胡芦巴对Caco-2细胞胆固醇载体基因表达的影响

目的研究胡芦巴对小肠主要胆固醇载体ABCG5/G8、ABCA1、SR-B1和NPC1L1在Caco-2细胞基因表达的影响,探讨其降脂机制。方法将胡芦巴水溶液暴露于Caco-2细胞中24和48h作为治疗组,未加药者为对照组,从细胞中分离mRNA,进行Real-Time PCR分析,以GAPDH为内部标准测定ABCG5/G8,ABCA1和NPC1L1基因的表达。结果胡芦巴可以抑制胆固醇载体ABCG5（90%）/G8（80%）、ABCA1（70%）、SR-B1（70%）和NPC1L1（70%）表达。结论胡芦巴可抑制Caco-2细胞胆固醇载体的基因表达水平。     

广西汉族人群 NPC1L1基因1735 C>G 多态性分布特征及与血脂、肥胖的关系?

目的：分析 NPC1L1基因1735 C>G 多态性分布特征及其与血脂、肥胖的关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,对409例汉族人群进行 NPC1L1基因多态性分型,比较不同基因型间血脂水平、BMI 的差异。结果CC,CG,GG 基因型的分布频率分别为39.40%、46.00%、14.60%;等位基因 C 和 G 频率分别为62.35%和37.65%。3种基因型组间的 LDL-C、ApoB 水平和 BMI 的差异有统计学意义(P <0.05),G 等位基因携带者(GC/GG 基因型)较 CC 型有更高的 LDL-C、ApoB 水平(P <0.05)。血脂谱和 BMI 与多种环境因素相关。结论NPC1L1基因1735 C>G 多态性与血脂水平和 BMI 相关,G 等位基因可能是高 LDL-C 水平和肥胖的一个危险因素。     

胆固醇转运相关基因NPC1、NPC2调节造血前体细胞的增殖和分化

目的 采用NPC1、NPC2基因敲低的造血前体细胞(erythroid myeloid lymphoid,EML)作为模型,探讨NPC1、NPC2对EML细胞增殖、分化的影响.方法 通过NPC1 shRNA、NPC2 shRNA重组慢病毒感染EML细胞获得NPC1、NPC2基因有效沉默的EML细胞模型.利用该模型以Filipin染色检测NPC1、NPC2基因敲低后对EML细胞内胆固醇分布的影响,采用CCK-8和台盼蓝染色检测细胞增殖,采用流式细胞仪检测NPC1、NPC2基因沉默后EML细胞干性标志物CD34、sca-1、c-kit及TER-119、CD11b、B220的变化,采用Western blot检测造血干细胞因子(stem cell factor,SCF)刺激细胞后c-kit磷酸化的改变.结果 成功构建NPC1、NPC2基因沉默的EML细胞模型,NPC1、NPC2基因在mRNA和蛋白表达均显著降低(P＜0.01).NPC1、NPC2敲低的EML细胞中出现胆固醇蓄积,且在NPC1敲低的EML细胞模型中胆固醇蓄积更显著.沉默NPC1、NPC2基因后使得EML细胞增殖减慢(P＜0.01),并且能够降低EML细胞CD34、sca-1和TER-119、B220的阳性率(P＜0.01).经SCF刺激后NPC1基因沉默的EML细胞中c-kit的磷酸化降低显著(P＜0.01),但在NPC2基因沉默的EML细胞中c-kit磷酸化的改变差异无统计学意义.结论 胆固醇转运相关基因NPC1通过调节细胞胆固醇流动参与了EML细胞的增殖和分化调控.     

高锌对Caco-2细胞铁、锌含量及其调控基因mRNA表达的影响

目的:探讨高锌对小肠细胞铁、锌含量和铁、锌调控基因DMT1、IREG1、ZnT1及hZIP4 mRNA表达的影响.方法:以Caco-2细胞为小肠细胞体外模型,以锌浓度分别为4、50、100、 200 μmol/L的培养液培养24 h,用原子吸收分光光度计检测细胞内铁、锌含量,用RT-PCR方法检测DMT1、IREG1、ZnT1及hZIP4 mRNA表达,以GAPDH mRNA水平作为内参照.结果:高锌处理24 h后Caco-2细胞内锌含量升高,培养基锌浓度为50 μmol/L时达到高峰,而细胞内铁含量却随培养基锌浓度升高而降低.细胞内DMT1、IREG1、ZnT1 mRNA表达均出现上调,hZIP4 mRNA表达则发生下调.结论:补锌可以提高小肠细胞内锌含量,但会使细胞内铁含量下降.铁和锌在小肠中的吸收可能相互影响.     

食管癌细胞中沉默Survivin基因对ATG16L1表达的影响

目的 探讨食管癌Eca109细胞中沉默生存素(Survivin, SVV)基因的表达对自噬相关蛋白ATG16L1表达的影响。方法 使用雷帕霉素(rapamycin, RAPA)在Eca109细胞中诱导建立自噬模型;使用Survivin抑制剂YM155和Survivin-siRNA作用于自噬模型,采用免疫荧光法观察自噬体数量变化,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)检测Survivin和ATG16L1的mRNA表达水平,Western blot法检测LC3-Ⅱ、p62、Survivin、ATG16L1的蛋白表达水平,双荧光素酶报告基因检测Survivin与p62的作用关系。结果 RAPA诱导Eca109细胞后,自噬标志蛋白LC3-Ⅱ蛋白的表达水平升高,p62蛋白的表达水平降低,同时细胞内自噬体数目增多。在RAPA组中ATG16L1mRNA和蛋白表达水平均升高。在细胞自噬模型中沉默Survivin表达后,Survivin和ATG16L1的mRNA表达水平均降低。过表达Survivi...     

利用CRISPR/Cas9技术体内标记示踪小鼠内源性NPC1L1蛋白

目的:对小鼠内源性NPC1L1蛋白进行标记和示踪,为研究体内胆固醇的吸收机制提供新的技术手段。方法:利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,针对小鼠NPC1L1基因的3′末端非编码区,设计不同sgRNA,利用细胞内的荧光素酶法,检测分析其Cas9/sgRNA核酸酶活性,筛选出高活性的sgRNA序列,经体外转录制备sgRNA和Cas9 mRNA。PCR扩增基因打靶的两侧同源臂,与FLAG-EGFP的编码cDNA一起克隆至打靶载体。经酶切和测序鉴定正确的打靶载体DNA与sgRNA、Cas9 mRNA一起显微注射入小鼠受精卵,移植至假孕小鼠体内自然发育;通过基因组DNA 的PCR和Southern 印迹分析,筛选、鉴定重组正确且无随机插入的子代小鼠。制备小肠组织冰冻切片,荧光显微镜下观察NPC1L1-EGFP的表达分布。结果:成功构建了NPC1L1基因敲入打靶载体,筛选了高活性的sgRNA,利用CRISPR/Cas9技术获得了对内源性NPC1L1蛋白C端进行FLAG和EGFP双重标记的子代小鼠,荧光显微镜下观察到该融合蛋白分布于小肠绒毛上皮细胞的刷状缘,与NPC1L1的分布特征一致。结论:成功实现了对小鼠内源性NPC1L1蛋白进行体内标记,为研究NPC1L1囊泡转运和胆固醇吸收机制提供了有效手段。     

细胞黏附分子L1基因沉默对胰腺癌细胞Capan-2神经侵袭能力的影响

目的 观察沉默细胞黏附分子L1基因(L1CAM)表达后对胰腺癌Capan-2细胞体外神经侵袭能力的影响.方法 应用慢病毒介导的L1CAM-shRNA干扰载体转染胰腺癌Capan-2细胞,以L1CAM-NC转染细胞为对照.分别将L1CAM-shRNA组及L1CAM-NC组细胞与大鼠背根神经节(DRG)、基质胶(matrigel)一起构成共培养神经侵袭模型,倒置显微镜下观察神经突及细胞生长情况并拍照,利用Image pro plus图像分析软件对照片进行分析.结果 共培养模型中,L1CAM-NC对照组细胞向DRG方向不断迁移增殖,包绕神经突起并沿之向DRG爬行,而L1CAM-shRNA组中并未观察到该现象.共培养第3天和第5天时,L1CAM-NC对照组细胞集落面积显著高于L1CAM-shRNA组(P＜0.01),但两组的神经突生长差异无统计学意义.结论 干扰L1CAM的表达可能通过抑制细胞集落形成及迁移爬行的方式抑制胰腺癌Capan-2细胞的神经侵袭作用.     

RT-PCR检测R2L1细胞中Trk受体家族基因的表达

在Trk受体家族基因的非同源区中分别设计对TrkA，TrkB和TrkC受体基因特异的引物，采用RT－PCR法检测大鼠小脑神经细胞系R2和转染并表达了神经营养因子低亲和力受体p75NTR的R2细胞系R2L1细胞中Trk受体家族基因的表达，琼脂糖凝胶电泳分析RT－PCR产物表明，TrkA和TrkB受体基因在R1和R2L1细胞中均有表达，而无TrkC受体基因的表达。测序结果进一步证实了RT－PCR的结果，表明本方法能准确地检测Trk受体家庭基因的表达。     

干扰MAD2L1基因表达对乳腺癌细胞凋亡的影响及机制

目的 探讨干扰有丝分裂阻滞缺陷2样蛋白1(MAD2L1)基因表达对乳腺癌(BC)细胞凋亡的影响及其机制。方法 采用qRT-PCR检测正常乳腺上皮细胞系MCF-10A和4种BC细胞系(MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3和BT-20)中MAD2L1 mRNA表达水平。将MAD2L1 siRNA转染至MDA-MB-231细胞中,qRT-PCR和Western blotting检测细胞中MAD2L1 mRNA和蛋白表达水平;MTT检测细胞增殖能力;流式细胞术法检测细胞凋亡率;Western blotting检测细胞中Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3、p-p38MAPK(Thr180/Thr182)和p38MAPK等蛋白表达水平。采用p38MAPK抑制剂SB203580联合处理上述细胞,Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡率的变化;Western blotting检测Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3、p-p38MAPK和p38MAPK表达水平的变化。结果 BC细胞系中MAD2L1 mRNA表达水平高于MCF-10A细胞,其中M...     

BCSC-1基因异位表达致鼻咽癌细胞CNE-2L2黏附性增强及细胞周期阻滞

目的探讨BCSC-1基因异位表达导致人鼻咽癌细胞CNE-2L2恶性行为减弱的机制。方法采用碘化丙啶染色DNA,流式细胞法检测细胞周期;Hoechest33258染色分析细胞分裂情况;细胞聚集实验检测细胞的黏附性;Western印迹分别检测E-钙黏蛋白、α-catenin和p53的表达。结果细胞周期分析显示异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞、野生型CNE-2L2细胞和转染空载体的CNE-2L2细胞分别有55.1%、43.4%和39.4%处于G0/G1期,分别有25.2%、28.7%和30.9%处于S期,分别有19.7%、27.9%和29.7%处于G2/M期。野生型CNE-2L2细胞和转染空载体的CNE-2L2细胞有较多细胞处于有丝分裂相,异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞几乎见不到有丝分裂相。异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞的黏附性和E-钙黏蛋白、α-catenin及p53的表达水平均高于野生型CNE-2L2细胞和转染空载体的CNE-2L2细胞。结论异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞的黏附性增强可能与E-钙黏蛋白和α-catenin表达增强相关;异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞阻滞于G1期可能与p53表达增加相关。这些变化可能在细胞恶性行为减弱中发挥作用。     

P53mRNA、Fas mRNA、Bcl-2与鼻咽癌放射敏感性异质性的关系

目的：探讨鼻咽癌放射敏感性异质性与P53 mRNA、Fas mRNA、Bcl-2的相关性。方法：用RT-PCR检测人鼻咽癌细胞系CNE-2Z亚克隆株H5和S1的P53 mRNA、Fas mRNA表达;用Western-blot检测两鼻咽癌亚克隆株的Bcl-2蛋白表达。结果：两鼻咽癌亚克隆株Fas mRNA、P53 mRNA的表达与鼻咽癌放射敏感性异质性相关性不明显;两鼻咽癌亚克隆株Bcl-2蛋白的表达与鼻咽癌放射敏感性异质性呈负相关。结论：53 mRNA、Fas mRNA的表达对鼻咽癌放射敏感性没有预见性,而Bcl-2与其异质性机理有关。     

E1B缺陷腺病毒dl1520联合化疗药物DDP体外对鼻咽癌细胞杀伤及诱导凋亡作用

目的探讨E1B-55KDa缺陷腺病毒dl1520与DDP联合体外对鼻咽癌细胞的杀伤及诱导凋亡作用。方法采用MTT法体外测定细胞生长抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果MOI(感染复数)=0.032、0.16、0.8、4、20、100时dl1520对CNE-2细胞的生长抑制率分别为2.78%、7.41%、10.19%、24.07%、45.37%、67.59%,而dl1520+DDP的抑制率分别为29.63%、32.41%、40.74%、52.78%、66.67%、74.07%,P<0.01;1.5μg/mlDDP24h诱导CNE-2细胞凋亡的比例为1.7%,dl1520在MOI=0.1、1、10、100时诱导的凋亡比例分别为1.2%、1.3%、14.1%、2.7%,而当dl1520与DDP联合后诱导的凋亡比例分别为1.8%、3%、18%、3.2%。结论dl1520与DDP联合可显著增强DDP对CNE-2细胞的杀伤及诱导细胞凋亡作用。     

三苯氧胺和雌激素对MCF-7乳癌细胞内耐药基因mdr-1mRNA的影响

目的 观察三苯氧胺（ａｍｏｘｉｆｅｎ,ＴＡＭ）及雌激素（Ｅ２）对乳腺癌ＭＣＦ－７细胞株耐药基因ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ水平的影响：方法 应用ＲＴ－ＰＣＲ法观察ＴＡＭ及Ｅ２在不同时间、浓度作用下细胞内ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ水平的变化;结果ＴＡＭ可以使细胞内ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ水平降低,而Ｅ２则相反。且以上变化表现出剂量、时间依赖关系。结论 ＴＡＭ通过降低ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ水平,使肿瘤细胞的耐药性降低,有利于抗肿     

生存素下调多药耐药蛋白增强人鼻咽癌细胞株对紫杉醇敏感性的研究

目的 研究生存素（Survivin）下调多药耐药蛋白（MRP）的表达与鼻咽癌紫杉醇（PTX）耐药性关系,探讨鼻咽癌PTX耐药的分子机制.方法 采用免疫组化检测Survivin和MRP在42例鼻咽癌PTX耐药患者与24例PTX非耐药患者中的表达;采用浓度递增法持续诱导建立鼻咽癌化疗耐药细胞株5-8F-PTX（＋）,绘制细胞生长曲线,测定细胞生长的倍增时间,检测肿瘤细胞的周期分布;采用siRNA技术干扰5-8F-PTX（＋）中Survivin的表达后,Western blot法检测Survivin和MRP表达变化,MTT检测不同抗肿瘤药物PTX、顺铂（cDDP）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、长春新碱（VCR）耐药敏感性的变化.结果 Survivin在鼻咽癌化疗耐药患者中阳性表达率为83.3％,明显高于非耐药患者（41.7％）,差异有高度统计学意义（P＜0.01）;MRP在鼻咽癌PTX耐药患者中表达阳性率为88.1％,明显高于非耐药患者（37.5％）,差异有高度统计学意义（P＜0.01）.5-8F-PTX（＋）较5-8F的细胞生长速度明显减慢,5-8F-PTX（＋）细胞生长的倍增时间为21h,亲本5-8F细胞生长的倍增时间为15 h;5-8F-PTX（＋）的G2/M期细胞百分比[（23.1±1.3）％]显著高于亲本5-8F细胞[（13.5±0.9）％];Survivin和MRP在PTX耐药细胞株5-8F-PTX（＋）细胞株中的表达水平明显高于非耐药的5-8F,siRNA干扰5-8F-PTX（＋）中Survivin的表达后,Survivin和MRP表达明显下调,PTX、cDDP、5-FU、VCR耐在siRNA-5-8F-PTX（＋）中的IC50值不同程度地下降.结论 Survivin可通过下调MRP的表达增强鼻咽癌细胞对PTX的敏感性.     

中医引经药葛根对食管癌细胞系TE-1及ECA109AQP1mRNA表达的影响

目的 探讨中医引经药葛根对食管癌细胞系TE-1及ECA109 AQP1 mRNA表达的影响.方法 以5 g/L及10 g/L的葛根素注射液干预食管癌细胞系TE-1及ECA109,干预24 h后用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测AQP1 mRNA表达,观察表达结果.结果 AQP1在食管癌细胞系ECA109及TE-1中均有少量表达;葛根素可上调ECA109及TE-1细胞系AQP1表达.结论 葛根素通过上调AQP1 mRNA的表达,从而影响食管癌细胞水转运.     

HPV 16L1基因的原核表达及表达条件的优化

目的:构建HPV 16L1基因的原核表达质粒,并优化其表达条件.方法:根据GeneBank中的HPV序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有HPV全长基因片段重组质粒为模板,经PCR扩增出1 500 bp 的DNA片段.将所得片段与pGEX-KG 载体连接,转化JM109大肠杆菌,筛选阳性克隆.其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-HPV16L1已构建成功.提取pGEX-KG-HPV16L1质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG 诱导后收集菌体,进行SDS-PAGE,Western Blot鉴定.结果:在大肠杆菌中获得HPV16L1基因融合表达,融合蛋白的相对分子量为83kDa;表达的蛋白能与抗HPV 16L1抗体发生特异性反应.结论:HPV 16L1基因在大肠杆菌中获得高效表达,为HPV16L1疫苗的研制奠定了基础.     

浅析血管重塑机制及中医药防治高血压病

目的研究耐药性癫痫患者颞叶和海马组织中Nurr1基因及其蛋白产物的表达,探讨其在耐药性癫痫形成中的作用。方法用RT-PCR和免疫组化联合检测40例耐药性癫痫患者(实验组)脑组织中Nurr1基因及蛋白产物的表达,并与11例对照组比较。结果 RT-PCR结果显示Nurr1mRNA水平在耐药性癫痫患者脑组织中表达较对照组增高,Nurr1/GAPDH(内参基因)灰度值在耐药性癫痫患者脑组织中为6.18,对照组为2.39(P<0.05)。免疫组化与RT-PCR结果一致,显示耐药性癫痫颞叶和海马Nurr1蛋白表达水平高于对照组(P<0.05)。结论 Nurr1基因及其蛋白产物在耐药性癫痫患者脑内表达明显增加,提示其可能参与了耐药性癫痫的发生与发展。     

胶质瘤中膜型基质金属蛋白酶1mRNA水平表达

目的 探讨胶质瘤恶性程度和膜型基质金属蛋白酶1(MT1-MMP)mRNA表达水平的关系,为胶质瘤的诊断、治疗及预后等提供参考.方法 分别采用实时荧光定量逆转录PCR法(RT-PCR)和半定量RT-PCR法检测34例胶质瘤和7例正常脑组织中MT1-MMPmRNA的表达水平.结果 实时荧光定量RT-PCR法检测正常脑组织和Ⅱ级(低级别)、Ⅲ级、Ⅳ级、高级别(Ⅲ、Ⅳ级)胶质瘤的△△Ct值分别为0.834±0.517,4.063±2.309,6.376±4.023,7.653±4.196和7.072±4.072.半定量RT-PCR法测定结果显示,正常脑组织和Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级、高级别胶质瘤的相对灰度值分别为0.799±0.156,1.142±0.158,1.538±0.482,1.652±0.376和1.600±0.421.正常脑组织和Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤之间,Ⅱ、Ⅳ级胶质瘤之间,正常脑组织和低、高级别胶质瘤之间,低、高级别胶质瘤之间MT1-MMP基因mRNA表达水平均有显著性差异.结论 胶质瘤中存在MT1-MMP基因mRNA高水平的表达,随着肿瘤恶性程度的增加,MT1-MMP基因mRNA的表达水平增高.