反义寡核苷酸对人瘢痕疙瘩成纤维细胞结缔组织生长因子基因表达和胶原合成的作用

目的　研究结缔组织生长因子 (CTGF)在人瘢痕疙瘩发病机制中的作用。　方法　体外分离、培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞 (HKF)。在脂质体介导下 ,将异硫氰酸荧光素标记的硫代磷酸化CTGF反义寡核苷酸 (ASODN)转染至HKF中 ,设为CTGFASODN治疗组 (AT组 ) ,同时设脂质体对照组 (LC组 ,仅加入脂质体 )和空白对照组 (C组 ,不加脂质体和ASODN)。于荧光显微镜下观察CT GFASODN在各组细胞中的分布 ;通过逆转录聚合酶链式反应检测细胞中CTGFmRNA指数 (RI);采用3 H 脯氨酸掺入法检测细胞的胶原合成量。　结果　转染后 12h,AT组细胞胞浆内可见大量荧光 ,LC、C组HKF内无此现象。AT组转染后 4 8hRI值为 0 .12± 0 .6 2 ,明显低于LC组值 0 .5 1± 0 .18及C组值 0 .5 4± 0 .35 (P <0.0 1)。AT组的3 H 脯氨酸掺入率为 10 8.96± 79.0 5 ,较LC组值 171.2 4± 14 .99及C组值 16 5 .38± 4 3.6 1低 (P <0.0 1)。　 结论　CTGFASODN能够抑制体外培养的HKF中CTGF基因表达和胶原合成 ,表明CTGF在人瘢痕疙瘩纤维化进程中发挥了一定作用。     

CTGF反义寡核苷酸对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用

目的探讨结缔组织生长因子在人瘢痕疙瘩发病机制中的作用。方法在脂质体介导下,将异硫氰酸荧光素标记的结缔组织生长因子反义寡核苷酸转染至体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞中,通过MTT比色实验检测细胞增殖活力,通过流式细胞仪检测细胞凋亡,通过H3脯氨酸掺入法检测细胞胶原合成。结果转染后和对照组相比,反义寡核苷酸能够抑制细胞增殖及胶原合成,并促进细胞凋亡(P<001)。结论在体外,结缔组织生长因子反义寡核苷酸具有抗人瘢痕疙瘩纤维化的作用;结缔组织生长因子在人瘢痕疙瘩纤维化进程中具有促进作用。     

姜黄素体外抗人增生性瘢痕纤维化的实验研究

目的:观察姜黄素对体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞增殖及胶原合成的作用,以寻找治疗人增生性瘢痕的有效药物。方法:体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞,分别应用MTT比色法和3H-脯氨酸掺入法检测姜黄素作用后细胞增殖及胶原合成的变化。结果:和对照组相比,姜黄素能够显著抑制成纤维细胞增殖及胶原合成(P<0.05)。结论:姜黄素具有体外抗瘢痕纤维化的作用,可能成为治疗增生性瘢痕的有效药物。     

17—β雌二醇对增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成的影响

目的：研究雌激素对增生性瘢痕形成的影响。方法：对增生性瘢痕成纤维细胞（HSFB）进行体外培养,通过^3H-脯氨酸掺入法及人PCⅢ（hPCⅢ）放免试剂盒测定HSFB胶原合成含量。结果：17-β雌二醇（17-βE2）对HSFB胶原合成呈明显剂量依赖性促进（P＜0．01）;17-βE2对HSFB胶原合成的影响无明显性别差异（P＞0．05）。结论：雌激素可以促进增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成,而且无性别差异。     

粉防己碱对瘢痕成纤维细胞DNA和胶原合成的影响

目的探讨粉防己碱对瘢痕成纤维细胞DNA和胶原合成的影响.方法以体外培养的人瘢痕成纤维细胞为实验模型,将粉防己碱(5～80mg/L)加入细胞培养液中进行干预并与对照组比较,用3H-TdR掺入法和3H-脯氨酸掺入法分别测定各组瘢痕成纤维细胞3H-TdR掺入值与3H-脯氨酸掺入值,以反映其DNA和胶原合成水平的变化.结果粉防己碱预处理浓度由5mg/L升至80mg/L时(1)瘢痕成纤维细胞3H-TdR掺入值(min-1)由对照组的1740±165分别降至1162±226、412±82,抑制率达76.32%,组间差异有非常显著意义(P＜0.01);(2)瘢痕成纤维细胞3H-脯氨酸掺入值(min-1)由对照组的1126±193分别降至535±141、341±89,抑制率达69.71%,组间差异有非常显著意义(P＜0.01).结论粉防己碱对体外培养的瘢痕成纤维细胞DNA和胶原合成具有抑制作用,呈剂量依赖关系,具有防治增生性瘢痕的应用前景.     

反义结缔组织生长因子对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用

目的：研究结缔组织生长因子（CTGF）反义寡核苷酸（ASODN）对人瘢痕疙瘩成纤维细胞CTGFmRNA的表达和细胞增殖及胶原合成的影响,探讨瘢痕疙瘩的基因治疗。方法：体外分离、培养人正常皮肤成纤维细胞（NSF）和瘢痕疙瘩成纤维细胞（KF）,以脂质体介导方法将CTGFASODN转染KF中,用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法检测细胞中CTGFmRNA的表达;采用MTT方法测细胞增殖3;H-脯氨酸掺入法检测细胞的胶原合成量。结果：CTGFmRNA在NSF中几乎无表达,在KF中表达增高,CTGFASODN可以抑制其增殖和胶原合成（P〈0.05）。结论：CTGFASODN能够抑制成纤维细胞CTGFmRNA表达和细胞增殖及胶原合成,表明阻断CTGF可能是延缓瘢痕纤维化的有效手段。     

三羟基异黄酮对增生性瘢痕成纤维细胞增殖与胶原合成作用的影响

目的探讨5,7,4′-三羟基异黄酮对体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞增殖及胶原合成作用的影响。方法以不同浓度三羟基异黄酮处理体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞分为25、50、100μmol/L三组,以加DMSO溶剂为对照组,MTT法测定成纤维细胞的增殖,3H-脯氨酸掺入法测定细胞胶原合成情况,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达。结果三羟基异黄酮能有效抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖及胶原合成(P<0.05),且具有剂量-效应关系;100μmol/L浓度组作用后,与对照组相比,差异有显著意义(P<0.01);三羟基异黄酮作用后成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达显著下调(P<0.05)。结论三羟基异黄酮能抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖与活性,可能成为治疗瘢痕及纤维化疾病的有效药物。     

半边旗二萜类化合物5F对人病理性瘢痕成纤维细胞胶原合成的影响

目的研究5F对人病理性瘢痕成纤维细胞合成胶原的影响.方法将5F作用于体外培养的病理性瘢痕成纤维细胞,通过3H-脯氨酸掺入法、检测细胞上清液羟脯氨酸含量及人PCⅢ放免试剂盒测定成纤维细胞胶原合成含量.结果 5F可减少成纤维细胞3H-脯氨酸掺入量、细胞上清液胶原蛋白总量及Ⅲ型前胶原的含量.结论 5F在体外能明显抑制病理性瘢痕成纤维细胞胶原的合成.     

内皮素对瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成作用的实验研究

目的：探讨内皮素（ET）在瘢痕成纤维细胞增殖与胶原合成中的作用及一氧化氮（NO）、粉防已碱（Tet）的拮抗效应。方法：体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞，以^3H-TdR掺入法测定细胞增殖；以^3H-脯氨酸掺入量判断细胞胶原合成。结果：ET呈浓度依赖性促进瘢痕成纤维细胞增殖与胶原合成，随着ET浓度（2．5－100ng/ml）的增加，^3H-TdR掺入值较对照组分别增加了1．8、4．0和4．9倍；^3H－脯氨酸掺入值较对照组分别增加了1．1、3．1和3．8倍（P＜0．01）。用NO供体亚硝基乙酰青霉胺（S-nitroso-N-acetyl penicillamine,SNAP)50μg/ml单独处理成纤维细胞，对^3H-TdR掺入值无明显影响（与对照组相比，P＞0．05），但对^3H-脯氨酸掺入值有下调作用；SNAP可拮抗ET－1（25ng/ml）刺激细胞增殖作用（抑制率为22．89％，P＜0．05）；对ET－1的促胶原合成作用无明显影响（P＞0．05）。Tet在不抑制细胞DNA合成的药物浓度（3μg/ml）即可明显减少瘢痕成纤维细胞^3H-脯氨酸掺入值，并能显著降低由ET介导的瘢痕成纤维细胞^3H-TdR掺入值（抑制率为33．21％，P＜0．01）。结论：ET对体外培养的瘢痕成纤维细胞增殖与胶原合成具有显著促进作用，此效应可部分被SNAP、Tet所阻抗。     

体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成及结缔组织生长因子的表达

目的　探讨结缔组织生长因子在人增生性瘢痕发病机制中的作用。方法　体外培养人正常皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞 ,通过H3 脯氨酸掺入法检测细胞胶原合成 ,通过免疫细胞化学染色和逆转录聚合酶链反应检测细胞结缔组织生长因子蛋白质和mRNA的表达。结果　和正常皮肤成纤维细胞相比 ,增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成和结缔组织生长因子蛋白质及mRNA的表达均显著增高 (P <0 0 1)。结论　结缔组织生长因子可能在增生性瘢痕纤维化过程中发挥重要促进作用。     

培养的正常和瘢痕角质形成细胞上清液对瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

目的 研究培养的正常角质形成细胞、瘢痕角质形成的细胞的上清液对增生性瘢痕成纤维细胞生物活性和胶原合成的影响。方法 采用MTT、^3H-脯氨酸掺入法、Ⅲ型前胶原放免试剂盒测定不同来源、不同浓茺培养的角度形成细胞上清液，对增生性瘢痕成纤细胞增殖和胶原合成的影响。结果 正常角质形成细胞上清液，可抑制瘢痕成纤维细胞增殖，对细胞内胶原合成有一定的促进作用，但却抑制细胞内胶原向细胞外分泌。瘢痕角质形成细胞上清液，对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的抑制作用不明显，甚至还有促进的趋势，对细胞内外胶原合成、分泌皆有明显的促进作用。结论 正常角质形成细胞与瘢痕角质形成细胞分泌的物质对瘢痕成纤维细胞具有不同作用。     

维拉帕米对增生性瘢痕成纤维细胞的增殖及胶原合成的影响

目的 探讨钙通道阻滞剂维拉帕米治疗增生瘢痕的作用机理及进一步应用于临床的可能性。方法 采用组织块法进行增生性瘢痕成纤维细胞（HSFB）的体外培养;MTT比色法检测维拉帕米对HSFB生长增殖的 影响;^3H－脯氨酸掺入法及羟脯氨酸比色法测定维拉帕米对细胞胶原合成的影响;Northern Blot检测维拉帕米对HSFBⅠ、Ⅲ型前胶原基因表达的影响。结果 维拉帕米对HSFB的增殖、胶原合成及Ⅰ、Ⅲ型前胶原的基因表达均呈剂量依赖性抑制,以100μmol/L浓度组作用最为显著。结论 维拉帕米可以通过减少Ⅰ、Ⅲ型前胶原的基因表达等途径抑制瘢痕增生。     

人Ⅰ型前胶原基因反义寡核苷酸对人增生性瘢痕裸鼠移植模型胶原合成的作用

目的人Ⅰ型前胶原基因(ColⅠA1)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxyneucleotide,ASODN)对体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞有抑制胶原合成作用,拟进一步探讨ColⅠA1 ASODN对裸鼠移植模型体内的人增生性瘢痕的胶原合成作用。方法 SPF级BALB/c-nunu品系6～8周龄雌性裸鼠60只,体重约20 g;取行瘢痕切除手术患者自愿捐赠的瘢痕组织块去表皮后,移植至裸鼠背部肩胛内侧皮下,每只裸鼠移植1块,制备人增生性瘢痕裸鼠移植模型。将58只成功制备模型的裸鼠根据处理方法不同,随机分成3组,于瘢痕移植2周根据分组行经皮穿刺瘢痕内注射。A组(n=20):5μL浓度为3 mmol/L ColⅠA1 ASODN、3μL脂质体、92μL Opti-MEMⅠ减血清培养基;B组(n=20):3μL脂质体、97μL Opti-MEMⅠ减血清培养基;C组(n=18):100μL Opti-MEMⅠ减血清培养基。实验最初2周每天注射1次,之后隔天1次,至实验取材。注射后2、4、6周,对存活裸鼠进行瘢痕硬度测量后,处死裸鼠取瘢痕组织行胶原染色组织学观察以及透射电镜观察;提取细胞总RNA后行RT-...     

褪黑激素对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨褪黑激素对人增生性瘢痕Fb增殖和凋亡的影响与机制. 方法 采用组织块法分离培养人增生性瘢痕Fb.按随机数字表法将细胞分为低、中、高浓度组和对照组.前3组细胞分别采用含1 × 10-5、1×10-3、1 mmol/L褪黑激素的培养液培养,对照组不加褪黑激素常规培养.处理后24 h进行如下检测:对各组细胞进行形态学观察;用四氮唑复合物( XTT)-硫酸酚嗪甲酯(PMS)比色法检测细胞增殖活性;对细胞行膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(FITC)和碘化丙啶(PI)双染色后,用流式细胞仪分析细胞周期和凋亡情况;荧光定量RT-PCR法检测细胞周期蛋白E(cyclin E)、p53和Fas mRNA表达量.对数据行方差分析和LSD检验. 结果 形态学观察显示,对照组Fb为长梭形,呈集落分布;3个浓度组Fb随着褪黑激素浓度升高,细胞逐渐分散,胞体变形缩小,胞膜皱缩,核质比例减小.对照组、低浓度组、中浓度组、高浓度组Fb增殖活性(吸光度值)依次下降,分别为1.79±0.10、1.49±0.15、1.24±0.20、0.92±0.09(F=67.61,P ＜0.05);S期细胞百分比依次下降,分别为(16.9±1.3)％、(10.6±1.1)％、(6.1±1.2)％、(3.2±0.8)％(F=286.10,P ＜0.05);G2/M期细胞百分比依次下降,分别为(16.7±1.6)％、(13.5±1.1)％、(9.8±1.0)％(6.0±0.7)％(F=162.69,P＜0.05);早、晚期凋亡细胞百分比依次升高(F值分别为424.05、236.44,P值均小于0.05).对照组、低浓度组、中浓度组、高浓度组细胞cyclin E的mRNA表达量依次下降,分别为2.90±0.30、1.58±0.21、0.90±0.20、0.24±0.12(F=266.79,P＜0.05);p53和Fas mRNA表达量依次升高(F值分别为10.11、12.03,P值均小于0.05). 结论 褪黑激素可通过影响细胞cyclin E、p53和Fas基因的表达,抑制增生性瘢痕Fb增殖并诱导该细胞凋亡.     

整合素连接激酶对瘢痕成纤维细胞VEGF的调控作用

目的 探讨整合素连接激酶(intergrin-linked kinase,ILK)在人瘢痕成纤维细胞中的表达及对成纤维细胞VEGF的调控作用.方法 8例人增生性瘢痕标本采用组织块法分离培养瘢痕成纤维细胞,选取第5～6代细胞备用.实验分为3组①对照组:不做任何处理,只用含10%FCS的DMEM培养液同步培养;②空质粒组:用空质粒转染人瘢痕成纤维细胞;③ILK cDNA表达质粒转染组:用ILK cDNA表达质粒转染人瘢痕成纤维细胞.首先通过免疫细胞化学染色法检测ILKcDNA转染前后成纤维细胞ILK、VEGF的表达变化;应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)及Western blot检测成纤维细胞ILK、VEGF的mRNA和蛋白水平变化;最后采用酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测3组成纤维细胞上清液中的VEGF蛋白含量.结果 免疫细胞化学染色结果显示瘢痕成纤维细胞胞浆中ILK表达阳性,VEGF表达不明显,经ILK cDNA转染细胞后ILK与VEGF表达均增强;RT-PCR显示ILK cDNA转染组VEGF mRNA表达(0.338±0.060)均高于对照组(0.022±0.001)和空质粒组(0.028±0.005,P＜0.05);Western blot结果显示ILK cDNA转染组VEGF蛋白表达(0.819±0.019)显著高于对照组(0.607±0.033)和空质粒组(0.591±0.024,P＜0.05);ELISA法检测ILK cDNA转染组的VEGF蛋白含量高于其他两组(P＜0.05).结论 ILK可以上调VEGF mRNA及蛋白水平,并且促进成纤维细胞分泌VEGF,ILK可能通过提高瘢痕成纤维细胞合成分泌VEGF而促进增生性瘢痕血管生成.

Abstract：

Objective To explore the expression of intergrin-linked kinase (ILK) and its effect on VEGF expression in fibroblasts from human hypertrophic scar. Methods Fibroblasts were isolated from hypertrophic scar of 8 patients and cultured in vitro. Then the cells were divided into three groups: ① Cells were cultured only in DMEM containing 10% FCS in the control group; ② Cells were transfected with empty plasmid in the empty plasmid group; ③ Cells were transfected with plasmid experessing ILKcDNA in the ILK cDNA plasmid transfection group. First, the expression of ILK and VECF was observed by immunocytochemistry before and after ILK cDNA transfection. Second, ILK and VEGF mRNA expression was investigated by real-time PCR ( RT-PCR). Third, the protein expression of ILK and VEGF was detected by Western blot. Finally, the protein level of VEGF in supernatant of fibroblasts was measured by ELISA. Results Before ILK cDNA transfection, the expression of ILK was positive and the VEGF expression was weak in cytoplasm of fibroblasts . After ILK cDNA transfection, both the expression of ILK and VEGF was enhanced. The level of VEGF mRNA was significantly higher in ILK cDNA transfection group (0.338 ±0.060) than that in control group (0.022 ±0.001) and empty plasmid group (0.028 ± 0. 005 , P ±0. 05 ). The level of VEGF protein was significantly higher in ILK cDNA transfection group (0. 819 ±0. 019) than that in control group (0. 607 ±0. 033) and empty plasmid group (0. 591 ±0. 024, P ＜0. 05). Secretion of VEGF increased remarkably in ILK cDNA transfection group comparing with the other two groups (P＜0. 05). Conclusions ILK could up-regulate the VEGF mRNA and protein level in human scar fibroblasts. It may play an important role in the angiogenesis in hypertrophic scar.     

90Sr治疗增生性瘢痕的基础与临床研究

目的 探讨90Sr防治瘢痕增生的作用机制并观察临床疗效. 方法 用90Sr敷贴器按照0、5、10,15 Gy剂量照射体外培养的人增生性瘢痕Fb.照射后24、48、72 h,流式细胞仪测定细胞周期及凋亡率变化,ELISA法检测细胞培养上清液中Ⅰ型腔原浓度.评价348例增生性瘢痕患者、40例瘢痕疙瘩患者及114例外科手术后瘢痕预防患者应用90Sr照射治疗的效果,并经HE染色对比正常皮肤组织、增生性瘢痕组织、经90SR照射治疗的增生性瘢痕组织中Fb数目.对数据进行单因素方差分析和q检验. 结果 (1)剂量为10、15 Gy的90Sr照射后24、48 h,细胞凋亡率呈逐渐上升趋势,至照射后72 h两者凋亡率相近.剂量为5 Gy的90Sr照射后48 h细胞凋亡率明显高于照射后24 h,但照射后72 h细胞凋亡率迅速下降,与剂量为10、15 Gy时比较差异均有统计学意义(F值均为916.711,P值均小于0.01).(2)照射后24h,90Sr照射剂量为5、10 Gy时,细胞各周期的百分比相近;90Sr照射剂量为15 Gy时,S期细胞明显增多[(48.1±1.0)％,F值均为200.277,P值均小于0.01].剂量为10 Gy及15 Gy的90Sr照射后72 h,细胞明显阻滞在S期,S期细胞百分比分别为(85.7±5.2)％、(73.0±8.4)％,与照射剂量为0 Gy和5 Gy时比较差异均有统计学意义(F值均为111.105,P值均小于0.01).(3)同一照射时相点下,照射剂量越大,Ⅰ型胶原浓度越低(F值为5044.449～8234.423,P值均小于0.01).同一照射剂量下,随着时间推移,Ⅰ型胶原浓度有不同程度的增加(F值为333.395～2973.730,P值均小于0.01).(4)临床病例观察显示,90Sr照射病理性瘢痕或术后瘢痕预防患者后,显效率及有效率累计88.45％.HE染色显示,90Sr照射治疗的人增生性瘢痕Fb数目[每200倍视野(86±20)个]少于未经照射治疗者[每200倍视野(198±65)个,F=208.405,P＜0.05]. 结论 90Sr抑制瘢痕的生长是其对瘢痕Fb和ECM共同作用的结果,且临床疗效显著.     

结缔组织生长因子介导转化生长因子β1促进瘢痕成纤维细胞转分化的研究

目的 了解结缔组织生长因子(CTGF)介导TGF-β1发挥促人增生性瘢痕Fb(HSFb)转分化的作用.方法 体外培养人HSFb,取5份细胞标本分别加入不同浓度TGF-β1(0、2.5、5.0、7.5、10.0 ng/mL),作用48 h后待测.余下标本分为:空白对照组;CTGF刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人CTGF;TGF-β1刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1;CTGF反义寡脱氧核苷酸(ASODN)转染组,细胞转染CTGF ASODN后,加入培养液;CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组,细胞转染CTGF ASODN后2 h,加人含终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1的培养液.蛋白质印迹法分析不同浓度TGF-β1刺激对细胞CTGF表达的影响,比较各组α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化;流式细胞仪检测α-SMA阳性细胞百分率.结果 TGF-β1浓度为10.0 ng/mL时,CTGF的表达明显高于未受刺激的细胞(P<0.05).CTGF刺激组与TGF-β1刺激组α-SMA表达明显高于空白对照组(P<0.01).CTGF ASODN转染组以及CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组α-SMA表达与空白对照组接近(P>0.05).上述各组细胞α-SMA阳性细胞百分率依次为(10.8±2.8)%、(29.1±4.0)%、(28.7±4.8)%、(10.7±2.3)%、(14.3±2.9)%,统计学分析结果类似于α-SMA表达.结论 CTGF是TGF-β1发挥促人HSFb转分化的重要下游效应分子之一.