的分子机制及免疫调控通路奠定了基础.     

人结肠腺癌Lovo细胞系蛋白质双向凝胶电泳技术的建立及其优化

目的优化人结肠癌Lovo细胞系的蛋白质样品制备方法,建立人结肠癌Lovo细胞系的双向凝胶电泳(2-DE)图谱.方法分别用磷酸盐缓冲液和等渗蔗糖溶液冲洗细胞,胰酶酶解后裂解和皿上直接裂解的方法提取所培养Lovo细胞的总蛋白质,利用固相pH梯度双向凝胶电泳技术进行分离,凝胶经银染显色后,用Melanie 4软件分析2-DE图谱.结果以等渗蔗糖缓冲液冲洗细胞并经皿上直接裂解的方法所提取Lovo细胞总蛋白质进行双向电泳,可获得分辨率高、重复性好的人结肠癌Lovo细胞系2-DE图谱.结论以等渗蔗糖溶液冲洗细胞结合皿上直接裂解是一种较好的细胞蛋白质双向电泳样品制备方法,初步建立了分辨率较高且重复性好的人结肠癌Lovo细胞系蛋白质双向凝胶电泳图谱.     

Proteomics of leukemia K562 cells treated by extracts of Yiyebaijiang ( Patrinia heterophylla)

目的 研究异叶败酱提取物作用于人白血病K562细胞的分子机制.方法 以异叶败酱提取物作用于K562细胞后提取细胞总蛋白,用双向电泳对蛋白进行分离,对异叶败酱提取物处理前后的K562细胞总蛋白双向电泳图谱进行差异分析,通过质谱技术鉴定差异明显的蛋白质.结果 通过对比分析异叶败酱提取物处理前后的白血病K562细胞总蛋白双向电泳图谱,发现异叶败酱提取物处理组中有23个蛋白点发生了明显改变.经质谱和Mascot软件分析,成功鉴定了3个蛋白质,分别为热休克蛋白90β,甘油醛-3-磷酸脱氢酶,血红蛋白.结论 通过蛋白质组学技术,发现了异叶败酱提取物处理前后白血病K562细胞差异明显的蛋白质点23个,这些差异蛋白质可能是异叶败酱提取物对白血病K562细胞产生增殖抑制、凋亡诱导和诱导分化作用的关键蛋白质.     

重症肌无力胸腺组织蛋白质组双向电泳方法的建立

目的:建立和优化重症肌无力(MG)胸腺组织蛋白质组双向电泳技术方法.方法:提取MG患者(n=3)增生型胸腺组织蛋白,以固相pH梯度胶条做第一向等电聚焦电泳,SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳为第二向.在以上过程中分别对蛋白提取、等电聚焦程序(A、B、C、D)和凝胶染色方法等各个实验环节进行控制和优化,利用PDQuest 7.1.1软件分析获得的二维凝胶图像.结果:①采用一步法提取胸腺组织蛋白质,第一向等电聚焦采用7cm IPG胶条,聚焦程序选择B,硝酸银染色.3例标本重复4次,共获12幅二维凝胶图像.随机选取1例标本的2幅图像,利用软件对2幅中的蛋白点进行匹配,匹配率为82.1%;3份样品共12幅凝胶图像的对比,获得3个共同存在的标志蛋白点,相对分子质量和等电点分别为:A点(82 700,7.0)、B点(50 700,5.76)和C点(33 300,5.02).②进一步优化上述实验条件,选择1例标本,采用两步法提取胸腺组织蛋白质,选用17 cm IPG胶条,聚焦采用程序D,考马斯亮蓝染色,获得的二维凝胶图像与一步法(其他条件相同)比较.一步法可检测到蛋白质点326个,两步法可检测到562个蛋白点.结论:①建立了MG胸腺组织蛋白质组提取的方法.采用两步法可以更有效地提取胸腺组织蛋白质组.②利用优化后的实验方法,获得了MG胸腺组织蛋白二维凝胶图像,为开展MG胸腺组织蛋白质组学研究打下了基础.     

白血病细胞蛋白质组学研究技术体系的建立

目的：建立白血病细胞HL60蛋白质组学研究的技术体系。方法：提取白血病细胞HL60的蛋白质，建立固相pH梯度双向电泳图谱，应用图像扫描仪及图像分析软件获得蛋白质斑点的数字化和匹配性信息，对需鉴定的HL60细胞的蛋白斑点A，经胶内酶切后，行基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱(MALDI-TOF—MS)分析，将检测出的肽质量数输入质谱数据库获得需鉴定的蛋白质信息。结果：成功构建出HL60细胞的双向电泳图谱，并用MALDI—TOF—MS成功鉴定出HL60细胞的一个蛋白质点。结论：HL60细胞蛋白质组学研究体系的建立，为进一步研究白血病的蛋白质组学奠定了基础。     

人胃癌蛋白质组研究技术体系的建立

目的:对传统的双向凝胶电泳技术和计算机图像分析技术进行优化并将其应用于胃癌蛋白质组研究,提高实验数据分辨率和实验结果的可重复性。方法:提取胃癌组织中蛋白质,对以固相pH梯度为第一向双向电泳的关键因素与环节(如样品处理、电泳参数和凝胶浓度等)进行一系列优化。进一步采用双向凝胶电泳分离胃癌组和正常组总蛋白质,银染显色,并通过优化的计算机图像分析软件分析电泳图谱。结果:重复性实验结果显示同组样品在3次不同实验中所得蛋白质斑点数目相对标准差(变异系数平均值%):胃癌组和正常组分别为(23.00±10.11)、(20.33±9.90)。变异系数范围(%):胃癌组和正常组分别为3.80～60.10、2.70～56.89。同一蛋白质斑点在3次实验中等电点、分子量的相对标准差分别为(8.76±5.14)%,(13.00±4.22)%和(10.84±9.16)%。获得了优于传统实验方法的分辨率和可重复性的双向凝胶电泳图谱。结论:优化的双向凝胶电泳和图像分析技术适合于胃癌蛋白质组研究。     

HepG2细胞蛋白质组双向电泳条件的优化与图谱的建立

目的：优化双向电泳的样品处理方法,建立HepG2细胞蛋白质双向电泳图谱。方法：用含10%胎牛血清的RPM11640培养液培养HepG2细胞,胰酶消化后收集细胞,加入细胞裂解液使细胞充分裂解,冰浴超声离心后取上清液进行双向凝胶电泳,电泳图谱经考马斯亮蓝染色及图像扫描与分析。结果：通过对HepG2细胞蛋白提取液进行双向电泳,在13 cm pH 3~10（L）IPG胶条上可分离到（297±23）个重复性及分辨率均较好的蛋白质点,蛋白斑点的匹配率为83%。结论：HepG2细胞蛋白质组双向电泳条件的优化及图谱的建立,为进一步研究肝癌蛋白质组学奠定了基础。     

吗啡耐受大鼠脊髓蛋白质组双向电泳图谱的建立与差异蛋白鉴定

目的：建立吗啡耐受大鼠腰段脊髓组织蛋白质组双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)图 谱,比较分析吗啡耐受大鼠腰段脊髓组织中蛋白质组的变化和差异表达,鉴定出差异表达的蛋白质点并进行验证。 方法：将16只鞘内置管雄性SD大鼠随机分为吗啡耐受组(MT组,n=8)和生理盐水组(NS组,n=8),取其腰段脊髓组织 蛋白以固相pH梯度等电聚焦(immobilized pH gradients isoelectric focusing,IPGIEF)为第一向,十二烷基硫酸钠-聚丙烯 酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electroporesis,SDS-PAGE)为第二向进行2-DE,应用PDQuest分析 软件对考马斯亮蓝染色的2-DE图谱进行图像分析,对差异蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析,并利用Mascot查询软件搜索Swiss- Prot数据库进行生物信息学分析。采用蛋白质印迹法验证部分差异蛋白。结果：MT组和NS组大鼠脊髓组织2-DE图谱 中各分离出约1 000个清晰的蛋白质点,其中明显差异表达的蛋白有36个。采用MALDI-TOF-MS分析,并利用Mascot查 询软件搜索Swiss-Prot数据库,共搜索到14个蛋白质,与NS组比较,MT组中表达下调的蛋白质点有2个,表达上调的 蛋白点有12个。采用蛋白质印迹法对其中的NADH脱氢酶及伽玛烯醇化酶蛋白质点进行验证,结果与蛋白质组学结 果一致。结论：初步建立了吗啡耐受大鼠脊髓组织蛋白质组双向电泳图谱,证明吗啡耐受可以引起脊髓中多种蛋白 质的表达改变。     

不同分化喉鳞状细胞癌蛋白质组差异表达的研究

目的 研究不同分化程度喉鳞状细胞癌黏膜组织蛋白质组的差异表达.方法 用固相pH梯度双向凝胶电泳分离不同分化程度喉癌黏膜组织总蛋白质,行考马斯亮蓝染色,Image Master 2D软件分析所获得的双向凝胶电泳图谱,找出差异表达的蛋白质点.结果 获得分辨率和重复性均较好的双向凝胶电泳图谱,发现13种蛋白质与喉癌分化密切相关.其中有7种蛋白质在高分化喉癌组织中表达上调,6种蛋白质表达明显下调.结论 利用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离不同分化喉鳞状细胞癌黏膜组织总蛋白质,建立了重复性较强的不同分化喉鳞状细胞癌黏膜组织蛋白质组表达图谱,且两者蛋白质的表达明显不同,可能与喉癌不同分化程度的发病机制有关.     

视网膜色素上皮细胞蛋白质组学研究中二维电泳条件的优化

目的:优化并确立一套适合视网膜色素上皮细胞二维电泳的实验方法。方法:提取视网膜色素上皮细胞可溶性蛋白,改进条件以确立对视网膜色素上皮细胞蛋白进行二维电泳的实验流程。结果:该实验条件对视网膜色素上皮细胞蛋白达到了良好的分离效果,并能通过分析找出正常与病变细胞蛋白表达差异。结论:该优化的实验流程能有效分离视网膜色素上皮细胞蛋白质,并为进一步的差异蛋白质组研究奠定基础。     

应用激光捕获显微切割技术纯化的鼻咽癌蛋白质表达谱的建立

目的：建立鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)蛋白质表达谱,为NPC蛋白质组学研究奠定基础。方法：应用激光捕获显微切割（laser capture microdissection,LCM）技术从NPC组织纯化NPC细胞,应用二维凝胶电泳（2-DE）分离LCM 纯化NPC细胞的蛋白质,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定蛋白质,利用生物信息学资源构建NPC的2-DE蛋白质组数据库。 结果：建立了NPC蛋白质2-DE参考图谱,2-DE图谱共显示（1 312±30）个蛋白质点,共鉴定了427个蛋白质点,包括241个非冗余蛋白质,并构建了NPC的2-DE蛋白质组数据库,这些数据可从本实验室网站(http://www.xyproteomics.org)上进行查询。结论：首次建立了LCM纯化NPC细胞2-DE蛋白质表达谱,为NPC蛋白质组学研究提供了重要的信息和资料。     

Hela细胞蛋白质分离和肽质量指纹谱鉴定方法的建立

目的研究Hela细胞总蛋白质的分离及利用肽质量指纹谱对蛋白质进行鉴定的方法。方法提取了Hela细胞的总蛋白质,通过双向电泳技术对蛋白质进行了分离,并应用图像扫描仪及图像分析软件获取蛋白质点的数字化信息。对其中不同丰度的蛋白质点,进行胶内酶切后,通过基质辅助激光解吸/电离直角型飞行时间质谱(MALDIO-TOF-MS)分析,再将检测出的多肽质量数通过Mascot搜索引擎检索NCBInr数据库。结果获得了Hela细胞总蛋白质双向电泳图谱及蛋白质点的数字化信息,通过MALDIO-TOF-MS检测得到的肽质量指纹谱再经过网上公共数据的检索从而获得3个蛋白质点分别是α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)、γ-肌动蛋白(γ-actin)和过氧化物酶2(peroxiredoxin 2)。结论Hela细胞总蛋白质双向电泳的分离效果较好,肽质量指纹谱法能有效地对Hela细胞的蛋白质斑点进行鉴定。     

脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱的建立及分析

目的:建立脾肾虚型重症肌无力患者血清蛋白质双向电泳图谱,观察脾肾虚型重症肌无力患者与正常人血清蛋白质差异表达情况。方法:采用反复冻融法抽提血清蛋白质,以优化的双向电泳技术分离血清蛋白质,建立脾肾虚型重症肌无力患者与正常人血清蛋白质双向电泳图谱,并采用二维电泳图谱专用软件对所得结果进行图谱分析。采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法对两组间比较所得目标蛋白质点进行质谱鉴定。结果:通过双向电泳,建立血清蛋白质双向电泳图谱,选取具有明显差异的蛋白点21个进行质谱鉴定,共鉴定出8种蛋白质。结论:通过蛋白质组技术快速建立脾肾虚型重症肌无力患者血清蛋白表达图谱及质谱分析,可为进一步研究其发病机制及治疗手段提供实验基础。